與番茄頸腐根腐病緊密連鎖的SCAR標記開發(fā)

程 琳張曉艷魏美甜倫堯堯趙 靜王曉武李傳友

（1 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部設施蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，山東省設施蔬菜分子育種省級重點實驗室，山東省蔬菜工程技術研究中心，山東壽光蔬菜種業(yè)集團有限公司，山東省壽光蔬菜產(chǎn)業(yè)集團有限公司，山東壽光 262700；2 壽光市農(nóng)業(yè)技術中心，山東壽光 262700；3 山東壽光歐亞特菜有限公司，山東壽光 262700；4 山東省生物化學與分子生物學高校重點實驗室，濰坊學院生物與農(nóng)業(yè)工程學院，山東濰坊 261061；5 中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081；6 中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所，北京 100101）

由尖孢鐮孢菌番茄頸腐根腐病?；停‵usarium oxysporumf.sp.radicis-lycopersici，F(xiàn)ORL）引起的番茄頸腐根腐?。‵usarium crown and root rot，F(xiàn)CRR）（Yamamoto et al.，1974；Jarvis &Shoemaker，1978）是一種重要的土傳病害（Benaouali et al.，2014），主要表現(xiàn)為植株莖基部交接處、環(huán)繞莖基部有明顯的深褐色病斑，被侵染植株苗期易從病斑處折倒而萎蔫致死，5 葉期以后至開花結果期發(fā)病則表現(xiàn)為莖基部縊縮、呈深褐色，植株仍然直立而萎蔫致死（耿麗華 等，2012）。

該病害于1974 年首次在日本發(fā)現(xiàn)，隨后在美洲、歐洲和非洲等多個國家發(fā)生，造成嚴重損失（Sonoda，1976；Jarvis，1988；Rekah et al.，1999；Jacobs &Heerden，2012）。最近幾年，我國東北、華北地區(qū)發(fā)病比較嚴重，尤以山東省壽光地區(qū)病情最為突出。壽光日光溫室番茄發(fā)病率達80%以上，致死率達30%以上，造成嚴重減產(chǎn)，已成為山東省繼線蟲、黃化曲葉病毒病等毀滅性病害暴發(fā)之后的另一普遍性番茄病害（程琳 等，2016）。

番茄頸腐根腐病的病原菌侵染周期相對較長，目前還沒有安全有效的防范治療措施（Liu et al.，2010），因此選育抗番茄頸腐根腐病的番茄新品種就成為科學有效的方法。傳統(tǒng)育種一般通過人工接種，篩選F.oxysporumf.sp.radicis-lycopersici的抗性材料（Staniaszek et al.，2014）。這個過程耗費時間長、成本高、人工量大。在番茄中，對FORL 的抗性是由1 個顯性單基因Frl控制的，而這個基因來源于Solanum peruvianum（Yamakawa &Nagata，1975；Berry &Oakes，1987），并且在已知的3 份抗源材料中抗病基因都是一種（Kamilova et al.，2006）。Frl基因定位在番茄9 號染色體的長臂端，與Tm-2基因緊密連鎖（Vakalounakis et al.，1997；Fazio et al.，1999）。Fazio 等（1999）發(fā)現(xiàn)了1 個與Frl基因緊密連鎖的RAPD 標記，Tanyolac 和Akkale（2010）、Truong 等（2011）也開發(fā)得到了一些CAPS 標記，但準確性都無法令人滿意。Staniaszek 等（2014）找到了1 個與Frl基因緊密連鎖的分子標記C2-25，此標記經(jīng)過酶切，可有效篩選抗病材料。但是CAPS 標記需要酶切，成本高，試驗程序繁瑣，檢測效率低。

本試驗利用C2-25 引物，以25 份背景不同、抗性已知的番茄材料為模板，分別進行PCR，挑取單克隆并測序，得到了抗感病序列。根據(jù)抗感病序列的差異位點，分別設計抗病和感病SCAR 標記，利用親本以及F1篩選得到抗病、感病混合引物對，并用F2群體成功進行了驗證。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2017 年1—6 月在山東省蔬菜工程技術研究中心基地日光溫室內(nèi)進行。使用程琳等（2016）鑒定出的25 份番茄材料進行抗病、感病序列測定。SCAR 標記篩選及驗證使用抗病親本P51、感病親本P284 及其F1、F2材料。用于測序的25 份材料以及親本P51、P284，F(xiàn)1材料各種植15 株，F(xiàn)2材料種植700 株。所有材料于2017 年1 月15 日播種，2 月15 日定植，常規(guī)田間管理。

病原菌為2014 年9 月在山東省壽光市稻田鎮(zhèn)西劉營村農(nóng)戶日光溫室內(nèi)典型番茄頸腐根腐病發(fā)病植株上采集，按常規(guī)方法保存。

1.2 DNA 提取與PCR 擴增

采集已知表型的25 份材料以及鑒定出表型的親本F1、F2植株的葉片，采用改良的CTAB 法（Fulton et al.，1995）提取各單株的DNA，利用Staniaszek 等（2014）設計的C2-25 引物序列及新設計的SCAR 引物序列進行PCR。

C2-25 引物膠回收PCR 體系：上下游引物各5 μL，DNA（提取后的DNA 稀釋10 倍）20 μL，10× PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 20 μL，dNTPs（2 mmol·L-1）20 μL，MgSO4（25 mmol·L-1）12 μL，KOD-Plus-Neo（1 U·μL-1）4 μL，ddH2O 114 μL。PCR 反應程序：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，55℃ 30 s，68 ℃ 45 s，35 個循環(huán)；68 ℃ 10 min，4 ℃保存。采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，電壓100 V，電泳30 min，紫外燈下切膠和拍照。

C2-25 引物菌落PCR 體系：上下游引物各0.5 μL，2×TaqPCR Mix（北京艾德萊生物科技有限公司）10 μL，菌液1 μL，ddH2O 8 μL。PCR 反應程序同上。

SCAR 標記篩選的PCR 體系：抗病/感病上下游引物各0.5 μL，2×TaqPCR Mix 10 μL，DNA 2 μL，ddH2O 7 μL。SCAR 標記群體驗證的PCR 體系：抗病上下游引物各0.5 μL，感病上下游引物各0.5μL，2×TaqPCR Mix 10 μL，DNA 2 μL，ddH2O 6 μL。SCAR 標記PCR 反應程序：94 ℃ 5 min；94℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃延伸（延伸時間根據(jù)延伸速度1～2 kb·min-1計算），35 個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。

1.3 DNA 片段連接轉(zhuǎn)化

1.3.1 PCR 產(chǎn)物回收 使用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒，切膠回收PCR 產(chǎn)物。

1.3.2 產(chǎn)物加A 尾 使用北京艾德萊生物科技有限公司的TaqDNA Polymerase 試劑盒加A 尾。反應體系：回收產(chǎn)物30 μL，TaqDNA Polymerase 1 μL，10×TaqBuffer 5 μL，dATP（10 mmol·L-1）1 μL，ddH2O 13 μL。輕彈混勻，瞬時離心，在PCR儀上72 ℃延伸30 min。

1.3.3 產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化 使用北京艾德萊生物科技有限公司的零背景pTOPO-TA 克隆試劑盒。連接體系為：pTOPO-T 載 體1 μL（30 ng·μL-1），10×Enhancer 1 μL，PCR 純化產(chǎn)物8 μL（約50 ng）。加入試劑后吹打混勻，低速瞬時離心，收集離心管底部的所有液體，室溫連接5 min。

取50～100 μL 感受態(tài)細胞，置于冰上解凍，加入5 μL 連接液，吹打混勻，室溫放置5 min。加入300～500 μL 無抗體的LB 培養(yǎng)液，37 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)10 min。在含有氨芐青霉素（80 μg·mL-1）的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜。挑取單菌落，搖菌，通過PCR 選擇條帶大小正確的菌液，每個培養(yǎng)皿選擇3 個菌液送至英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測序。

1.4 InDel 標記開發(fā)、篩選及驗證

利用在線比對網(wǎng)站CLUSTALW（https：//www.genome.jp/tools-bin/clustalw/），比對抗病序列和感病序列，根據(jù)二者的差異位點，分別設計了抗病引物和感病引物。無論是正向引物還是反向引物，務必確保引物3′端末位堿基為突變堿基。

將退火溫度相近、條帶大小合適的引物，分別組合成抗病引物對和感病引物對。以抗病親本P51、感病親本P284、F1材料為模板，篩選多態(tài)性引物對。將退火溫度相近、條帶大小合適的抗病引物對和感病引物對混合，以抗病親本P51、感病親本P284、F1材料為模板，篩選多態(tài)性混合引物組合。

在F2群體中，利用篩選得到的混合引物對進行群體驗證，將帶型與表型鑒定結果對比，驗證標記準確率。

1.5 番茄材料抗病性人工接種鑒定

參照程琳等（2016）的方法，將番茄頸腐根腐病病原菌接種到馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，置于搖床中以25 ℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)3 d，過濾除去菌體，配制濃度為1×107CFU 的孢子懸浮液。番茄材料在滅菌基質(zhì)中長至1 片真葉時，用清水將根系清洗干凈，放在孢子懸浮液中浸根接種10 min，然后移栽至滅菌基質(zhì)中，對照用清水浸根10 min，置于18 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種處理14 d 后，觀察、記錄番茄材料的發(fā)病情況。

2 結果與分析

2.1 測序結果分析

經(jīng)在線序列比對軟件CLUSTALW 比對后，排除隨機突變，19 份純合抗病材料存在1 條完全相同的抗病序列，4 份純合感病材料存在1 條完全相同的感病序列，2 份雜合抗病材料均存在前述的抗病序列和感病序列。從這25 份材料中得到了2 條序列，根據(jù)表型區(qū)分出抗病序列和感病序列，共找到了18 個差異位點（圖1）。

2.2 SCAR 標記篩選

利用差異位點，設計抗病上游引物8 條，下游引物6 條；感病上游引物7 條，下游引物7 條。選擇退火溫度相近且目的條帶大小在300～1 000 bp的抗病引物和感病引物，分別兩兩組合。以抗病親本P51、感病親本P284、F1材料為模板，篩選得到了5 對在抗病材料中有條帶、在感病材料中無條帶的抗病標記R-3F/2R、R-4F/6R、R-6F/2R、R-6F/3R、R-6F/4R，6 對在抗病材料中無條帶、在感病材料中有條帶的感病標記S-3F/2R、S-3F/4R、S-4F/2R、S-4F/6R、S-4F/7R、S-6F/4R（表1）。

在篩選得到的5 對抗病引物和6 對感病引物中，選擇退火溫度相近、條帶差異較大的抗病引物和感病引物，組成20 組混合引物（表2）。以抗病親本P51、感病親本P284、F1材料為模板，篩選得到可擴增出370 bp 抗病特異片段和520 bp 感病特異片段的連鎖SCAR 標記R-6F/2R、S-3F/4R（圖2）。

表1 C2-25 及篩選得到的SCAR 引物序列

表2 混合引物組合

2.3 混合標記在F2群體中單株驗證

以混合引物組合在500 株F2群體中篩選，122株材料擴增出370 bp 的條帶，為純合抗??；257 株材料同時擴增出了370 bp 和520 bp 的條帶，為雜合抗??；121 株材料擴增出了520 bp 的條帶，為純合感?。ū?）。

采用人工接種鑒定病原菌的方法對親本、F1、F2材料進行抗病性鑒定。結果表明，F(xiàn)2群體中373株材料表現(xiàn)抗病，127 株材料表現(xiàn)感病?？共〔牧贤庥^無顯著變化，感病材料莖基部縊縮，出現(xiàn)褐色病斑，幼苗從病斑處倒折（圖3）。在500 株F2材料中，473 株材料人工接種鑒定結果與分子標記檢測結果一致，準確率達到94.6%。

表3 部分F2個體的分子鑒定結果及人工接種抗病性鑒定結果

3 討論與結論

現(xiàn)有的頸腐根腐病分子標記多為RAPD、CAPS 標記，但有的準確性比較低，有的操作比較繁瑣，需要尋找結果更加準確，操作更加簡便，可用于高通量篩選的分子標記。本試驗利用準確性較高的CAPS 標記C2-25，以25 份不同背景、已知抗性的番茄材料為模板，得到了抗病序列和感病序列，根據(jù)序列差異分別設計了抗病引物和感病引物。利用抗病親本、感病親本、雜合F1，先篩選得到了多態(tài)性抗病引物和感病引物，之后再將抗病引物和感病引物混合，篩選得到了多態(tài)性的抗病、感病混合引物組合，可擴增出370 bp 抗病特異片段和520 bp 感病特異片段。

在500 株F2材料中，473 株材料人工接種鑒定結果與分子標記檢測結果一致，準確率達到了94.6%。仍有27 株材料檢測結果不一致，這種差異可能與這個分子標記和抗病基因Frl間尚存在一定的連鎖距離有關，因此后續(xù)研究可開發(fā)與抗病基因Frl連鎖關系更近乃至基因內(nèi)部標記，從而提高分子標記鑒定的準確度。同時，為了提高通量，配合LGC 技術，也應該開發(fā)SNP 分子標記。