不結(jié)球白菜分蘗調(diào)控基因BcMAX1的同源克隆及功能分析

張瑋,郭明亮,龍言,黃菲藝,侯喜林,李英

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/園藝學(xué)院,江蘇 南京 210095)

不結(jié)球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis)是我國(guó)重要的葉菜類蔬菜,其中有一種特殊種質(zhì)材料為分蘗菜[1],它既有單子葉植物的分蘗特性又具有雙子葉植物的分枝特點(diǎn)[2],即在腋芽形成后不經(jīng)過(guò)休眠階段就開始發(fā)生分蘗,植株總?cè)~片數(shù)極多,可以分批采摘[3],它的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)決定了其會(huì)成為不結(jié)球白菜未來(lái)育種的優(yōu)質(zhì)材料。因此,研究不結(jié)球白菜分蘗性狀及內(nèi)在分子機(jī)制可以為未來(lái)的育種工作打下良好的基礎(chǔ)。

獨(dú)腳金內(nèi)酯(strigolactone,SL)最早發(fā)現(xiàn)于根系分泌物中[4],它可以通過(guò)木質(zhì)部向上運(yùn)輸至地上部分參與調(diào)控植物株型[5]。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)SL主要以一種生長(zhǎng)素依賴的方式來(lái)調(diào)節(jié)腋芽分枝[6-8]。之前在水稻上的研究已經(jīng)鑒定出幾種突變體在SL的生物合成中存在缺陷(D3/D10/D14/D27/D53),它們表現(xiàn)為高分枝、矮化[9],但同時(shí)SL也會(huì)參與不同的發(fā)育過(guò)程,如表皮細(xì)胞分化、木葡聚糖代謝過(guò)程、休眠過(guò)程、刺激反應(yīng)、核酸酶轉(zhuǎn)運(yùn)等[10]。

近年來(lái),對(duì)于獨(dú)腳金內(nèi)酯的研究愈加深入,研究發(fā)現(xiàn)在單子葉和雙子葉植物中,其抑制植物分枝的調(diào)控模式以及功能基因都存在高度保守性,特別是參與MORE AXILLARY(MAX)途徑中的基因,目前已經(jīng)在4種模式植物(擬南芥、豌豆、水稻和矮牽牛)中鑒定到獨(dú)角金內(nèi)酯依賴MAX途徑完成合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)從而參與分枝的調(diào)控機(jī)制[11]。MAX家族基因會(huì)改變腋芽的休眠狀態(tài)[9],即在腋芽發(fā)生后不經(jīng)過(guò)休眠階段直接進(jìn)入下一步生長(zhǎng)階段,這與不結(jié)球白菜分蘗菜‘馬耳頭’的表型是一致的,推測(cè)MAX家族基因可能為‘馬耳頭’特殊分蘗性狀形成的重要基因。其中MAX1在木質(zhì)部作用于MAX3/MAX4下游1個(gè)可以移動(dòng)的底物產(chǎn)生類胡蘿卜素衍生物,參與SL的合成,直接或間接抑制植物分枝發(fā)育[12-14];MAX2編碼1個(gè)含有富含亮氨酸重復(fù)序列的F-box蛋白[15],D14編碼α/β水解酶家族成員[9],二者均參與SL的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

研究發(fā)現(xiàn),在擬南芥中MAX1是通過(guò)催化連續(xù)的氧化作用將內(nèi)酯(calactone,CL)轉(zhuǎn)化為內(nèi)酯酸(calactone acid,CLA),之后再合成SL,并且其甲酯在體外可與AtD14直接發(fā)生相互作用[16]。另外,D14和MAX2均被認(rèn)為作用于MAX1的下游,并且二者編碼的蛋白存在相互作用[17]。

本研究以不結(jié)球白菜‘馬耳頭’和‘蘇州青’為材料,同源克隆大白菜BcMAX1(LOC103858373)基因及其啟動(dòng)子,并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析;同時(shí)檢測(cè)BcMAX1在‘馬耳頭’和‘蘇州青’不同時(shí)期不同組織中的表達(dá)差異,并利用BcMAX1過(guò)表達(dá)擬南芥轉(zhuǎn)基因植株和不結(jié)球白菜沉默植株對(duì)BcMAX1基因的功能進(jìn)行初步研究,旨在進(jìn)一步探究不結(jié)球白菜獨(dú)角金內(nèi)酯的調(diào)控機(jī)制,為不結(jié)球白菜高產(chǎn)育種提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為不結(jié)球白菜品種‘馬耳頭’(分蘗品種)和‘蘇州青’(不分蘗品種)以及Col生態(tài)型擬南芥,由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白菜系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。分別于不結(jié)球白菜苗齡30、50和70 d時(shí)選取生長(zhǎng)整齊一致的植株,取根、莖、葉片和腋芽,液氮速凍后-80 ℃保存。擬南芥和用于病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)試驗(yàn)的‘蘇州青’種植在人工氣候室中。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA和DNA的提取以及cDNA和gDNA的合成參照植物總RNA和基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)分別提取2個(gè)不結(jié)球白菜品種的RNA和DNA以及擬南芥的RNA,4 ℃冷卻后 -80 ℃保存。以2個(gè)品種葉片的總RNA和DNA為模板分別按PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit和PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)說(shuō)明書分別合成cDNA和gDNA。

1.2.2 不結(jié)球白菜BcMAX1基因的同源克隆及生物信息學(xué)分析從大白菜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出BcMAX1基因序列,設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物BcMAX1-F和BcMAX1-R(表1),以上述cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。用ORF finder查找BcMAX1的開放閱讀框(ORF);利用Predictprotein分析BcMAX1編碼蛋白的生化信息并預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.3 MAX1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建及保守結(jié)構(gòu)域分析采用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,通過(guò)MEME分析不同物種中MAX1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域,并用TBtools軟件對(duì)其進(jìn)行整合分析。

1.2.4 不結(jié)球白菜BcMAX1啟動(dòng)子的同源克隆與序列分析在大白菜數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索出BcMAX1啟動(dòng)子序列,設(shè)計(jì)1對(duì)引物BcMAX1-P-F和BcMAX1-P-R(表1),以上述基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為:PrimeSTAR Max Premix 10 μL,正、反引物各1 μL,模板DNA 100 ng,補(bǔ)水至20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?98 ℃ 5 min;98 ℃ 30 s,55～65 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,共35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。采用PlantCARE軟件[18]進(jìn)行序列分析。

表1 PCR 所用引物序列Table 1 Primer sequences of PCR amplification

1.2.5BcMAX1過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得首先將測(cè)序正確的BcMAX1基因克隆產(chǎn)物連接到經(jīng)BamHⅠ和SacⅠ雙酶切的植物過(guò)表達(dá)載體pTCK303(本實(shí)驗(yàn)室保存)中,得到重組載體pTCK303-BcMAX1。將重組載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌并通過(guò)蘸花法得到轉(zhuǎn)基因擬南芥T0代,再經(jīng)過(guò)2次抗性篩選得到T2代。

1.2.6BcMAX1沉默載體的構(gòu)建及沉默植株的獲得從BcMAX1的編碼區(qū)挑選一段40 bp的特異序列,將其與它的反向互補(bǔ)序列合成1個(gè)80 bp的發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列,隨后將其插入pTY載體(本實(shí)驗(yàn)室保存)得到BcMAX1沉默載體并測(cè)序驗(yàn)證。同時(shí)設(shè)置對(duì)照即pTY空載。該40 bp的特異序列為:5′-ATGAAGACGCAACATTTATGGTGGGATGTTCTTAATCTATATAGATTAAGAACATCCCACCATAAATGTTGCGTCTTCAT-3′。采用1月齡的‘蘇州青’用于病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)試驗(yàn),通過(guò)基因槍法導(dǎo)入病毒。試驗(yàn)重復(fù)3次,每個(gè)重復(fù)8株苗。將植株移至25 ℃、相對(duì)濕度為75%的氣候室中,大約20 d后,選取有感病癥狀的葉片觀察并分析其沉默效率。

1.2.7 定量PCR分析使用NCBI設(shè)計(jì)熒光定量特異性引物qRT-BcMAX1-F和qRT-BcMAX1-R,采用2-ΔΔCT法計(jì)算不同分蘗時(shí)期不同組織(根、莖、葉片和腋芽)中BcMAX1的表達(dá)量,以30 d苗齡‘蘇州青’根中的表達(dá)量為對(duì)照。同時(shí)測(cè)定BcMAX1過(guò)表達(dá)擬南芥轉(zhuǎn)基因植株和不結(jié)球白菜沉默植株中BcMAX1及獨(dú)角金內(nèi)酯響應(yīng)基因BcMAX2和BcD14的表達(dá)水平,以野生型植株作為對(duì)照。以Actin1和Actin2基因作為不結(jié)球白菜和擬南芥的內(nèi)參,引物見表1。3次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不結(jié)球白菜BcMAX1基因的同源克隆和不同物種MAX1的系統(tǒng)進(jìn)化分析以及保守基序分析

以不結(jié)球白菜‘馬耳頭’和‘蘇州青’的cDNA為模板進(jìn)行克隆,2個(gè)序列完全一致。序列分析表明,不結(jié)球白菜BcMAX1包含1個(gè)1 593 bp的開放閱讀框(ORF),編碼531個(gè)氨基酸。BcMAX1蛋白質(zhì)的分子式為C2781H4362N720O756S13,理論等電點(diǎn)(pI)為9.26,不穩(wěn)定指數(shù)為34.65,屬于穩(wěn)定蛋白,脂肪酸系數(shù)為100.4。預(yù)測(cè)該蛋白無(wú)信號(hào)肽,但存在跨膜區(qū)域。

對(duì)22個(gè)物種(包括16個(gè)雙子葉植物和6個(gè)單子葉植物)中的MAX1進(jìn)行進(jìn)化樹分析,結(jié)果(圖1-A)顯示,不結(jié)球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis)的BcMAX1與同為蕓薹屬的歐洲油菜(Brassicanapus)、甘藍(lán)(Brassicaoleracea)的MAX1相似性高達(dá)100%;與同為十字花科的蘿卜(Raphanussativus)中的MAX1相似度高于94%;與擬南芥(Arabidopsisthaliana)、亞麻芥(Camelinasativa)、高山南芥(Arabisalpina)中的MAX1相似性均為80%左右。在22個(gè)MAX1蛋白中共發(fā)現(xiàn)15個(gè)motif(圖1-B)。其中,motif 1—motif 9為共有motif,motif 10、motif 11僅存在于雙子葉植物中,并且motif 11只存在于十字花科植物中,而motif 13和motif 14為單子葉植物所特有。motif 12在某些植物中缺失,motif 15僅存在于單子葉植物和苜蓿中。

圖1 不同物種中MAX1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹和保守基序分析Fig.1 Phylogenetic and conserved motifs analysis of MAX1 proteins in different species A. 系統(tǒng)進(jìn)化樹;B. 保守基序示意圖;C. 基序信息。B圖中每個(gè)圖案由右邊編號(hào)的彩色框表示,不同蛋白質(zhì)中的相同數(shù)字指的是相同的基序。A. Phylogenetic tree;B. Schematic of conserved motifs;C. Detailed information about motifs. Each motif was represented by a coloured box numbered at the right,the same number in different proteins referred to the same motif in figure B.

2.2 不結(jié)球白菜BcMAX1啟動(dòng)子的同源克隆與序列分析

本試驗(yàn)克隆得到的BcMAX1啟動(dòng)子全長(zhǎng)為2 005 bp,包含多個(gè)決定基因轉(zhuǎn)錄起始的TATA-box;決定轉(zhuǎn)錄效率的CAAT-box;涉及干旱誘導(dǎo)的MYB;5個(gè)光響應(yīng)因子:3-AF1 binding site、CAG-motif、GA-motif、TCCC-motif和TCT-motif;以及4個(gè)順式作用元件:ARE、CAT-box、GCN4_motif 和TC-rich repeats;除此之外,還有多個(gè)未知功能的MYB和MYC結(jié)合位點(diǎn)(表2)。

表2 BcMAX1啟動(dòng)子基序分析Table 2 Promoter motif analysis of BcMAX1

2.3 不同生長(zhǎng)時(shí)期不結(jié)球白菜組織中BcMAX1的表達(dá)量

如圖2所示:BcMAX1在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的不結(jié)球白菜‘馬耳頭’和‘蘇州青’的根、莖、葉片和腋芽中均有表達(dá)。在30 d(‘馬耳頭’未發(fā)生分蘗)時(shí),BcMAX1在‘馬耳頭’和‘蘇州青’各個(gè)組織中的表達(dá)量都很低;在50 d(‘馬耳頭’分蘗開始發(fā)生)時(shí),BcMAX1的表達(dá)量開始升高,且‘馬耳頭’各個(gè)組織中的表達(dá)量均高于‘蘇州青’;在70 d(‘馬耳頭’分蘗期)時(shí),BcMAX1在‘馬耳頭’和‘蘇州青’的各個(gè)組織中的表達(dá)量均降到極低。

圖2 不同生長(zhǎng)時(shí)期BcMAX1在‘馬耳頭’和‘蘇州青’不同組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expression of BcMAX1 of different tissues in ‘Maertou’and ‘Suzhouqing’ at different growth stages** P<0.01. The same as follows.

2.4 擬南芥過(guò)表達(dá)BcMAX1表型觀察及相關(guān)基因的表達(dá)分析

擬南芥進(jìn)入生殖生長(zhǎng)即抽薹開花之后,腋芽打破休眠發(fā)育為側(cè)枝。由圖3和圖4-a可見:過(guò)表達(dá)BcMAX1(pTCK303-BcMAX1)植株中蓮座葉數(shù)目少于野生型植株,且只有主枝抽出;而野生型擬南芥中已經(jīng)開始形成側(cè)枝,說(shuō)明BcMAX1會(huì)抑制側(cè)枝的發(fā)育。

圖3 野生型和過(guò)表達(dá)植株BcMAX1抽薹后植株的表型Fig.3 Phenotype in wild type(WT)and overexpression plants after bolting stageA、C. 野生型植株;B、D. 過(guò)表達(dá)BcMAX1植株(M:主莖;SB:莖生葉側(cè)枝;SL:莖生葉)。A,C. WT plants;B,D. BcMAX1 overexpression plants(M:Main stem;SB:Stem leaf lateral branch;SL:Stem leaf).

對(duì)野生型植株和BcMAX1過(guò)表達(dá)植株中的BcMAX1及獨(dú)角金內(nèi)酯響應(yīng)基因BcMAX2和BcD14進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)植株中BcMAX1表達(dá)量顯著升高,BcMAX2和BcD14的表達(dá)量比野生型顯著提高(圖4-b—d)。

圖4 野生型和過(guò)表達(dá)植株抽薹后BcMAX1及相關(guān)基因的表達(dá)分析Fig.4 Expression analysis of BcMAX1 and related genes in WT and overexpression plants after bolting stage

2.5 不結(jié)球白菜BcMAX1基因沉默后相關(guān)基因的表達(dá)分析

由圖5可見:轉(zhuǎn)入pTY-BcMAX1或pTY的‘蘇州青’葉片相對(duì)野生型(WT)植株的葉片明顯褪綠,表現(xiàn)出蕪菁黃色花葉病毒的典型癥狀。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果(圖6)顯示:轉(zhuǎn)入pTY-BcMAX1重組質(zhì)粒的‘蘇州青’中BcMAX1的表達(dá)量與對(duì)照植株相比降低61%,BcMAX2表達(dá)量比對(duì)照降低70%,BcD14表達(dá)量比對(duì)照降低29%,表明BcMAX1表達(dá)量的改變會(huì)調(diào)節(jié)獨(dú)角金內(nèi)酯響應(yīng)基因的表達(dá)水平。

圖5 野生型與侵染 pTY 或pTY-BcMAX1后 發(fā)病植株的表型Fig.5 Phenotype of WT and diseased plants after being infected with plasmid pTY or pTY-BcMAX1

圖6 侵染pTY或pTY-BcMAX1后發(fā)病植株中BcMAX1基因及獨(dú)角金內(nèi)酯響應(yīng)基因的表達(dá)分析Fig.6 Expression analysis of BcMAX1 gene and strigolactones response genes in the diseased plants after being infected with plasmid pTY or pTY-BcMAX1

3 討論

本研究分別從不結(jié)球白菜‘馬耳頭’和‘蘇州青’中克隆了BcMAX1基因和啟動(dòng)子序列,且序列比對(duì)完全一致。研究表明max突變體在擬南芥、豌豆、矮牽牛和水稻中均有發(fā)現(xiàn)[11],說(shuō)明獨(dú)腳金內(nèi)酯在單子葉和雙子葉植物中抑制植物分枝的調(diào)控模式和功能都存在高度的保守性。本研究中MAX1的系統(tǒng)進(jìn)化分析和保守結(jié)構(gòu)分析也驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。

本試驗(yàn)表明,BcMAX1在不結(jié)球白菜‘馬耳頭’和‘蘇州青’不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的各個(gè)組織中均有表達(dá),推測(cè)該基因的調(diào)控存在于不結(jié)球白菜多個(gè)組織中,并可能作用于一種從根部到莖部最后到達(dá)植物葉片和腋芽的可移動(dòng)物質(zhì)[12-14,19]。隨著腋芽的形成到分蘗發(fā)生,BcMAX1在‘馬耳頭’和‘蘇州青’中的表達(dá)量表現(xiàn)為先升高后降低,說(shuō)明該基因與分蘗有密切的聯(lián)系。BcMAX1基因主要作用于葉片和腋芽部位,在腋芽發(fā)育成為分蘗的過(guò)程中發(fā)揮作用,該基因在不結(jié)球白菜整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期表現(xiàn)為抑制分蘗的發(fā)生,并且在‘蘇州青’中表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用,這也與之前的研究結(jié)果[2]一致。

在本研究中,過(guò)表達(dá)擬南芥株系中側(cè)枝生長(zhǎng)受到抑制,蓮座葉數(shù)目少于野生型植株,并且抽薹時(shí)間早于野生型植株。沉默BcMAX1基因并沒(méi)有促進(jìn)‘蘇州青’側(cè)枝的發(fā)生,可能是由于VIGS的沉默效果維持時(shí)間不夠或隨著植物體內(nèi)防御系統(tǒng)的啟動(dòng),VIGS被減弱或消除因此沒(méi)有得到相應(yīng)的表型,也有可能是沉默效率不足以引起表型的明顯變化[20]。過(guò)表達(dá)擬南芥植株中BcMAX1及獨(dú)角金內(nèi)酯響應(yīng)基因BcMAX2和BcD14的表達(dá)量升高,而在不結(jié)球白菜沉默植株中表達(dá)量下降,說(shuō)明BcMAX1表達(dá)量的改變確實(shí)會(huì)調(diào)節(jié)獨(dú)角金內(nèi)酯響應(yīng)基因的表達(dá),但BcMAX1基因與獨(dú)角金內(nèi)酯的關(guān)系及其對(duì)分蘗的影響還需要進(jìn)一步研究。在今后的工作中,還需要利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到BcMAX1的缺失突變體,進(jìn)一步來(lái)研究它的功能,同時(shí)挖掘潛在的分子機(jī)制。

此外,與MAX途徑中的基因相關(guān)的基因也逐漸在其他物種中被發(fā)現(xiàn):例如MAX途徑上游基因MODERATELYINCREASEDTILLER3(MIT3)[21]、SL/MAX2誘導(dǎo)油菜素甾醇降解從而調(diào)控分枝的BRI1EMSSUPPRESSOR1(BES1)[22];TCP家族轉(zhuǎn)錄因子TEOSINTEBRANCHED1(TB1)[23];與OsTB1互作并作用于DWARF14(D14)從而控制水稻腋芽發(fā)生的蛋白OsMADS57(MADS轉(zhuǎn)錄因子)[24];被DWARF53(D53)抑制的SL下游轉(zhuǎn)錄因子IDEAL PLANT ARCHITECTURE 1(IPA1)及其編碼蛋白的互作蛋白IPA1 INTERACTING PROTEIN1(IPI1)、DENSE AND ERECT PANICLE1(DEP1)和WRKY45(WRKY轉(zhuǎn)錄因子),其中IPI1功能喪失突變體植株表現(xiàn)出分蘗數(shù)增加[25-27]。尋找調(diào)控不結(jié)球白菜分蘗性狀的關(guān)鍵基因,分析其對(duì)分蘗的作用及調(diào)控途徑,是未來(lái)選育不結(jié)球白菜優(yōu)良品種和利用基因工程進(jìn)行育種的關(guān)鍵。