骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療阿爾茲海默病模型小鼠研究進(jìn)展

路亞嵐石桂英王克維白 琳

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京市人類重大疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型工程技術(shù)研究中心,北京 100021)

阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease, AD),又稱老年癡呆癥,是一種原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。 AD 是一種慢性疾病,患者處于無外顯癥狀的臨床前期時(shí)間約8~10 年,65 歲以上老人發(fā)病率約1%~3%[1]。 AD 的發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)呈逐漸上升趨勢(shì),據(jù)報(bào)道,70 歲以后年齡每增加5 歲,AD 的危險(xiǎn)性隨之增加1 倍[2]。 流行病學(xué)資料顯示,我國(guó)AD 患者人數(shù)已超過800 萬,約占全球的的1/5[3]。隨著我國(guó)人口老齡化程度的加劇,AD 成為繼心血管疾病、腫瘤和腦卒中之后的第4 位殺手。 AD 的主要臨床表現(xiàn)包括漸進(jìn)性記憶障礙、失語、失用、失認(rèn)、執(zhí)行功能障礙以及人格和行為改變,并伴隨有一系列精神病癥狀[4]。 隨著病情呈進(jìn)行性加重,后期患者幾乎無法正常思考和判斷,生活不能自理。確診AD 后,男性患者平均生存時(shí)間約4.2 年,女性患者約5.7 年[5]。 AD 的發(fā)生給患者及其家庭和社會(huì)帶來了巨大的身心痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[6]。

AD 發(fā)病機(jī)理復(fù)雜,其神經(jīng)病理學(xué)特征,主要包括老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)以及神經(jīng)元和突觸的丟失[7]。 老年斑以細(xì)胞外沉積的 β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein, Aβ)為核心,周圍是受損的軸突和樹突以及膠質(zhì)細(xì)胞;神經(jīng)原纖維纏結(jié)是由過度磷酸化的Tau 蛋白沉積所致,其主要聚集在神經(jīng)元胞內(nèi),此外也可在樹突和軸突聚集,分別形成纖維網(wǎng)線和老年斑炎冠。 AD 患者常常伴隨著神經(jīng)元和突觸的丟失,多見于顳頂葉和額葉及扣帶回部位[8-9]。這些病理特征導(dǎo)致腦神經(jīng)元結(jié)構(gòu)異常、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)破壞和神經(jīng)元信息交流障礙,是AD 患者認(rèn)知記憶功能障礙和精神行為異常的主要原因。

目前,AD 治療以膽堿酯酶抑制劑和N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDA)拮抗劑為主[10]。 前者主要通過降低乙酰膽堿的水解速度從而提高其在患者體內(nèi)的含量,后者通過抑制AD 患者過度激活的NMDA 受體、減少神經(jīng)元凋亡來發(fā)揮作用。 它們可維持退化的神經(jīng)元功能,但無再生修復(fù)功能,因此對(duì)于早期AD 患者的療效較好,但中晚期患者收效甚微,而且這些藥物治療并不能阻斷AD 病程進(jìn)展。 到目前為止,確診的AD 患者往往為中后期,且常伴隨多種代謝疾病,可用治療方法非常有限。 此外,中草藥物和針灸對(duì)AD 患者的臨床癥狀也有不同程度的緩解,主要通過調(diào)理機(jī)體代謝和營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)達(dá)到緩解癥狀的效果,但對(duì)AD 的治療并無針對(duì)性,且個(gè)體間療效差異較大[11-12]。 因此,進(jìn)一步研究AD 的新治療方法是臨床急需攻關(guān)的重大問題。

1 BM-MSCs 治療AD 模型小鼠的細(xì)胞和動(dòng)物模型概述

1.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特征

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell, MSCs)來源于中胚層,具有自我更新和多向分化潛能,且其免疫源性低,在再生醫(yī)學(xué)治療中作為“種子”細(xì)胞,是治療AD 的新型方法[13]。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BM-MSCs)來源于骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,作為最早被發(fā)現(xiàn)的MSCs,是探討 MSCs 應(yīng)用研究的“金標(biāo)準(zhǔn)”[14]。 BM-MSCs 分離操作簡(jiǎn)單,可體外培養(yǎng);它的免疫源性低,可異體移植,在動(dòng)物體內(nèi)長(zhǎng)期存活;而且它的應(yīng)用符合倫理要求,是干細(xì)胞治療中的理想選擇[4]。

進(jìn)一步深入研究發(fā)現(xiàn)BM-MSCs 具有歸巢性,移植后可轉(zhuǎn)移至損傷和炎癥部位,它不僅能向骨、軟骨和脂肪組織分化,還能在特定條件下分化為神經(jīng)樣細(xì)胞,可補(bǔ)充和替代已退化的神經(jīng)元,因此具有神經(jīng)元再生潛能。 近年來,研究顯示BM-MSCs 不僅可以激活小膠質(zhì)細(xì)胞、促進(jìn)吞噬 Aβ 蛋白并釋放Aβ降解酶以減少老年斑沉積,而且還可以通過促進(jìn)細(xì)胞自噬功能,增強(qiáng)對(duì)Aβ 蛋白的清除以延緩AD 的進(jìn)展[15]。 此外,BM-MSCs 可分泌多種生長(zhǎng)因子和抗炎因子,誘導(dǎo)血管生成和神經(jīng)發(fā)生,增加突觸連接,調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境,減少神經(jīng)元凋亡,維持神經(jīng)元活性[16]。 因此,BM-MSCs 不僅可預(yù)防/治療早期患者,對(duì)中晚期患者的治療也有廣闊的應(yīng)用前景。

1.2 BM-MSCs 治療常用的AD 模型動(dòng)物

目前,細(xì)胞移植治療中常用的AD 模型動(dòng)物主要模擬淀粉樣變性的病理特征,分為Aβ 誘導(dǎo)的AD模型動(dòng)物和遺傳修飾的模型動(dòng)物兩類。 Aβ 是老年斑的主要成分,在海馬/腦室注射聚集態(tài)Aβ(Aβ1-42,Aβ1-40,Aβ25-35)片段可導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡,引起膠質(zhì)細(xì)胞增生的炎癥反應(yīng)進(jìn)而產(chǎn)生淀粉樣變性,模擬老年斑的病理現(xiàn)象,形成學(xué)習(xí)記憶能力衰退的AD 動(dòng)物模型[17]。 該種造模方法操作簡(jiǎn)單,造模成功率高、穩(wěn)定性好且耗時(shí)短,不僅可用于小鼠,也可以用于大鼠模型構(gòu)建。 然而該方法在注射的過程中會(huì)難以避免造成腦組織穿透性機(jī)械損傷,造成不可預(yù)知的神經(jīng)功能受損。

細(xì)胞移植治療中常用的遺傳修飾的動(dòng)物模型為針對(duì)淀粉樣前蛋白(amyloid precursor protein,APP)、早老素1(presenilin-1, PS1)和相關(guān)基因突變體構(gòu)建的多重轉(zhuǎn)基因小鼠模型。 APPswe/PS1dE9(APPK670N,M671LPSEN1ΔE9, APP/PS1)雙轉(zhuǎn)小鼠是最常用的遺傳修飾AD 小鼠模型,該雙轉(zhuǎn)小鼠表達(dá)突變的APP 和PS1 融合體,4 月齡時(shí)皮層與海馬產(chǎn)生淀粉樣蛋白沉淀,7 月齡水迷宮實(shí)驗(yàn)中可檢測(cè)到認(rèn)知記憶功能障礙;三轉(zhuǎn)小鼠模型3×Tg(APPK670N,M671LPSEN1M146VMAPTP301L),6 月齡時(shí)皮層與海馬有彌散分布地堅(jiān)實(shí)淀粉樣蛋白沉積,6 月齡時(shí)通過水迷宮可觀察到認(rèn)知功能障礙;5×FAD(APPK670N,M671LAPPV717IAPPV716VPSEN1M146LPSEN1L286V)小鼠是攜帶5 個(gè)家族性基因突變的APP/PS1 的AD 轉(zhuǎn)基因小鼠,該種小鼠從2 個(gè)月起皮層即出現(xiàn)老年斑沉積,并隨著月齡逐漸增加,4~5 月齡時(shí)通過Y 迷宮可觀察到認(rèn)知功能障礙[18]。 迄今為止,尚未發(fā)現(xiàn)能夠完全模擬AD 的病理進(jìn)程的動(dòng)物模型。 因此,在具體的科學(xué)實(shí)踐中應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求和條件來選擇合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[19]。

2 BM-MSCs 治療AD 模型小鼠的效果、機(jī)理及其特點(diǎn)

2.1 BM-MSCs 直接移植治療AD 動(dòng)物模型

BM-MSCs 直接移植治療AD 動(dòng)物模型,通過水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BM-MSCs 治療組小鼠的潛伏期縮短、穿臺(tái)次數(shù)增加,空間學(xué)習(xí)記憶能力增強(qiáng),并接近對(duì)照野生型(wild type, WT)小鼠水平[20-21]。 結(jié)果顯示,BM-MSCs 可向損傷部位遷移,治療組小鼠皮層和海馬的淀粉樣蛋白沉積減少,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)Aβ降解酶增加,例如腦啡肽酶(neprilysin),Aβ 周圍小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加,海馬內(nèi)新生血管數(shù)量增加,它們可促進(jìn)Aβ 的降解和轉(zhuǎn)運(yùn)。 同時(shí),BM-MSCs 減少APP/PS1 小鼠腦內(nèi)Tau 蛋白的磷酸化水平[22-23]。也有研究發(fā)現(xiàn)BM-MSCs 可調(diào)控微環(huán)境的免疫活性,Lee 等[24]發(fā)現(xiàn)BM-MSCs 可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活,其中炎癥因子腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor α, TNFα),白細(xì)胞介素 1β(interleukin 1β,IL1β)表達(dá)降低,抗炎因子白細(xì)胞介素(interleukin 10,IL10)表達(dá)增加。 Garcia 等[25]發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象,BM-MSCs 治療組小鼠海馬區(qū)的老年斑顯著減少,并伴隨著星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著減少。BM-MSCs 還可通過分泌因子調(diào)控神經(jīng)元活性,據(jù)報(bào)道發(fā)現(xiàn)BM-MSCs 通過下調(diào)核因子E2 相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2, Nrf2)表達(dá),降低氧化應(yīng)激水平,減少神經(jīng)元凋亡;也可通過上調(diào)營(yíng)養(yǎng)因子,例如:腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF),神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表達(dá),增加神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN 的陽性細(xì)胞數(shù)量,促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)。 此外,還可通過減少乙酰膽堿和多巴胺的表達(dá),促進(jìn)谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)。 在分子通路水平上,BM-MSCs 移植治療組可上調(diào)糖原合成酶激酶-3(Glycogen synthase kinase 3 beta, GSK-3β)表達(dá)量,激活Wnt 信號(hào)通路,促進(jìn)海馬區(qū)神經(jīng)發(fā)生,增進(jìn)神經(jīng)元內(nèi)源性修復(fù)[26]。 基于臨床前動(dòng)物模型的良好療效,國(guó)際上開展了多項(xiàng)AD 治療的臨床實(shí)驗(yàn),其中美國(guó)開展了兩項(xiàng)同種異體BM-MSCs 治療AD 的臨床研究,目前兩者分別處于在1 期和2 期階段(NCT02600130 和 NCT02833792)[27]。

隨著細(xì)胞傳代培養(yǎng),BM-MSCs 逐漸出現(xiàn)衰老表型,傳代次數(shù)對(duì)BM-MSCs 的干性特征和分泌因子有顯著影響,衰老死亡的BM-MSCs 將喪失治療能力。全骨髓貼壁法分離的小鼠BM-MSCs 在第4 代可保持較好形態(tài)和多向分化能力。 然而,隨著傳代次數(shù)進(jìn)一步增加,BM-MSCs 會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)速度緩慢、核固縮、脫離等衰老特征。 大鼠BM-MSCs 的表面抗原CD29、 CD44 和CD90 表達(dá)隨傳代次數(shù)逐漸增加,經(jīng)過5~6 代后達(dá)到頂峰,之后開始逐漸下降。 人源BM-MSCs 隨著傳代次數(shù)增加,其增殖能力和分化能力也均降低[28]。 梁維等發(fā)現(xiàn)第6 代的BM-MSCs 向神經(jīng)干方向分化能力最強(qiáng)[29],一般認(rèn)為7 代之前的BM-MSCs 有較強(qiáng)干細(xì)胞活性,適用于移植治療研究。

2.2 基因修飾的 BM-MSCs 移植治療 AD 小鼠模型

隨著對(duì)AD 發(fā)病機(jī)理研究和認(rèn)識(shí)的不斷深入,眾多參與AD 發(fā)生發(fā)展過程的重要調(diào)控蛋白、RNA分子被相繼發(fā)現(xiàn)。 BM-MSCs 可作為一種新型基因治療的載體細(xì)胞,通過基因修飾方法對(duì)其進(jìn)行改造,將基因治療與細(xì)胞治療相結(jié)合,使BM-MSCs 和調(diào)控分子的效應(yīng)疊加,更能有效緩解/阻止甚至逆轉(zhuǎn)AD 的發(fā)展進(jìn)程。 目前研究比較多的調(diào)控分子主要包括具有調(diào)控神經(jīng)元生長(zhǎng)和膠質(zhì)細(xì)胞活性的分泌因子和非編碼RNA。 BM-MSCs 的基因修飾方法包括電轉(zhuǎn)導(dǎo)入、病毒導(dǎo)入以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物直接分離。 其中,盡管病毒載體介導(dǎo)的基因修飾方法具有較高的潛在成瘤風(fēng)險(xiǎn),但因其操作簡(jiǎn)便,在臨床前實(shí)驗(yàn)中可進(jìn)行相關(guān)探索性研究。 據(jù)報(bào)道,基因修飾后的BM-MSCs 治療AD 的副反應(yīng)和成瘤能力可能高于單純的BM-MSCs 細(xì)胞;因此,對(duì)其安全性進(jìn)行充分驗(yàn)證將是后續(xù)研究工作的重點(diǎn)之一。 另外,導(dǎo)入目標(biāo)基因的BM-MSCs 所處的代數(shù)會(huì)相應(yīng)增加,干細(xì)胞的干性特征、生長(zhǎng)特征以及分泌特征等會(huì)受到影響,在實(shí)踐中應(yīng)予以充分驗(yàn)證和考量。

Garcia 等[25]在過表達(dá) VEGF 的 BM-MSCs 治療APP/PS1 小鼠的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),治療6 月齡AD 小鼠模型,潛伏期 WT ≈ AD (VEGF-BM-MSCs) < AD(BM-MSCs)

2.3 BM-MSCs 源外泌體治療AD 動(dòng)物模型

近年來,作為脫細(xì)胞治療手段,源于干細(xì)胞的囊泡外泌體引起學(xué)者的廣泛關(guān)注。 外泌體由磷脂雙分子層包繞可溶性物質(zhì)組成的復(fù)雜混合內(nèi)容物構(gòu)成,直徑為30~150 nm[32]。 由于其可攜帶多種生物活性物質(zhì)(蛋白質(zhì)、DNA 和RNA 等),通過膜融合或內(nèi)吞作用被受體細(xì)胞攝取,穿過血腦屏障,作用于神經(jīng)元及其微環(huán)境中的多種細(xì)胞[33]。 外泌體攜帶的多種生物活性物質(zhì),可參與機(jī)體正常的生理功能及多種疾病的病理進(jìn)程[29]。 因此,外泌體可規(guī)避傳統(tǒng)BM-MSCs 應(yīng)用中的局限性,外源性分離或者修飾外泌體內(nèi)容物有望成為理想的“脫細(xì)胞”治療手段。

Perets 等[34]在AD 小鼠注射了分離自 MSCs 的外泌體,24 h 后,實(shí)驗(yàn)人員觀察發(fā)現(xiàn)外泌體具有向神經(jīng)損傷區(qū)域遷移和歸巢的能力,該功能與神經(jīng)免疫反應(yīng)的趨化能力密切關(guān)聯(lián)。 Reza-Zaldivar 等[35]發(fā)現(xiàn)來源于MSCs 的外泌體可增強(qiáng)神經(jīng)的可塑性,減緩Aβ 誘導(dǎo)的AD 小鼠認(rèn)知障礙,進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外泌體激活了SVZ 區(qū)的神經(jīng)元生成,減少Aβ 淀粉樣蛋白的沉積。 Xin 等[36]將從BM-MSCs 中超速離心分離的外泌體移植入中風(fēng)的大鼠模型中,發(fā)現(xiàn)BM-MSCs 神經(jīng)損傷得到緩解,這些外泌體中包含可以促進(jìn)Aβ 蛋白降解的血清胱抑素C(Cystatin C)。外泌體還可通過將Aβ 轉(zhuǎn)運(yùn)至小膠質(zhì)細(xì)胞的溶酶體中促進(jìn)Aβ 清除;此外,外泌體能夠通過釋放腦啡肽酶/miRNA/鞘磷脂激活蛋白等多種方式營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元[37-40],從而改善認(rèn)知功能。 Nakano 等[41]發(fā)現(xiàn)BM-MSCs 來源的外泌體可轉(zhuǎn)移入損傷的神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞。 多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)外泌體攜帶的多種活性物質(zhì),尤其是小RNA(MicroRNA, miRNA),在調(diào)控靶基因表達(dá),增進(jìn)治療效果方面有重要作用[42]。

BM-MSCs 在移植治療中可能出現(xiàn)細(xì)胞排斥和血栓形成等風(fēng)險(xiǎn),但其衍生的外泌體有如下優(yōu)勢(shì):(1)體積較小,可通過血腦屏障,生物利用率高;(2)便于改造,使其大量攜帶目標(biāo)的治療效應(yīng)因子;(3)可通過改造膜表面的受體-配體,定向某類細(xì)胞,靶向給藥;(4)可通過靜脈常規(guī)性給藥,為藥物研發(fā)提供了便利;(5)其納米級(jí)尺寸,在給藥中降低了微血管血栓形成的可能性[43]。

盡管外泌體在AD 的診斷和治療中優(yōu)勢(shì)顯著,但將其應(yīng)用于臨床仍有諸多問題需要解決,包括:(1)精確誘導(dǎo)細(xì)胞分泌含特定物質(zhì)的外泌體的機(jī)制和方法尚未明確;(2)如何最大效率地將生物活性物質(zhì)加載到外泌體中;(3)如何使外泌體選擇性地靶向細(xì)胞并精確釋放其內(nèi)容物;(4)應(yīng)用外泌體治療的生物安全性也需要進(jìn)一步的明確;(5)如何簡(jiǎn)便的獲得大量外泌體。 綜上,外泌體在AD 治療中的作用及其機(jī)制的研究將為阿爾茲海默病的診斷和治療提供新的方向。

3 BM-MSCs 治療阿爾茲海默病模型小鼠的展望

BM-MSCs 用于AD 的模型小鼠治療已經(jīng)有數(shù)十年的歷史,積累了大量的經(jīng)驗(yàn)。 數(shù)據(jù)顯示BM-MSCs可緩解多種 AD 模型小鼠認(rèn)知功能障礙,但 BMMSCs 應(yīng)用于臨床還需要克服諸多問題,主要包括以下幾個(gè)方面:(1)規(guī)范移植細(xì)胞/外泌體使用方案:目前大量的臨床前期研究中,細(xì)胞/外泌體的質(zhì)量要求和數(shù)量使用比較混亂,缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。 隨著大量BM-MSCs 研究的開展,應(yīng)制定統(tǒng)一的指導(dǎo)方案,既有助于多項(xiàng)研究的橫向比較,為臨床試驗(yàn)開展提供可靠的數(shù)據(jù)支撐,也會(huì)避免不必要的重復(fù)和浪費(fèi)。 (2)確定干細(xì)胞輸送到目標(biāo)腦區(qū)的給藥方式:目前治療AD 動(dòng)物模型的給藥方式包括腦立體定位注射和尾靜脈注射兩種,其中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中以腦立體定位注射海馬區(qū)居多,在功能區(qū)達(dá)到較高的細(xì)胞濃度,用于探索BM-MSCs 的治療效果。 該種方法為損傷性操作,一般單次治療,在臨床應(yīng)用中有一定的局限性。 此外,研究者通過尾靜脈多次注射BM-MSCs 治療AD 小鼠模型,也可在一定程度緩解AD 小鼠癥狀,但該方法的優(yōu)化和療效收益需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和評(píng)估。 近期,Santamaria 等[44]發(fā)現(xiàn)鼻腔內(nèi)移植的MSCs 分泌物也可以緩解AD 小鼠的認(rèn)知障礙,該方法是一種非侵入性方法,且可多次吸入給藥,損傷較小,但文獻(xiàn)報(bào)道較少,可作為新的備選方法在科學(xué)實(shí)踐中確定其有效性和穩(wěn)定性;(3)進(jìn)一步評(píng)價(jià)BM-MSCs 使用安全性:干細(xì)胞治療的安全性是和有效性同等重要的問題,有研究發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞治療帕金森病時(shí),多只大鼠死于干細(xì)胞形成的腫瘤,因此,包括BM-MSCs 在內(nèi)的干細(xì)胞治療應(yīng)該對(duì)于潛在的危險(xiǎn)性充分論證,才能應(yīng)用于臨床實(shí)踐[45-46]。 盡管BM-MSCs 走向臨床還有一段距離,隨著其治療AD 的機(jī)制進(jìn)一步被披露,安全性得到進(jìn)一步驗(yàn)證,以及實(shí)驗(yàn)條件的日益成熟,BM-MSCs定將為MSCs 治療AD 和其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療做出巨大的貢獻(xiàn)。