黃瓜DnaJ基因家族鑒定及對高溫脅迫的表達響應(yīng)

宋蒙飛,王星,張開京,陳勁楓,婁群峰

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室/園藝學(xué)院,江蘇 南京 210095)

DnaJ蛋白(又稱J蛋白)是一類保守的輔伴蛋白家族,因包含1個標(biāo)志性高保守的J結(jié)構(gòu)域而得名,在生物體內(nèi)作為熱激蛋白(HSP70)的輔伴分子而存在[1]。而HSP70是生物在高溫環(huán)境下合成的一組蛋白質(zhì),存在于從細菌到人類的活生物體中,是生物響應(yīng)高溫脅迫的主要因子[2]。作為HSP70的輔伴侶分子,DnaJ蛋白在脅迫條件下能促進HSP70的ATP酶活性,并參與維持細胞內(nèi)蛋白的折疊、復(fù)合物解聚等多種生命活動進程,在生命體抵抗和適應(yīng)逆境脅迫方面發(fā)揮著重要作用[3]。

DnaJ蛋白通常情況下包含4個保守的結(jié)構(gòu)域:N端J結(jié)構(gòu)域、甘氨酸/丙氨酸結(jié)構(gòu)域、含4個CxxCXGXG重復(fù)基序的鋅指結(jié)構(gòu)域和C末端結(jié)構(gòu)域,DnaJ蛋白可根據(jù)其含有的結(jié)構(gòu)域差異分為不同亞型(常見為3種類型)[4]。DnaJ蛋白廣泛存在于生命體內(nèi)不同部位,并因其在細胞內(nèi)定位的不同而具有不同的功能,例如在擬南芥中已鑒定的120個DnaJ蛋白亞細胞分別定位于線粒體、葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞核和質(zhì)膜上[5]。目前研究最多的為定位于葉綠體的DnaJ蛋白,其在葉綠體中可參與PS Ⅱ光合系統(tǒng)組裝或修復(fù)、類囊體膜建成、葉綠體分裂發(fā)育、葉綠體轉(zhuǎn)錄、蛋白轉(zhuǎn)運等過程[6-8]。DnaJ蛋白另一重要功能是能夠參與植物脅迫響應(yīng)進程,已有報道表明DnaJ蛋白在植物抗旱、抗高溫、抗冷、抗鹽以及抗病方面均發(fā)揮重要作用[3]。

高溫容易造成植物體內(nèi)酶系統(tǒng)紊亂、細胞膜系統(tǒng)破壞、各組分改變等一系列生理生化變化,從而影響光合及呼吸作用,改變植物的源庫關(guān)系,使作物的生長發(fā)育受到嚴(yán)重的影響,最終造成減收、減產(chǎn)等一系列問題[9-10]。黃瓜(CucumissativusL.)是重要的瓜類蔬菜作物之一,適宜生長溫度為16～26 ℃,屬喜溫作物,但不耐熱[11]。目前在設(shè)施栽培或者南方地區(qū)露地栽培中,高溫已成為設(shè)施黃瓜栽培生產(chǎn)的主要障礙[12]。在黃瓜苗期、營養(yǎng)生長期、初花期、結(jié)果期遇到高溫環(huán)境會影響黃瓜正常生長發(fā)育,降低黃瓜產(chǎn)量和品質(zhì),最終導(dǎo)致商品性降低[13-15]。高溫脅迫已經(jīng)給黃瓜生產(chǎn)帶來了巨大的損失,是我國黃瓜生產(chǎn)中急需解決的問題之一。目前關(guān)于黃瓜耐熱性的研究主要集中在分子標(biāo)記的開發(fā)上,研究者利用黃瓜耐熱及不耐熱材料通過連鎖性分析鑒定了多個與耐高溫相關(guān)的QTL位點及連鎖標(biāo)記[16],但是關(guān)于黃瓜耐高溫相關(guān)基因家族的分析尚未見報道。

目前在擬南芥、水稻、棉花中均有關(guān)于DnaJ基因家族的研究報道[5,17-18]。但是,在黃瓜中關(guān)于DnaJ基因家族的研究尚未見報道。本研究基于已公布的黃瓜基因組信息對黃瓜DnaJ基因家族進行全基因組解析,注釋該基因家族包括基因組成、結(jié)構(gòu)、染色體分布和系統(tǒng)發(fā)育分析等信息,同時,通過公共數(shù)據(jù)庫、RNA-seq數(shù)據(jù)、實時定量PCR分析DnaJ基因的表達模式,并探討其在植物響應(yīng)高溫環(huán)境脅迫中的功能,旨在為探明黃瓜響應(yīng)高溫脅迫應(yīng)答機制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 黃瓜DnaJ基因家族全基因組鑒定

首先,從葫蘆科作物基因組數(shù)據(jù)庫(http://cucurbitgenomics.org/)下載黃瓜‘9930’參考基因組相關(guān)信息文件(包括基因組序列、基因編碼序列、蛋白序列)[19],從pfam數(shù)據(jù)庫數(shù)(http://pfam.xfam.org/)下載DnaJ蛋白HMM(隱馬爾可夫模型)種子文件(編號:PF00226)[20]。其次,參考崔夢杰等[21]的方法,以種子文件為模板,通過HMMER 3.1軟件的hmmsearch功能搜索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,參數(shù)設(shè)為默認值。以初次篩選得到的黃瓜DnaJ蛋白序列為模板,通過clusterW軟件將這些序列進行多序列對比,利用HMMER 3.1軟件中hmmbuild功能將對比結(jié)果建立黃瓜DnaJ蛋白特異hmm模型。最后,通過hmmsearch功能以黃瓜DnaJ蛋白特異hmm模型為模板再次搜索黃瓜蛋白數(shù)據(jù)庫,所得結(jié)果通過NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)檢查蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域后[22],手動篩除不含DnaJ特異J結(jié)構(gòu)域核心區(qū)序列(組氨酸/脯氨酸/天冬氨酸,即His/Pro/Asp,HPD結(jié)構(gòu))的蛋白編號,最終得到黃瓜DnaJ蛋白家族基因。

1.2 黃瓜DnaJ基因家族染色體位置、蛋白特性及結(jié)構(gòu)分析

黃瓜DnaJ基因家族染色體位置信息通過葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫Browser功能獲得,并通過Circos軟件(http://circos.ca/)表現(xiàn)為圖形模式;以基因名稱搜索黃瓜基因組文件得到DnaJ基因家族蛋白全長序列,通過序列分析工具在線軟件(http://www.detaibio.com/sms2/protein_mw.html)計算蛋白相對分子質(zhì)量、等電點(PI值);利用在線軟件WOLF PRORT(https://www.genscript.com/wolf-psort.html?src=leftbar)預(yù)測蛋白亞細胞定位;使用MEME在線軟件(http://meme-suite.org/tools/meme)分析蛋白motif特征[23],motif搜索個數(shù)為10,其他參數(shù)默認,通過TBtools展示分析結(jié)果。

1.3 黃瓜DnaJ基因家族進化及復(fù)制模式分析

參考Miernyk[5]的方法獲得擬南芥DnaJ基因家族信息,并在擬南芥數(shù)據(jù)庫下載擬南芥DnaJ基因家族蛋白序列。將黃瓜及擬南芥DnaJ基因家族J蛋白結(jié)構(gòu)域序列通過Neighbor-joining進行聚類分析,使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[24],Bootstrap值設(shè)置為1 000。通過在線軟件EvolView(https://www.evolgenius.info/evolview/)進行圖形調(diào)整。以黃瓜DnaJ基因家族蛋白序列為模板,通過MCScanX軟件進行基因組內(nèi)復(fù)制事件鑒定[25],并通過Circos軟件表現(xiàn)為圖形模式。

1.4 黃瓜DnaJ基因家族表達分析

在NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫中下載黃瓜基因在各組織的表達水平原始數(shù)據(jù)[26],通過salmon軟件計算黃瓜基因表達量[27],根據(jù)基因名稱獲得黃瓜DnaJ基因家族在黃瓜各組織表達量,通過Heml軟件繪制熱圖。

以華北密刺型黃瓜自交系品種‘長春密刺’為試驗材料,于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)黃瓜幼苗至5～6片真葉期,對其進行高溫脅迫處理。高溫處理:晝/夜時間為16 h/8 h,溫度為42 ℃/32 ℃;對照:晝/夜時間為 16 h/8 h,溫度為28 ℃/24 ℃。分別于0、6、12、24、48 h時取黃瓜葉片,液氮速凍后保存于-80 ℃,每個處理3個重復(fù)。利用RNA提取試劑盒(TaKaRa)提取植物葉片總RNA,利用Prime ScriptTMRT Reagent試劑盒(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,使用SYBRPremixExTaqTM試劑盒(TaKaRa)進行熒光定量反應(yīng)?？紤]到具有高度相似性核心結(jié)構(gòu)的基因可能具有相同的調(diào)控功能,因此分別在黃瓜DnaJ基因家族各亞簇組別中隨機挑選1個基因(共9個基因),參考其編碼RNA序列設(shè)計定量PCR引物,并檢測基因在各處理中的相對表達量。定量PCR體系、反應(yīng)程序及計算方法采用Song等[28]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜DnaJ基因家族鑒定及蛋白序列信息分析

以PF00226的HMM文件為索引,對黃瓜基因組進行DnaJ基因篩選,在去除冗余基因后,共得到81個黃瓜DnaJ基因(表1)。這些基因所編碼的蛋白序列中至少含有1個完整的J結(jié)構(gòu)域核心區(qū)序列(HPD結(jié)構(gòu))。根據(jù)其在染色體上的位置信息,重新命名了這些基因名稱(CsDnaJ1—CsDnaJ81)(表1)。對DnaJ基因編碼的蛋白序列進行分析,發(fā)現(xiàn)DnaJ基因編碼的蛋白氨基酸長度為113～2 551 aa,其中66個(80.2%)蛋白序列長度都大于200 aa。另外,其蛋白相對分子質(zhì)量為(12.10～279.60)×103,等電點(PI)為4.56～11.20。亞細胞位置預(yù)測顯示,大部分蛋白定位于細胞核(42/81,51.8%)及葉綠體(20/81,24.7%)中,其余分別定位于細胞質(zhì)(10)、細胞膜(3)、線粒體(2)、質(zhì)體(2)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(1)及液泡(1)中。

表1 黃瓜DnaJ基因組基本特征Table 1 Basic characteristics of DnaJ gene family in cucumber

續(xù)表1 Table 1 continued

2.2 黃瓜DnaJ基因家族結(jié)構(gòu)域及基因結(jié)構(gòu)特征

利用MEME軟件對黃瓜DnaJ基因家族蛋白序列進行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有蛋白都含有motif 1,其為J結(jié)構(gòu)域核心序列,含有穩(wěn)定的HPD結(jié)構(gòu),是J蛋白與HSP70蛋白相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu);而motif 2為J結(jié)構(gòu)的C端螺旋結(jié)構(gòu),motif 1與motif 2結(jié)合形成完整的J結(jié)構(gòu)域。由圖1可知:66個黃瓜DnaJ蛋白都含有完整的J結(jié)構(gòu),而其余15個蛋白只含有HPD結(jié)構(gòu)及不完全的α螺旋結(jié)構(gòu)所構(gòu)成的J結(jié)構(gòu)域;而motif 4(81個DnaJ蛋白中共9個蛋白含有該結(jié)構(gòu)域)為甘氨酸/苯丙氨酸富集結(jié)構(gòu)域序列(G/F結(jié)構(gòu)域),motif 5(共4個)為CxxCXGXG重復(fù)基序的鋅指結(jié)構(gòu)域序列,motif 3(共10個)或motif 6(共12個)為DnaJ-C末端結(jié)構(gòu)域序列。在其他作物中可以根據(jù)結(jié)構(gòu)域特征將DnaJ蛋白分為3類,而黃瓜中只含有其中2類,即:Ⅰ只有J結(jié)構(gòu)域(共72個);Ⅱ含有J結(jié)構(gòu)域、G/F結(jié)構(gòu)域及C末端結(jié)構(gòu)域(共9個)。另外,一些DnaJ蛋白同樣存在其他非DnaJ蛋白特有結(jié)構(gòu)域。

圖1 CsDnaJ基因motif結(jié)構(gòu)及基因結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Analysis of motif structure and gene structure of CsDnaJ gene

通過對黃瓜DnaJ基因家族mRNA編碼序列比對可知,黃瓜DnaJ基因均含有1～22個外顯子,其中基因CsDnaJ8含有外顯子最多,為22個,而14個CsDnaJ基因(17.3%)只含有1個外顯子,無內(nèi)含子序列。

2.3 黃瓜DnaJ基因家族保守結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)進化分析

對黃瓜DnaJ基因編碼蛋白進行對比分析發(fā)現(xiàn),這些蛋白均含有保守的J結(jié)構(gòu)域,由85個氨基酸構(gòu)成,其中第1～3位(DYY)、5～8位(ILGV)、17～18位(AS)、20～32位(EELKKAYRKLALK)、34～38位(HPDKN)、65(F)、68(I)、71～78(AYEVLSDP)、80～81(KR)及84～85位(YD)氨基酸序列高保守。但核心結(jié)構(gòu)域中其他序列仍存在部分差異,可能造成其行使功能的不同(圖2)。

圖2 黃瓜DnaJ基因家族的J保守結(jié)構(gòu)域序列標(biāo)簽Fig.2 The conserved domain logo of J domain in cucumber DnaJ gene family

利用黃瓜DnaJ基因家族及擬南芥DnaJ基因家族的核心結(jié)構(gòu)域(J結(jié)構(gòu)域)序列進行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,結(jié)果(圖3)顯示,黃瓜DnaJ蛋白與擬南芥DnaJ蛋白可明顯區(qū)分為9個亞簇,每個亞簇均存在擬南芥同源蛋白。其中Ⅸ組含有黃瓜DnaJ蛋白最多,為19個(23.5%),Ⅰ和Ⅱ最少,為2個(2.7%)。

圖3 黃瓜及擬南芥DnaJ基因家族進化分析Fig.3 Evolution analysis of DnaJ gene family in cucumber and Arabidopsis thaliana

2.4 黃瓜DnaJ基因家族染色體分布及共線性分析

由圖4可見:染色體定位分析發(fā)現(xiàn)CsDnaJ基因在黃瓜7條染色體均存在且呈無規(guī)則分布,其中Chr 3含有DnaJ基因最多,為16個,Chr 4、Chr 7最少,為9個,這可能與染色體長度相關(guān)。

圖4 黃瓜DnaJ基因家族染色體定位及共線性分析Fig.4 Chromosome location and collinearity analysis of DnaJ gene family in cucumber 紅線為片段重復(fù)事件,紫線為串聯(lián)重復(fù)事件,綠線為隨機重復(fù)事件。The fragment repeat events are represented by red lines,the purple line are series repeat events,and the green lines are random repeat events.

通過共線性分析發(fā)現(xiàn),黃瓜DnaJ基因家族共存在17個共線基因,分為10對復(fù)制基因,其中存在5對片段重復(fù)事件,3對串聯(lián)重復(fù)事件,2對隨機重復(fù)事件。對復(fù)制基因?qū)Φ腒A/KS值計算發(fā)現(xiàn),其值均小于1,為0.03～0.72,表明CsDnaJ在進化過程中主要受純化選擇的作用,可能與人類長期對優(yōu)質(zhì)黃瓜品種的馴化和培育有關(guān)。

2.5 黃瓜DnaJ基因家族組織表達特異性

由圖5可知:黃瓜DnaJ基因家族在各組織中均有表達,其中,在葉、莖、子房中的表達量略高于在雄花、雌花、根、雄花及卷須中的表達量。各基因間的表達量差異較大,例如基因CsDnaJ20、CsDnaJ39、CsDnaJ71在各組織中表達量均較低(小于1),而基因CsDnaJ20、CsDnaJ35、CsDnaJ45在各組織中的表達量均較高(大于10)。這些高表達基因分別屬于第Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ亞組,且多數(shù)定位于葉綠體中。黃瓜DnaJ家族基因的組織表達特異性表明,不同DnaJ家族基因成員在黃瓜各組織具有不同的調(diào)控作用,且個別基因的高表達也表明其在DnaJ基因家族調(diào)控黃瓜生長發(fā)育過程中的重要性。

圖5 黃瓜DnaJ基因家族組織表達分析Fig.5 Tissue expression analysis of DnaJ gene family in cucumber

2.6 黃瓜DnaJ基因家族對高溫脅迫應(yīng)答模式

由圖6可見:在高溫處理48 h后,黃瓜植株出現(xiàn)明顯萎蔫狀態(tài)。由圖7可見:9個DnaJ基因皆出現(xiàn)上調(diào)表達趨勢,且與對照組相比大部分基因表達量具有顯著性差異。9個DnaJ基因在不同處理時期表達模式有所差異:5個基因(CsDnaJ33、CsDnaJ6、CsDnaJ37、CsDnaJ14、CsDnaJ19)在高溫處理初期(6 h)表達量達到最高值,其后逐漸下降;CsDnaJ72基因在高溫處理12 h時表達量最高,其他處理時間基本持平;CsDnaJ16基因在不同處理時間表達量相近;CsDnaJ31基因在處理前期表達量持續(xù)上升,至24 h達到最高點,其后下降;CsDnaJ29基因在處理前期表達量變化不顯著,在48 h時上升達到最高值。DnaJ基因家族在高溫脅迫下的高表達現(xiàn)象表明了植物在高溫環(huán)境下可以通過誘導(dǎo)DnaJ基因高表達來進一步響應(yīng)脅迫環(huán)境,維持植物體的正常發(fā)育狀態(tài)。這也同樣表明DnaJ蛋白作為應(yīng)激蛋白在黃瓜響應(yīng)脅迫環(huán)境下起重要調(diào)節(jié)作用。

圖6 高溫脅迫下黃瓜表型觀察Fig.6 Phenotype observation of cucumber under high temperature stress A. 黃瓜植株高溫處理前生長狀態(tài);B.黃瓜植株經(jīng)高溫處理后生長狀態(tài)對比。A. Growth state of cucumber plants before high temperature treatment;B. Comparison of growth state of cucumber plants after high temperature.

圖7 黃瓜DnaJ基因家族在高溫脅迫下表達分析Fig.7 Expression analysis of DnaJ gene family in cucumber under high temperature stress**P<0.01.

3 討論

DnaJ蛋白作為熱激蛋白家族中的一類蛋白,大部分以脅迫響應(yīng)因子而廣泛存在于植物組織細胞中,在植物面臨生物及非生物脅迫響應(yīng)中扮演重要的角色[1]。DnaJ蛋白家族基因的表達能夠顯著提高植物耐熱性,降低植物受高溫影響造成的細胞損傷[3]。對DnaJ蛋白家族基因的鑒定及分析有助于深入研究其在脅迫環(huán)境下的調(diào)控功能。

本試驗利用生物信息學(xué)手段在作物黃瓜中鑒定了81個DnaJ基因家族成員,而在擬南芥、水稻、棉花中分別鑒定到91、101、119個DnaJ基因家族成員[5,17-18],這幾種植物在基因家族成員數(shù)量及蛋白特性上均存在高度相似性。這些植物的DnaJ家族成員蛋白序列中均存在由HPD三肽核心結(jié)構(gòu)所構(gòu)成的高保守J結(jié)構(gòu)域,但該保守結(jié)構(gòu)域同樣存在部分氨基酸差異。由于黃瓜DnaJ家族蛋白序列長度差異較大,因此對黃瓜及擬南芥DnaJ家族核心J結(jié)構(gòu)域蛋白序列信息進行進化分析,發(fā)現(xiàn)黃瓜DnaJ家族蛋白與擬南芥相似,同樣可以分為9個亞簇,說明DnaJ家族基因間進化比2個物種間的進化早,且同一簇內(nèi)蛋白可能行使相似的功能。

同樣對黃瓜DnaJ家族蛋白中其他結(jié)構(gòu)域進行分析,發(fā)現(xiàn)黃瓜中存在G/F結(jié)構(gòu)、CxxCxGxG鋅指結(jié)構(gòu)以及DnaJ-C末端結(jié)構(gòu),在其他植物中根據(jù)DnaJ基因含有結(jié)構(gòu)域的不同可將其分為3種類型[29],而黃瓜DnaJ蛋白只含有其中2種類型,缺乏類型Ⅰ即4個結(jié)構(gòu)域都含有的DnaJ蛋白,這可能會造成物種間對環(huán)境溫度適應(yīng)、脅迫反應(yīng)的差異。DnaJ基因的功能與其所在的亞細胞位置密切關(guān)聯(lián)[7-8]。本研究中通過對黃瓜DnaJ蛋白的亞細胞位置預(yù)測,發(fā)現(xiàn)大部分蛋白定位于細胞核與葉綠體內(nèi),目前在植物中對DnaJ蛋白的研究主要集中在定位于葉綠體的DnaJ蛋白,其能夠參與葉綠體發(fā)育、光合作用、蛋白轉(zhuǎn)運等多個進程[6-8]。黃瓜中DanJ蛋白的亞細胞定位預(yù)測結(jié)果同樣說明DnaJ蛋白對黃瓜葉綠體發(fā)育至關(guān)重要。

基因復(fù)制在基因家族形成、物種適應(yīng)中起重要作用,并可以為具有新功能的基因提供原始遺傳材料[30]。黃瓜DnaJ基因家族的共線性分析發(fā)現(xiàn)在黃瓜DnaJ蛋白家族進化過程中同樣出現(xiàn)多次基因復(fù)制現(xiàn)象,包含串聯(lián)復(fù)制、片段復(fù)制及隨機復(fù)制事件。其中,片段復(fù)制出現(xiàn)最多(5次),說明其在黃瓜DnaJ基因家族形成過程中起重要作用,但總體復(fù)制現(xiàn)象僅占全部基因的21%(17/81),這說明存在著其他的進化方式。

本試驗結(jié)果表明,黃瓜DnaJ基因在植物體內(nèi)各組織均有表達,說明DnaJ基因在黃瓜的生長發(fā)育過程發(fā)揮著不可缺少的作用。但基因間的表達模式并不相同,這可能是不同的DnaJ基因在黃瓜器官組織中可能發(fā)揮不同的作用模式所造成的。另外,一些基因在各組織中均呈低水平表達,可能是因為這些基因功能冗余或者發(fā)生了轉(zhuǎn)錄沉默/轉(zhuǎn)錄后沉默效應(yīng),這種現(xiàn)象及效應(yīng)在家族基因行使功能中較為常見[31]。

DnaJ蛋白可以作為細胞內(nèi)感應(yīng)脅迫環(huán)境的主要因子,在諸如高溫、低溫、強光等逆境條件下會大量表達[32-33],并以此參與植物響應(yīng)環(huán)境脅迫進程。本試驗通過定量PCR驗證了DnaJ基因在高溫環(huán)境的表達水平,結(jié)果表明高溫環(huán)境可以誘導(dǎo)DnaJ基因高表達,因此黃瓜DnaJ被高溫環(huán)境所激活,引起表達上調(diào)從而參與植物響應(yīng)脅迫進程。另外,不同的DnaJ基因在隨脅迫環(huán)境處理時間所表現(xiàn)出的表達模式、表達差異倍數(shù)具有明顯差異,這反映了不同DnaJ基因在脅迫響應(yīng)進程中調(diào)控功能的差異。下一步可通過基因轉(zhuǎn)育或轉(zhuǎn)基因方法將DnaJ基因響應(yīng)脅迫功能應(yīng)用于黃瓜抗脅迫品種的選育中。