莖用萵苣肉質(zhì)莖內(nèi)綠色組織光合特性探析

朱俊杰王天順牙 禹廖 潔閆飛燕

（1 廣西大學(xué)林學(xué)院，廣西南寧 530004；2 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢測(cè)技術(shù)研究所，廣西南寧 530007）

莖用萵苣（Lactuca sativaL.var.asparaginaBailey）是菊科萵苣屬植物，營(yíng)一年或二年生，別稱萵筍、萵苣筍、香筍等（袁慶軍和楊昌煦，2002）。食用時(shí)汁液濃郁、脆嫩可口，可生食、涼拌、炒食、干制或腌漬，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂類物質(zhì)、碳水化合物、維生素（如尼克酸）和礦質(zhì)元素（如鐵、鋅）等各種營(yíng)養(yǎng)成分（高天啟，2018），還具有良好的保健功效，對(duì)改善糖代謝、鎮(zhèn)痛、刺激消化、分解亞硝胺等均有一定的作用（戴國(guó)輝 等，2008）。莖用萵苣在我國(guó)各省（市）大面積種植，是響當(dāng)當(dāng)?shù)拇蟊娛卟?，蔬菜市?chǎng)的“壓艙石”。

在北方地區(qū)，秋冬季低溫是限制莖用萵苣生產(chǎn)的主要因素，大棚生產(chǎn)雖然可部分解決低溫問題，但成本較高。南方地區(qū)盡管一年可以三季甚至四季生產(chǎn)莖用萵苣，但夏季高溫也嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)。總體看，莖用萵苣的單產(chǎn)和品質(zhì)還有較大的提升空間。光合作用是植物生產(chǎn)的物質(zhì)和能量源泉（South et al.，2019），莖用萵苣干物質(zhì)絕大部分來自光合作用，產(chǎn)量提升和品質(zhì)改良離不開對(duì)光合作用的系統(tǒng)和深入研究。目前莖用萵苣光合特性的研究已經(jīng)有一些零星報(bào)道，但這些研究主要集中于施肥對(duì)莖用萵苣葉片光合氣體交換特性的影響上（曾希柏，1997；李會(huì)合 等，2004；王菲 等，2016；張迎春 等，2020），而莖用萵苣葉片葉綠素?zé)晒馓匦匝芯糠矫孢€鮮有報(bào)道。

莖用萵苣的食用部分包含幼嫩葉片，但主要是肉質(zhì)的莖內(nèi)組織。與其他可食莖蔬菜如洋蔥、藕、慈姑、荸薺、馬鈴薯、大蒜、百合相比，莖用萵苣莖內(nèi)含有更多的葉綠素，組織更為脆嫩，含水量更為豐富。莖瘤芥、抱子芥等蔬菜的莖內(nèi)組織表層也分布有綠色組織，但其深入莖內(nèi)的深度和持久度則無法和莖用萵苣相比，在老化之前，莖用萵苣莖內(nèi)深層組織葉綠素含量比表層組織更多。在植物學(xué)上，非葉片綠色組織，如莖稈、葉柄等的光合能力和機(jī)制近年來受到關(guān)注，這些組織的光合特性和葉片有明顯差別（Xu et al.，1997；張永平 等，2011；張金堯 等，2014）。本試驗(yàn)的第一個(gè)目的是以葉片為對(duì)照，對(duì)比監(jiān)測(cè)分析莖內(nèi)深層組織的光合特性，揭示其光合能力和可能機(jī)制。根據(jù)植物生理知識(shí)，綠色組織中葉綠素的形成和維持需要持續(xù)不斷的光環(huán)境（史典義 等，2009），而成熟的莖用萵苣莖內(nèi)深層組織一直是無光環(huán)境，這似乎與生理理論相悖。細(xì)胞分裂素具有保綠功能（王三根，2000），是否與莖用萵苣莖內(nèi)綠色組織存在關(guān)聯(lián)？對(duì)莖用萵苣品質(zhì)有怎樣的影響？這是本試驗(yàn)要回答的第二個(gè)問題。這兩個(gè)問題的探索，將為植物光合作用理論研究及莖用萵苣產(chǎn)量和品質(zhì)改良提供新視角。

1 材料與方法

1.1 材料

將30 g 市售莖用萵苣品種四季大尖葉（桂林市桂華種子有限責(zé)任公司）種子平均分成3 份，于2019 年8月2 日播種于廣西大學(xué)試驗(yàn)基地，播種地塊平均分成3 份，每份3 m2。出苗后按尿素225 kg·hm-2、硝酸鉀300 kg·hm-2追肥1 次，常規(guī)管理，生長(zhǎng)至11 月30 日收獲。

1.2 方法

1.2.1 葉片和莖內(nèi)組織葉綠素?zé)晒馓匦缘臏y(cè)定 在上述樣地每個(gè)地塊中選取無明顯蟲害、長(zhǎng)勢(shì)中等的莖用萵苣3 株，共9 株，收獲當(dāng)日每樣株選取莖稈中上部健康成熟的6～8 片葉，在凌晨天亮前3：00—5：00 用調(diào)制葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)IMAGIN G-PAM MINI-版（德國(guó)walz 公司）中的測(cè)量光測(cè)定基底熒光Fo，再打開飽和閃光監(jiān)測(cè)最大熒光Fm 值，根據(jù)兩參數(shù)自動(dòng)獲得Fv/Fm。然后再換一個(gè)部位測(cè)定吸光系數(shù)Abs，用于后續(xù)相對(duì)電子傳遞速率的計(jì)算。數(shù)據(jù)保存后開啟250 μmol·m-2·s-1活化藍(lán)光進(jìn)行葉綠素?zé)晒饴賱?dòng)力學(xué)曲線誘導(dǎo)4.5 min，記錄穩(wěn)態(tài)熒光值（Ft）、非光化學(xué)能量耗散效率（qN）、光化學(xué)能量耗散效率（qP）、相對(duì)電子傳遞速率（ETR）、光化學(xué)能量耗散Y（Ⅱ）、非光化學(xué)耗散Y（NPQ）和組成型能量耗散Y（NO）等熒光參數(shù)值。最后開啟相對(duì)電子傳遞速率（ETR）和熱耗散速率（NPQ）的光響應(yīng)曲線測(cè)定，設(shè)1 500、1 000、800、400、300、200、130、70、40、20、0 μmol·m-2·s-1共11 個(gè)光照強(qiáng)度（PPFD）梯度，每梯度持續(xù)時(shí)間為3 min。

葉片熒光參數(shù)值測(cè)定完成后，將莖用萵苣樣株砍收，帶回實(shí)驗(yàn)室用清水沖洗3 遍，用毛邊紙吸干多余水分，再將中上部葉片標(biāo)記后收集起來供后續(xù)其他指標(biāo)測(cè)定。最后將9 株樣株莖稈從底部向上縱向剖開，在剖面上根據(jù)綠色的深淺和莖稈實(shí)際所處部位，分為上、中、下3 段，每段分別按上述方法測(cè)定縱向剖面組織的各項(xiàng)葉綠素?zé)晒鈪?shù)值，另外再取少量樣株，在莖段相應(yīng)部位橫切，按上述方法測(cè)定橫切面各項(xiàng)葉綠素?zé)晒鈪?shù)值，以驗(yàn)證縱切面所獲結(jié)果的可靠性（圖1）。

1.2.2 葉片和莖內(nèi)組織含水量的測(cè)定 從上述9 株樣株上每株分別隨機(jī)抽取3 片標(biāo)記葉片，9 片一組，去頭去尾后取中段，稱取并記錄鮮質(zhì)量，隨后放入3 個(gè)不銹鋼盒，轉(zhuǎn)入烘箱，在120 ℃殺青1 h，然后轉(zhuǎn)入牛皮紙信封烘至恒重，再根據(jù)鮮質(zhì)量和烘干后干質(zhì)量差計(jì)算含水量（%）。莖段內(nèi)組織含水量測(cè)定和葉片類似，不同的是從莖內(nèi)組織切取小段莖，稱取鮮質(zhì)量后需切成薄片，然后再殺青、烘干。

1.2.3 葉片和莖內(nèi)組織葉綠素含量的測(cè)定 從上述9 株樣株上每株取3 片葉，9 片一組剪碎混勻后稱取1.0 g。莖內(nèi)綠色組織取樣時(shí)3 株一組，按圖1 標(biāo)注，分部位切出小段莖塊，每組中每部位各稱取1.0 g，然后在黑暗冰浴條件下，用80%的冷丙酮研磨成勻漿，再經(jīng)雙重濾紙過濾至50 mL 容量瓶定容，最后在分光光度計(jì)（日本，島津UV1001）上讀取645 nm 和663 nm 下的光吸收值，根據(jù)下述公式計(jì)算葉綠素含量（Lichtenthaler &Wellbum，1983）。

其中，Vs是定容后的體積，W是組織質(zhì)量。

1.2.4 葉片和莖內(nèi)組織玉米素含量的測(cè)定 分別用上述方法，從剩余的葉片和莖內(nèi)組織各取樣1 g，先用5 mL 80%冷甲醇勻漿，勻漿液轉(zhuǎn)入冷藏管，加入15 mL 冷甲醇密封后于4 ℃冰箱中過夜。第2 天取出密封液，轉(zhuǎn)入離心管，4 ℃下6 000 r·min-1離心10 min，沉淀用少量80%冷甲醇浸提后再離心1 次，合并上清液減壓蒸發(fā)至2 mL 左右。濃縮液經(jīng)0.22 μm 的微孔濾膜過濾，使用高效液相色譜儀（美國(guó)，Waters 公司）檢測(cè)。色譜條件為：Surfire 150 mm × 4.6 mm C18反相色譜柱；流動(dòng)相A 為100%色譜級(jí)甲醇，流動(dòng)相B 為純化過濾的0.077%冰乙酸水溶液；梯度洗脫，0～7 min 30%～50% A，7～14 min 50%～55% A，14～16 min 55% A，16～28 min 50% A，流速1 mL·min-1，進(jìn)樣量15 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。玉米素標(biāo)樣從Sigma 公司購(gòu)買。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片和莖內(nèi)組織葉綠素?zé)晒庵禒顩r分析

從凌晨最大光化學(xué)效率Fv/Fm 值看，莖用萵苣葉片光合機(jī)構(gòu)運(yùn)轉(zhuǎn)良好，沒有明顯的逆境脅迫（圖2）。尤其是上段和中段莖內(nèi)一直處于黑暗條件下的綠色組織Fv/Fm 值也高達(dá)0.75 以上，雖然數(shù)值和葉片有顯著差異，然而這個(gè)結(jié)果已經(jīng)和很多光下健康的高等植物葉片的表現(xiàn)接近。下段莖內(nèi)綠色組織Fv/Fm 值則比葉片小了將近1 倍（圖2），可能是組織更老化，葉綠素含量降低的結(jié)果，但對(duì)于一直處于黑暗條件下的組織來說，這個(gè)Fv/Fm 值也很高。從Fo 值看，中上段莖內(nèi)組織還略高于葉片，下段莖內(nèi)組織則下降了近一半。這些結(jié)果表明，莖內(nèi)深處綠色組織是有光合潛能的。

圖3 顯示的是莖用萵苣不同組織從黑暗條件經(jīng)250 μmol·m-2·s-1光化光誘導(dǎo)后能量分配的情況。葉片中主要光能用于光化學(xué)反應(yīng)Y（Ⅱ）消耗；熱耗散Y（NPQ）消耗的能量占比相對(duì)較低，且和其他莖段內(nèi)組織差別不大。而莖的內(nèi)部組織中，上段莖內(nèi)組織吸收的光能有31%通過Y（Ⅱ）途徑消耗；中段莖內(nèi)組織Y（Ⅱ）耗能比例明顯高于上段莖內(nèi)組織；下段莖內(nèi)組織Y（Ⅱ）耗能比例遠(yuǎn)低于其他組織，而組成型Y（NO）能量耗散比例則明顯高于其他組織。

表1 顯示了莖用萵苣葉片和莖內(nèi)組織從暗處經(jīng)光誘導(dǎo)后主要葉綠素?zé)晒鈪?shù)值的變化狀況，總體看，葉片中穩(wěn)態(tài)熒光值（Ft）、非光化學(xué)能量耗散效率（qN）、光化學(xué)能量耗散效率（qP）和相對(duì)電子傳遞速率（ETR）等參數(shù)值都顯著高于莖內(nèi)組織，莖內(nèi)組織中以中段組織表現(xiàn)較好，除qP 和上段莖內(nèi)組織差異不顯著外，其他參數(shù)值均顯著高于上段和下段莖內(nèi)組織，下段莖內(nèi)組織的所有參數(shù)值都顯著低于上段和中段組織。

從ETR 的光響應(yīng)曲線看，各光強(qiáng)梯度下葉片ETR 值明顯強(qiáng)于各莖內(nèi)組織（圖4-A），莖內(nèi)組織間以中段稍高于上段，上段又強(qiáng)于下段。這個(gè)結(jié)果一方面反映了葉片是主要光合器官的事實(shí)，另一方面也預(yù)示莖內(nèi)綠色組織有一定光合潛能。NPQ 也是植物組織消耗多余光能的重要途徑，莖用萵苣各組織NPQ 值均隨著光強(qiáng)的增加而呈直線上升，葉片比莖內(nèi)組織上升得更快更明顯，莖內(nèi)組織中也是以中段表現(xiàn)最佳，下段最弱（圖4-B）。

表1 莖用萵苣不同組織從暗處經(jīng)光誘導(dǎo)后主要葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線參數(shù)值

2.2 莖用萵苣葉片和莖內(nèi)組織水分、葉綠素、玉米素含量及相關(guān)性分析

如圖5-A 所示，葉片含水量雖然接近90%，但顯著低于莖內(nèi)組織。莖內(nèi)組織含水量以中段最多，高達(dá)95.73%，上段次之，下段最少。多數(shù)蔬菜作物幼嫩器官含水量往往比成熟器官高，莖用萵苣也是如此。

從外觀上看，葉片綠色要淺于莖內(nèi)組織，但由于莖內(nèi)組織含水量較高，從以鮮質(zhì)量為基礎(chǔ)的葉綠素含量實(shí)測(cè)值來看，葉片還是顯著高于莖內(nèi)組織（圖5-A）。莖內(nèi)組織中又以中段最高，顯著高于上段和下段，這和視覺效果是相符的。從葉綠素a 和葉綠素b 的比值看，葉片（3.14 ± 0.02）顯著高于莖內(nèi)組織（上段1.97 ± 0.01，中段2.12 ± 0.03，下段1.89 ± 0.02），說明莖內(nèi)組織中葉綠素b的占比更高，這也是它看起來比葉片更綠的原因。

由圖5-B 可知，葉片內(nèi)玉米素含量顯著低于莖內(nèi)組織，莖內(nèi)組織中，中段顯著高于上段和下段，下段略低于上段，這個(gè)分布狀況和含水量的分布是相似的。

僅僅從莖內(nèi)組織看，葉綠素含量和含水量是顯著的正相關(guān)關(guān)系，如果把葉片也考慮進(jìn)來，則這種相關(guān)性就很弱了（圖5-A）。葉綠素的卟啉環(huán)本身是一個(gè)親水基團(tuán)，可能在莖用萵苣莖內(nèi)起到保水作用。與此類似，莖組織內(nèi)玉米素含量和葉綠素含量也呈顯著的正相關(guān)關(guān)系（圖5-B）。同樣，如果把葉片也納入，則這種相關(guān)性幾乎就沒有了。

3 討論

3.1 莖用萵苣莖內(nèi)綠色組織的強(qiáng)勁光合潛力及原因分析

從莖用萵苣莖和葉片葉綠素?zé)晒馓匦缘膶?duì)比看，黑暗中生長(zhǎng)的莖用萵苣莖內(nèi)組織具有很強(qiáng)的光合潛能（圖2～4），至少有很強(qiáng)的光能轉(zhuǎn)換和利用潛力，尤其是莖中段的綠色組織。葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm 值是反映植物潛在光化學(xué)效率的可靠指標(biāo)（Demmig-Adams et al.，1996），同時(shí)也是反映植物耐受光抑制能力的重要參數(shù)（Che et al.，2020）。大量研究結(jié)果表明，高等健康綠色植物葉片經(jīng)過一個(gè)夜晚的恢復(fù)后，其凌晨Fv/Fm 值通常在0.75 以上（Smillie et al.，1988）。本試驗(yàn)中莖用萵苣上段和中段莖內(nèi)組織Fv/Fm 值在這一范圍內(nèi)，預(yù)示其較高的光化學(xué)效率。將莖用萵苣莖內(nèi)組織從黑暗轉(zhuǎn)到活化光下經(jīng)過一段時(shí)間光誘導(dǎo)，葉綠素?zé)晒獍l(fā)射量達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，監(jiān)測(cè)光能分配利用的結(jié)果表明，上段和中段莖內(nèi)組織通過光化學(xué)途徑耗散的光能所占比例較大，進(jìn)一步驗(yàn)證了其高效的光化學(xué)能力。葉綠體內(nèi)囊體膜上的電子傳遞是植物將光能轉(zhuǎn)換為化學(xué)能的核心環(huán)節(jié)，電子傳遞能力將直接決定光能的利用水平。從莖用萵苣莖內(nèi)組織電子傳遞速率的表現(xiàn)看，盡管和葉片有差距，但其絕對(duì)值并不比其他植物葉片低，再次印證了莖內(nèi)組織的光合潛能。

植物非葉片綠色組織的光合作用近些年來引起了研究者們極大的興趣，他們對(duì)植物果皮（黃仁 等，2019）、葉柄（胡文詩 等，2019）、枝條和莖表皮（劉濤 等，2019）等綠色組織的光合能力進(jìn)行了一些探索性的研究，發(fā)現(xiàn)了一些特殊的光合機(jī)制。例如，Hibberd 和Quick（2002）在煙草中發(fā)現(xiàn)，與葉片的C3途徑光合作用不同，莖和葉柄是C4途徑的光合作用，其碳源來自微管組織而非氣孔。和上述這些非葉片綠色組織不同，莖用萵苣的綠色組織深埋在莖內(nèi)部，太陽光不可能到達(dá)，而中段和上段莖內(nèi)組織光化學(xué)潛力（Fv/Fm）比下段組織還更高一些（圖2）。光合作用整個(gè)過程大體分為光反應(yīng)和碳反應(yīng)兩個(gè)階段，兩階段均需要光的參與，而莖用萵苣莖內(nèi)組織根本就沒有獲得光的機(jī)會(huì)。那么，莖用萵苣在長(zhǎng)期的進(jìn)化中為什么保留這種特性呢？在莖用萵苣的栽培管理過程中，筆者偶爾會(huì)發(fā)現(xiàn)少量莖稈破裂的植株，以及少量被昆蟲或老鼠等小動(dòng)物啃食后被風(fēng)吹斷的植株，對(duì)這些莖用萵苣植株來說，這時(shí)莖內(nèi)綠色組織額外補(bǔ)充的光合產(chǎn)物有助于完成生活史。生產(chǎn)實(shí)踐中，這些植株通常能繼續(xù)頑強(qiáng)地生長(zhǎng)，并從傷口附近長(zhǎng)出新葉，這也許是一種進(jìn)化生存策略。

3.2 莖內(nèi)深層組織葉綠素長(zhǎng)期維持的一種可能機(jī)制及作用

葉綠體是光合作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，葉綠體中葉綠素的形成和維持需要一定的光照條件（史典義 等，2009），而莖用萵苣莖內(nèi)深層組織長(zhǎng)期處于黑暗條件下，莖內(nèi)組織的葉綠體是依靠什么機(jī)制長(zhǎng)期在黑暗條件下維持一定的葉綠素含量呢？細(xì)胞分裂素是植物體內(nèi)一種重要的天然激素，主要在根系合成，然后運(yùn)送到細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)比較旺盛的組織中，細(xì)胞分裂素的主要功能除了促進(jìn)細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)外，還有保幼和保綠的效應(yīng)（王三根，2000）。對(duì)于莖用萵苣來說，其莖內(nèi)肉質(zhì)組織是生長(zhǎng)和代謝最旺盛的部位，細(xì)胞分裂素有可能是一個(gè)重要因素，葉綠素含量的維持也可能與此有關(guān)。玉米素是高等植物內(nèi)常見的一種內(nèi)源細(xì)胞分裂素物質(zhì)，其功能在多種植物中都得到驗(yàn)證（董學(xué)會(huì) 等，2001；李志康 等，2018；陳婷婷 等，2019）。從莖用萵苣組織的測(cè)定結(jié)果看，莖內(nèi)組織確實(shí)含有比葉片更高的玉米素，并且生長(zhǎng)旺盛的中段莖含量最高，而且玉米素含量和葉綠素含量在莖內(nèi)是一種正相關(guān)關(guān)系（圖5），因此極有可能是細(xì)胞分裂素（這里是玉米素）在促進(jìn)莖用萵苣組織細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)的同時(shí)維持細(xì)胞的幼嫩和綠色狀態(tài)。然而莖用萵苣莖內(nèi)這些綠色組織除了應(yīng)對(duì)突發(fā)災(zāi)害（如莖稈破裂和折斷）時(shí)可能提供額外光合產(chǎn)物外，是否還有其他功能？葉綠素的合成和維持是需要消耗一定碳水化合物的，目前認(rèn)為葉綠素的主要生理功能是吸收光能并進(jìn)行光物理和光化學(xué)反應(yīng)。從分子結(jié)構(gòu)看，葉綠素分子骨架含有一個(gè)大的卟啉環(huán)，這個(gè)卟啉環(huán)是親水基團(tuán)，可以在周圍聚集大量水分子。本試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，莖用萵苣莖內(nèi)組織葉綠素含量和含水量呈顯著的正相關(guān)關(guān)系（圖5）。在生產(chǎn)實(shí)踐中也不難發(fā)現(xiàn)，越是生長(zhǎng)旺盛充分的莖用萵苣莖內(nèi)組織，其綠色也越深，含水量也越高，而隨著莖內(nèi)組織的老化，綠色組織逐漸失水變色并空心化；干旱條件下，莖用萵苣莖內(nèi)組織綠色明顯減弱，水分含量也減少，這也從側(cè)面印證了上述機(jī)制。

4 結(jié)論

和葉片相比，莖用萵苣莖內(nèi)深層綠色組織葉綠素?zé)晒馓匦园凳酒渚哂休^強(qiáng)的光合潛能。本試驗(yàn)預(yù)示著這種潛在光合能力所需的光合色素可通過細(xì)胞分裂素的作用在黑暗條件下長(zhǎng)期維持，同時(shí)莖內(nèi)綠色組織對(duì)維持莖內(nèi)高含水量起作用，是莖用萵苣產(chǎn)量和品質(zhì)形成的重要生理基礎(chǔ)。莖用萵苣品種選育中可重點(diǎn)考慮細(xì)胞分裂素含量高的材料。