腸道M細胞的功能與疾病的研究進展

李秋璇，郭玥盺，華嶸暄， 首都醫(yī)科大學臨床醫(yī)學“5+3一體化”專業(yè)北京市 100069

尚宏偉， 首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院形態(tài)學實驗中心 北京市 100069

李利生， 首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院機能實驗中心 北京市 100069

徐敬東， 北京市首都醫(yī)科大學生理學與病理生理學系 北京市 100069

0 引言

隨著腸道與機體其他臟器之間的健康與疾病之間的相關性日益受到關注，許多疾病的起源于腸道的猜想引起廣大醫(yī)務工作者的高度重視.然而，目前仍有一些問題無法解決.M細胞作為腸道上皮屏障重要的組成，其生物學特性以及與機體的健康關系近年來成為研究的熱點.

1922年日本科學家Kenzaburo Kumagai首次發(fā)現并報道了濾泡關聯上皮(follicle-associated epithelium，FAE)部位的抗原內化;由于研究技術的羈絆，在經歷了漫長的過程后，于1972年由美國科學家Robert Owen借助掃描電鏡在人類派氏結(Peyer’s patches，PPs)發(fā)現了一種形態(tài)上不同于周圍上皮細胞的特殊細胞.這種細胞表面沒有豐富的微絨毛，而是有許多“微褶皺”，基底膜內陷呈“囊袋狀”.因此，將它命名為微褶皺細胞(microfold cell，M cell)[1].大量的研究表明M細胞來源于腸隱窩Lgr5+干細胞，其分化和成熟是多途徑分子機制的調控，其中核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)和S100A4蛋白尤為重要.RANKL缺乏會導致M細胞分化障礙，導致幼稚M細胞增加;而S100A4缺乏會導致成熟M細胞的缺乏[2].由于M細胞在腸道免疫調節(jié)中發(fā)揮重要作用，它既能轉運抗原，又是病原體進入機體的入口.而成熟M細胞缺乏，導致腸道抗原轉運受阻，從而無法啟動腸道免疫應答.最新研究表明M細胞與多種疾病有密切關系.本綜述從生物學角度和免疫學角度闡述M細胞的作用，并就其與疾病的相關性進行闡述.

1 M細胞的生物學特性

腸相關淋巴組織(gut associated lymphoid tissue，GALT)分為兩部分，有結構的組織粘膜濾泡和彌漫淋巴組織[3].粘膜濾泡是免疫誘導區(qū)，是免疫應答的淋巴傳入區(qū);彌漫淋巴組織是免疫應答的淋巴傳出區(qū)[4].免疫誘導區(qū)包括PPs、腸系膜淋巴結(msenteric Lymph Node，MLN)、孤立淋巴濾泡等腸道淋巴組織.PPs由FAE、上皮下圓頂(sub-epithelium dome，SED)和B細胞濾泡(B cells follicle)組成[5].M細胞主要存在于FAE，同時M細胞在支氣管相關淋巴組織(bronchial-associated lymphoid tissue，BALT)和鼻咽相關淋巴組織(nasopharyngeal lymphoid tissue，NALT)分布.

圖1 腸道環(huán)境中M細胞示意圖.M細胞來源于腸隱窩Lgr5+干細胞，基底膜內陷，呈“囊袋狀”.GP2是M細胞成熟的標志蛋白分子.樹突狀細胞和巨噬細胞分泌IL-15，IL-15可促進B細胞增殖分化.腸腔內有細菌存在，可通過M細胞進入人體.左下角是RANK和RANKL結合的分子模式圖.GP2:糖蛋白2；IL-15:白細胞介素-15；RANK:核因子κB受體活化因子；RANKL:核因子κB受體活化因子配體.

M細胞基底膜內陷，形成“M細胞囊袋(M cell pocket)”，凹陷處包含著樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)、淋巴細胞等免疫相關細胞[6](圖1).“M細胞囊袋”是M細胞分化成熟的標志.“囊袋”結構減少了M細胞攝取抗原、轉運抗原的距離，提高了轉運和吞吐抗原作用的效率.腔內抗原可以被快速轉運至M細胞基底膜，并遞送至DCs，觸發(fā)腸道免疫反應[7].相較于其他腸上皮細胞，M細胞溶酶體活性較低，所以腸腔抗原信息可以完整的轉運至DCs.DCs通過三種途徑進行免疫應答，DCs將抗原繼續(xù)呈遞至T細胞、B細胞;負載抗原的DCs通過淋巴引流，直接進入MLN;DCs借助M細胞在腔內直接捕獲抗原[8，9]，這種方式更加快捷，在腸道的速發(fā)型的免疫調節(jié)中具有重要作用.由于M細胞表面存在高度糖基化、可以被凝集素靶向識別的區(qū)域[10]，荊豆凝集素-1(ulex europaeus agglutinin 1，UEA-1)可以和M細胞頂端表面的α胞頂端巖藻糖殘基特異性結合;唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素(Siglec)中的Siglec-F可以特異性靶向與M細胞結合[11].M細胞表面表達病原體識別受體(pathogen recognition receptors，PRR)，腸道病原體可以和PRR結合，以達到靶向M細胞的作用.M細胞表面還表達糖蛋白2(glycoprotein 2，GP2)，GP2可和細菌外膜Ⅰ型菌毛尾端的黏附素FimH特異性結合[12].FAE中的M細胞可以根據GP2的表達特點分為兩種亞型，一種是高表達GP2的M細胞，另一種是低表達或不表達GP2的M細胞[13].高表達GP2的M細胞可攝取腸腔抗原，低表達或不表達GP2的M細胞幾乎不攝取腸腔內抗原.通過免疫組化技術證實Spi-B和Sox8分子表達之后在細胞膜上出現GP2+蛋白.在GP2-/-或GP2low/-小鼠發(fā)現，M細胞的正常形態(tài)或功能受損.由此可見GP2+的M細胞是成熟的、功能性的M細胞的標志[6].重組人同種異體移植炎癥因子1(allograft inflammatory fator 1，Aif1)表達于被排斥的移植心臟上，FAE的M細胞也表達Aif1[14].與野生型小鼠相比，Aif1-/-小鼠FAE區(qū)域M細胞攝取轉運抗原能力下降，但幼稚M細胞的分化不受影響.β1整合素(integrin beta-1，ITGB1)在M細胞膜上表達，也是小腸結腸炎耶爾森菌(Y.enterocolitica)的受體[15]，然而Aif1-/-小鼠中ITGB1明顯減少，提示ITGB1表達與Aif1相關[14].同時，研究證實ITGB1還有促進細胞粘附，連通細胞內外環(huán)境的作用，是內外環(huán)境溝通的“橋梁”[14].由此可見，ITGB1是M細胞發(fā)揮抗原呈遞功能的生物學標志.綜上所述，UEA-1、Siglec-F、GP2、ITGB1均是M細胞的生物學標志.由于M細胞表面有多種生物學標志，由此可見M細胞具有復雜的生物學功能.

2 M細胞分化的分子機制

M細胞源于腸隱窩Lgr5+干細胞[16]，RANKL在GALT的SED大量存在，是由M細胞誘導(M-cell inducer，Mci)細胞分泌的細胞因子[17]，Mci細胞是高度表達膜結合型RANKL的上皮下間質細胞.RANKL是Ⅱ型膜結合蛋白，是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族中的一員，可以和NF-κB受體活化因子(receptor activator of NF-κB，RANK)相結合[18].RANKL可以被金屬蛋白酶裂解[19]，其分布廣泛，在骨骼肌、胸腺、肝臟、結腸、小腸、腎上腺等組織均表達[20].M細胞分化主要通過兩條途徑調控，非經典NF-κB通路和經典NF-κB通路.

非經典NF-κB通路是由RANKL和RANK結合啟動[21].RANKL和RANK結合后激活NF-κB誘導激酶(NF-κB-inducing kinase，NIK)，促進p52/RelB蛋白的表達.實驗發(fā)現，選擇性敲除Mci細胞上的膜結合型RANKL后，FAE區(qū)域幼稚M細胞無法發(fā)育成熟;Nik-/-小鼠缺乏成熟的M細胞.以上研究證明，非經典NF-κB通路是M細胞成熟的必須途徑.同時，腫瘤壞死因子受體相關因子6(TNF receptor associated factor 6，TRAF6)是經典NF-κB通路所必須的[22].在類器官培養(yǎng)系統中，用RANKL處理腸道類器官時，GP2表達上調.TRAF6-/-小鼠PPs中M細胞的完全喪失，腸道抗原攝取轉運障礙[22].P50/RelA蛋白的表達可以促進P52/RelB蛋白表達，P50/RelA蛋白和P52/RelB蛋白均可促進Marcksl1 mRNA和Anxas蛋白的表達[22].以上研究結果提示，經典NF-κB通路對M細胞分化發(fā)育不可或缺，并且通過多條途徑間接影響非經典NF-κB通路.實驗表明，轉錄因子Spi-B缺乏時，Ccl9、Tnfaip2和Gp2無法正常表達，但Marksl1和Anxa5仍可正常表達[23]，轉錄因子Spi-B或Sox8二者缺其一時，GP2+M細胞未能檢測到;當二者同時缺乏時，GP2+M細胞缺乏;只有Spi-B和Sox8同時正常表達，GP2+M細胞才能正常表達.由此可見，Spi-B和Sox8對GP2+M細胞的分化與成熟不可或缺(如圖2所示).

研究表明富含溶菌酶的樹突狀細胞、先天淋巴細胞可以合成S100A4蛋白.S100A4蛋白是由人類S100A4基因編碼的蛋白質，存在于細胞質和細胞核中，參與細胞發(fā)育和分化的調控，在細胞運動、侵襲和微管蛋白聚合中發(fā)揮作用[24].DOCK8基因定位于人類9號染色體p24.3，其編碼的DOCK8蛋白可激活Rho-GTP酶，調節(jié)細胞功能，尤其是肌動蛋白細胞骨架調控、影響細胞遷移活動.研究發(fā)現，當缺乏DOCK8時，S100A4+細胞數量減少，S100A4減少會導致M細胞成熟障礙.腸道類器官系統培養(yǎng)中腸隱窩Lgr5+干細胞可以被誘導分化成M細胞，使用S100A4后幼稚M細胞減少，而成熟M細胞增加;DOCK-/-小鼠S100A4含量顯著下降，幼稚M細胞無法分化成熟，導致攝取轉運腸腔內抗原能力下降[2].推測S100A4是調控M細胞成熟的重要的因子，通過S100A4-RelB-SOX8通路調控M細胞的成熟[2](如圖2所示).

圖2 M細胞分化的信號轉導通路分子機制圖.RANKL是M細胞分化的重要信號分子，非經典通路和經典通路均與之相關.S100A4蛋白是調控M細胞成熟的重要環(huán)境因子，可通過S100A4-RelB-SOX8通路，和RANKL共同調控M細胞的成熟.RANKL:核因子κB受體活化因子配體.

3 M細胞與免疫應答

M細胞的抗原攝取作用對特異性免疫應答至關重要.研究表明[25]，RANK-/-小鼠缺乏成熟M細胞，導致抗原攝取障礙和PPs中杯狀細胞(goblet cell，GC)減少，腸道固有層的免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)陽性B細胞減少，腸道中s-IgA含量下降[25].與RANK-/-小鼠相似，SOX8-/-小鼠IgA含量也減少，但IgA含量較RANK-/-小鼠減少程度更輕.在葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘導小鼠潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)模型和敗血癥小鼠模型中，NIK-/-小鼠缺乏成熟M細胞，IgA和白細胞介素17(interleukin17，IL-17)含量下降，IgA和IL-17含量下降會增加小鼠對UC和敗血癥的易感性[21]，提示M細胞和IgA、IL-17的分泌有關，M細胞相關的IgA、IL-17可以預防小鼠UC和敗血癥的發(fā)生.除此之外，M細胞的抗原攝取作用還有助于誘導全身性抗原特異性IgG反應.因此，M細胞不僅在腸道免疫應答中發(fā)揮作用，在全身免疫反應中也至關重要.

圖3 M細胞分化與成熟過程中重要的分子標志與模式圖.成熟M細胞由腸隱窩Lgr5+干細胞分化而來.Marckls1，Anxa5是早期的生物學標志，Spi-B，Sox8都表達后，GP2表達，GP2是M細胞成熟標志.Tnfaip2，CCL9在GP2之前表達.GP2:糖蛋白2.

4 M細胞與疾病

M細胞不僅可以啟動腸道免疫應答，還是病原體入侵機體的門戶.M細胞與許多疾病的發(fā)生都密切相關，這與它特殊的“囊袋狀”結構有關.該結構提高了M細胞攝取、轉運抗原的效率，同時也給病原體提供了侵襲人體的入口.結核病、朊蛋白病和克羅恩病(Crohn’s disease，CD)的發(fā)生都與M細胞密切相關.結核分枝桿菌(M.tuberculosis，Mtb)和朊病毒將M細胞作為入侵機體的靶點，CD患者免疫系統紊亂的加劇與M細胞有關.

4.1 M細胞與結核病 過去一直認為結核病開始于Mtb侵入肺泡巨噬細胞和樹突狀細胞，但是這種觀點缺乏數據支持.目前研究證實在活動性結核病病例中，大約10%只有頸部淋巴竇(cervical lymph nodes，cLN)感染，無肺部感染，這表明活動性結核病可能不需要肺部感染，因此肺部感染可能不是必須的[26].這個疑惑困擾著許多臨床醫(yī)務工作者.

眾所周知，Spi-B?/?小鼠GALT和NALT的成熟M細胞數量減少.給Spi-B?/?小鼠和WT小鼠分別接種相同劑量Mtb，7 d后發(fā)現，相較于野生型小鼠，Spi-B?/?小鼠cLN中的Mtb更少;WT小鼠和Spi-B?/?小鼠肺部都未檢測到Mtb[26].由此可見，成熟M細胞減少會抑制Mtb的轉運和擴散.為了探究WT小鼠M細胞受抑制后，Mtb的轉運擴散是否會受到抑制，使用WT小鼠注射抗小鼠RANKL單克隆抗體IK22-5，并且接種同等劑量的Mtb，發(fā)現cLN中Mtb數量只有開始接種的一半.由此推測，通過IK22-5抑制M細胞成熟可抑制Mtb從NALT向cLN擴散.因此，可以推斷出M細胞是Mtb入侵機體的門戶，這對于疫苗的研究也有著重大的意義，成為目前疫苗研究開發(fā)的熱點，受到科研工作者的關注[26].

4.2 M細胞與朊蛋白病 朊蛋白病是一種人類和多種動物均可患的傳染性退行性腦病，感染因子是朊病毒.宿主細胞正常朊蛋白(PrPC)的一級結構和朊蛋白(PrPSc)一級結構相同，PrPC錯誤折疊后轉變?yōu)镻rPSc，而且PrPSc會促使PrPC轉變成PrPSc[27].朊病毒病包括庫魯病(Kuru disease)、克雅氏綜合癥(Ceutzfeldt-jakob disease，CJD)、格斯特曼綜合癥(Gustman syndrome，GSS)及致死性家庭性失眠癥(fatal family insomnia，FFI).有研究表明M細胞是朊病毒從腸腔侵入PPs和各個器官的重要目標靶點.使用抗小鼠RANKL單克隆抗體處理IK22-5小鼠后，幼稚M細胞無法發(fā)育成熟[28].實驗動物口腔暴露朊病毒一段時間后，對照組PPs、MLNs和脾臟中檢測到大量PrPSc;而M細胞缺如的實驗組PPs、MLNs和脾臟中未檢測到PrPSc.341 d后，對照組小鼠死于朊蛋白病;454 d之前，實驗組小鼠均未出現朊病毒感染相關癥狀[28].上述實驗表明，M細胞的消除可阻止朊病毒的入侵和播散，阻止朊病毒對腦的損害.因此，腸道M細胞與朊病毒病原體的運輸和侵入人體有關[29].目前普遍認為M細胞是朊病毒入侵機體的靶點，但也成為研究和預防朊蛋白病的重要靶點.

4.3 M細胞與克羅恩病 CD是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)的一種.CD患者的固有免疫系統和適應性免疫系統紊亂，有研究表明[30]，40%病人體內出現胰腺自身抗體，而自身抗體的抗原恰恰是胰腺腺泡中的GP2.胰腺可以合成并分泌GP2，因此胰腺腺泡細胞中存在大量GP2，GP2還會隨著胰液進入腸腔[31].腸道免疫系統功能紊亂可能會促進GP2抗體的產生[32].炎癥性腸病產生炎癥性細胞因子，炎癥性細胞因子與M細胞的發(fā)育和功能密切相關.炎癥性細胞因子TNFα會誘發(fā)產生PP型M細胞[33].有研究證實CD患者結腸中M細胞數量明顯增加[34]，該變化提示隨著M細胞數量增加，其抗原呈遞能力升高可能會加強免疫系統對GP2自身抗體的應答.同時對患者結腸活組織進行單細胞轉錄分析，發(fā)現M細胞中Spi-B和Sox8的表達上調[35].全基因組關聯研究(GWAS)顯示，M細胞中IBD高度易感基因ccl20，nr5a2，jak2，ptger4，sh2b3，ahr表達上調[35];而缺乏M細胞時，小鼠出現嚴重的感染性結腸炎，腸道細菌出現多樣性的變化以及移位.由此可見，M細胞也是形成腸道屏障重要的調節(jié)者之一，在腸道穩(wěn)態(tài)的維持中不可或缺[36].M細胞的數量變化可作為IBD的臨床診斷指標[37].

5 結論

綜上所述，“囊袋狀”的M細胞其結構的特殊性決定功能的復雜性與多樣性.其攝取轉運腸腔抗原至抗原呈遞細胞，參與腸道和機體的免疫反應.同時，M細胞的分化受多種因子調控，其中RANKL最為重要.成熟的M細胞表面有多種生物學標志，其中GP2是M細胞成熟的標志.M細胞是多種病原體入侵機體的入口，因此M細胞是感染性疾病研究的重要靶點之一.M細胞不僅僅和腸道疾病相關，還和神經退行性腦病聯系密切，這提示M細胞對于機體健康不可忽視.當然，M細胞在疾病中更多細節(jié)性問題還有待進一步發(fā)現、研究和探討.