背根神經(jīng)節(jié)在藥物神經(jīng)毒性體外評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

王美婷，趙 琪，張藝哲，邢紅艷，汪溪潔

（中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院，上海益諾思生物技術(shù)股份有限公司，上海 201203）

藥物誘導(dǎo)的嚴(yán)重神經(jīng)毒性是導(dǎo)致新藥研發(fā)失敗的原因之一。由于動(dòng)物模型在藥物神經(jīng)毒性評(píng)價(jià)和機(jī)制研究等方面存在諸多不足，如種屬和遺傳背景差異大、周期長(zhǎng)和費(fèi)用高，藥物神經(jīng)毒性研究的模型逐漸從體內(nèi)動(dòng)物模型向體外細(xì)胞模型轉(zhuǎn)變［1］。背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）神經(jīng)元接收機(jī)體的感覺(jué)信息并向脊髓傳遞，已作為體外細(xì)胞模型廣泛應(yīng)用于藥物神經(jīng)毒性研究。隨著細(xì)胞重編程和干細(xì)胞分化技術(shù)的發(fā)展，人多能干細(xì)胞（human pluripotent stem cells，hPSC）分化和成纖維細(xì)胞重編程的DRG神經(jīng)元在藥物神經(jīng)毒性研究的應(yīng)用也開始備受關(guān)注［2］。本文綜述不同來(lái)源的DRG神經(jīng)元體外模型的特點(diǎn)，以及采用DRG神經(jīng)元開展藥物神經(jīng)毒性體外評(píng)價(jià)的最新進(jìn)展。

1 背根神經(jīng)節(jié)概述

DRG來(lái)源于神經(jīng)嵴的前體細(xì)胞，屬于外周感覺(jué)神經(jīng)節(jié)，其中的DRG神經(jīng)元為假單極神經(jīng)元，由多種感覺(jué)神經(jīng)元亞型組成，具有將疼痛、溫度和壓力等感覺(jué)刺激信號(hào)向中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳遞的功能。根據(jù)形態(tài)和功能的不同，DRG神經(jīng)元可分為傷害性神經(jīng)元和非傷害性神經(jīng)元［3］。

1.1 傷害性神經(jīng)元

傷害性DRG神經(jīng)元支配上皮和肌肉等組織，能對(duì)疼痛、瘙癢和溫度變化等刺激做出反應(yīng)［4］。傷害性神經(jīng)元直徑較小，多為無(wú)髓C纖維感覺(jué)神經(jīng)元和薄髓Aδ纖維感覺(jué)神經(jīng)元，表達(dá)原肌球蛋白相關(guān)激酶A（tropomyosin-related kinase A，TrkA），對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)因子具有高親和力，釋放谷氨酸作為主要的神經(jīng)遞質(zhì)，可進(jìn)一步分為肽能神經(jīng)元和非肽能神經(jīng)元［5］。肽能神經(jīng)元釋放P物質(zhì)和降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）等神經(jīng)肽，而非肽能神經(jīng)元?jiǎng)t主要表達(dá)同工凝集素B4（isolectin B4），同工凝集素B4可特異性地與傳遞傷害性刺激信號(hào)的周圍感覺(jué)神經(jīng)元相結(jié)合［6-7］。

1.2 非傷害性神經(jīng)元

非傷害性DRG神經(jīng)元主要分為本體感受和機(jī)械感受2種類型。本體感受型神經(jīng)元由厚髓Aα和Aβ纖維組成，傳導(dǎo)速度很快，可感知肌收縮和肢體位置［8］，平衡感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)，表達(dá)TrkC，可被神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3激活［9］。大部分投射到皮膚的表皮和真皮區(qū)域的非傷害性DRG神經(jīng)元是機(jī)械感受型，其通過(guò)特有的感覺(jué)神經(jīng)末梢傳導(dǎo)機(jī)械刺激信號(hào)［8］。機(jī)械感受型神經(jīng)元由厚髓Aβ纖維組成，以表達(dá)TrkB為特征，對(duì)腦源性生長(zhǎng)因子（brainderived growth factor）具有高度親和力，支配皮膚組織并傳遞皮膚的觸覺(jué)和振動(dòng)刺激信號(hào)等非傷害性刺激信號(hào)［10］。

2 背根神經(jīng)節(jié)體外模型來(lái)源

DRG神經(jīng)元是感覺(jué)信息傳入的初級(jí)神經(jīng)元，目前研究中所采用的DRG神經(jīng)元可直接來(lái)源于嚙齒類動(dòng)物、非嚙齒類動(dòng)物和人，也可間接來(lái)源于成纖維細(xì)胞和人多能干細(xì)胞。

2.1 直接來(lái)源的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元

2.1.1 嚙齒類動(dòng)物

嚙齒類動(dòng)物DRG神經(jīng)元來(lái)源廣泛，是研究基本的信號(hào)通路、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和疾病發(fā)生機(jī)制的重要工具［11］。然而嚙齒類動(dòng)物與人類遺傳背景不同，其實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)外推至人的可靠性有限，因而探討嚙齒類動(dòng)物DRG神經(jīng)元與人類DRG神經(jīng)元之間的差異和相似性尤為重要［12］。Rostock 等［13］觀察到，TrkB 和TrkC在人和小鼠的DRG神經(jīng)元中的表達(dá)相似，而TrkA和瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）在人和小鼠DRG神經(jīng)元中的表達(dá)存在顯著差異。Li等［14］發(fā)現(xiàn)，約46%小鼠DRG神經(jīng)元表達(dá)重多肽神經(jīng)絲蛋白（neurofilament heavy polypeptide），而 97.3% 人DRG神經(jīng)元表達(dá)［13］。與人DRG神經(jīng)元相比，嚙齒類動(dòng)物DRG神經(jīng)元Nav1.8通道表現(xiàn)出更快的失活動(dòng)力學(xué)、更小的電流以及更低的神經(jīng)元放電頻率［15］。此外，人DRG神經(jīng)元大多可同時(shí)表達(dá)CGRP和P2X3受體，而小鼠DRG神經(jīng)元?jiǎng)t只能表達(dá)單一受體［16］。因此，研究者采用嚙齒類動(dòng)物模型研究這些指標(biāo)時(shí)，應(yīng)格外注意種屬差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響。

2.1.2 非嚙齒類動(dòng)物

當(dāng)前，犬、兔和猴等非嚙齒類動(dòng)物來(lái)源的DRG神經(jīng)元研究較少，在某些方面，非嚙齒類動(dòng)物DRG神經(jīng)元與人DRG神經(jīng)元更相似，如犬DRG神經(jīng)元中神經(jīng)節(jié)苷脂的新陳代謝與人DRG神經(jīng)元中的更相似［17］。有研究表明，對(duì)于一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病比如萊姆?。↙yme disease），伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi）在恒河猴中的感染與人類萊姆病的早期傳播相似，因此恒河猴DRG神經(jīng)元是研究萊姆病發(fā)生機(jī)制及防治的經(jīng)典模型［18-19］。此外，犬DRG神經(jīng)元對(duì)辣椒素和異硫氰酸烯丙酯（allyl-isothiocy?anate）比嚙齒類動(dòng)物DRG神經(jīng)元更敏感，表明嚙齒類與非嚙齒類動(dòng)物DRG神經(jīng)元之間存在差異［20］。相較于嚙齒類動(dòng)物，非嚙齒類動(dòng)物因壽命更長(zhǎng)、環(huán)境暴露和自發(fā)的疾病情況與人類更接近等因素，在藥物神經(jīng)毒性等研究中轉(zhuǎn)化為臨床研究更具有優(yōu)勢(shì)［20］。

2.1.3 人類

實(shí)驗(yàn)室很難獲得人外周神經(jīng)組織，不僅是因?yàn)镈RG中含有許多感覺(jué)神經(jīng)元，在傳遞疼痛信息方面發(fā)揮重要作用，很難甚至不可能從活體獲得DRG神經(jīng)元，且還涉及倫理問(wèn)題［13］。Davidson等［21］研究發(fā)現(xiàn)，中小型DRG神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢怀掷m(xù)時(shí)間長(zhǎng)，可能是由鈣和鈉通道內(nèi)流引起，且人DRG神經(jīng)元中的大多數(shù)神經(jīng)元可對(duì)異硫氰酸烯丙酯、組胺和氯喹等致敏原產(chǎn)生反應(yīng)。電壓門控鈉離子通道在DRG神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏漠a(chǎn)生中具有關(guān)鍵作用。Chang等［22］發(fā)現(xiàn)，在人DRG神經(jīng)元中，Nav1.7通道表達(dá)約占電壓門控鈉離子通道表達(dá)的50%，而Nav1.8通道表達(dá)較低，約占12%。目前應(yīng)用人DRG神經(jīng)元的研究數(shù)量有限，其替代模型的研究至關(guān)重要［23］。

2.2 間接來(lái)源的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元

2.2.1 多能干細(xì)胞

hPSC是能分化為人體所有細(xì)胞類型的干細(xì)胞，包括人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells，hESC）和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSC）2大類。Alshawaf等［24］對(duì)hESC分化的DRG神經(jīng)元形態(tài)和功能研究發(fā)現(xiàn)，hESC分化的DRG神經(jīng)元能夠表達(dá)感覺(jué)神經(jīng)元標(biāo)志物大腦-特定同源框/POU結(jié)構(gòu)域蛋白3A（brain-specific homeobox/POU domain protein 3A）和ISL LIM同源框蛋白1（ISL LIM homeo?box 1），分化后約12 d開始出現(xiàn)自發(fā)放電，隨后放電率（spike rate，SR）繼續(xù)增加，分化約6周時(shí)SR達(dá)最大，為（258.2±102.5）-1。然而，由于hESC可能引起倫理爭(zhēng)議，近些年一些研究者轉(zhuǎn)向hiPSC的研究并成功分化得到外周神經(jīng)元［25-26］。Chambers等［27］采用小分子抑制劑組合（SU5402，HIR99021和DAPT等）將hiPSC誘導(dǎo)分化為外周神經(jīng)元，此后這種方法被許多研究者優(yōu)化改進(jìn)，如改變小分子抑制劑的濃度或增加神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3以提高分化效率，用以開展疼痛體外表型篩選及藥物神經(jīng)毒性評(píng)價(jià)等研究［28］。當(dāng)前也有公司推出商業(yè)化的hiPSC分化的外周神經(jīng)元產(chǎn)品，如Ncardia公司的Peri.4U。盡管hPSC分化的神經(jīng)元可大量獲取，但hPSC在分化過(guò)程中很可能出現(xiàn)異源細(xì)胞，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這一點(diǎn)需要引起研究者的重視［29］。

2.2.2 成纖維細(xì)胞

除干細(xì)胞分化可得到DRG神經(jīng)元外，成纖維細(xì)胞也可直接重編程為DRG神經(jīng)元。2015年，Blanchard等［30］采用與DRG神經(jīng)元相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子將人和小鼠的成纖維細(xì)胞直接重編程為DRG神經(jīng)元，這些神經(jīng)元具有感覺(jué)神經(jīng)元的形態(tài)和電生理活性，并與內(nèi)源性感覺(jué)神經(jīng)元的特征基因和受體表達(dá)一致，如重編程獲得的神經(jīng)元選擇性表達(dá)Trk。在成纖維細(xì)胞重編程過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄因子的選擇至關(guān)重要。Wainger等［31］從12種候選轉(zhuǎn)錄因子中選出5種轉(zhuǎn)錄因子 ASCL1，MYT1L，KLF7，NGN1和ISL2用于成纖維細(xì)胞的重編程，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)重編程得到的DRG神經(jīng)元能表達(dá)Nav1.8、TRPV1和瞬時(shí)受體電位錨蛋白1（transient receptor potential ankyrin 1，TRPA1）等通道。在成纖維細(xì)胞重編程的過(guò)程中很少出現(xiàn)異源細(xì)胞，避免了干細(xì)胞分化過(guò)程中可能出現(xiàn)的致瘤性問(wèn)題［3，32］。

2.3 背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元體外模型的優(yōu)勢(shì)和局限性

早期大部分研究采用的DRG神經(jīng)元均來(lái)源于動(dòng)物模型，近年來(lái)研究更為廣泛的為hPSC分化和人成纖維細(xì)胞重編程獲得的DRG神經(jīng)元［33］。相較于動(dòng)物模型，體外間接來(lái)源的DRG神經(jīng)元與人DRG神經(jīng)元更接近，可著減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用，滿足動(dòng)物福利的要求，有望更好地代替人DRG神經(jīng)元用于藥物高通量篩選、神經(jīng)毒性評(píng)價(jià)和疾病模型建立等［28，34-35］。與此同時(shí)，間接獲得DRG神經(jīng)元的過(guò)程也有一些亟待解決的問(wèn)題，如分化或重編程方案、外周神經(jīng)元亞型的軸突髓鞘化以及DRG神經(jīng)元的分化效率等［25，36］。另一個(gè)需要考慮的問(wèn)題是需要比較體外外周神經(jīng)元與人DRG神經(jīng)元的一致性，未來(lái)需要繼續(xù)優(yōu)化分化或重編程方案以減少兩者間的差異［3］。

3 背根神經(jīng)節(jié)在藥物神經(jīng)毒性研究中的應(yīng)用

由于缺乏有效的屏障保護(hù)，以及周圍分布的豐富毛細(xì)血管，DRG神經(jīng)元易受到藥物誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性損害［37］。目前臨床許多藥物在發(fā)揮治療作用同時(shí)也會(huì)引起神經(jīng)毒性不良反應(yīng)，其中以抗腫瘤藥、鎮(zhèn)痛藥和麻醉藥最多。不同化合物的神經(jīng)毒性機(jī)制不同，在新藥研發(fā)早期，及時(shí)發(fā)現(xiàn)候選化合物引起神經(jīng)毒性的潛在風(fēng)險(xiǎn)至關(guān)重要。

3.1 抗腫瘤藥

DRG神經(jīng)元體外模型在抗腫瘤藥誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性研究中應(yīng)用廣泛，目前已用于藥物高通量篩選、神經(jīng)毒性評(píng)價(jià)和毒性機(jī)制研究［38-40］。近年來(lái)，體外間接獲得的DRG神經(jīng)元備受關(guān)注，有研究者采用hPSC分化的神經(jīng)元評(píng)價(jià)化療藥物誘導(dǎo)的外周神經(jīng)毒性（chemotherapy-induced peripheral neuro?toxicity，CIPN），并且篩選出具有CIPN風(fēng)險(xiǎn)的抗腫瘤藥，降低了臨床神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)的發(fā)生率［41-42］。然而，間接來(lái)源的DRG神經(jīng)元，尤其是重編程獲得的DRG神經(jīng)元，在CIPN機(jī)制研究中的應(yīng)用還比較少，未來(lái)還具有很大的研究空間。

Hoelting等［43］應(yīng)用hPSC分化的DRG神經(jīng)元模型成功建立了識(shí)別外周神經(jīng)毒性化合物的高通量篩選系統(tǒng)，其中DRG神經(jīng)元模型的來(lái)源以及高通量篩選方法的選擇對(duì)CIPN高通量篩選具有重要影響。Wing等［44］通過(guò)細(xì)胞活力、高內(nèi)涵成像和微電極陣列（microelectrode array，MEA）技術(shù)比較hiPSC分化的皮質(zhì)神經(jīng)元和DRG神經(jīng)元對(duì)順鉑和硼替佐米等抗腫瘤藥的敏感性，結(jié)果表明，hiPSC分化的DRG神經(jīng)元模型用于CIPN評(píng)價(jià)的敏感性和準(zhǔn)確性更高，同時(shí)進(jìn)一步證實(shí)了DRG神經(jīng)元為抗腫瘤藥誘發(fā)外周神經(jīng)毒性的靶點(diǎn)。此外，有研究表明，DRG神經(jīng)元細(xì)胞膜上離子通道改變能引起神經(jīng)元興奮性增高，而神經(jīng)元興奮性增高是CIPN發(fā)生的重要機(jī)制［45］。Li等［46］發(fā)現(xiàn)，紫杉醇可引起大鼠和人DRG神經(jīng)元中Nav1.7通道表達(dá)上調(diào)，引起DRG神經(jīng)元興奮性增高，從而產(chǎn)生外周神經(jīng)毒性。此外，CIPN在線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥和膠質(zhì)細(xì)胞等方面也有很多相關(guān)機(jī)制研究［47-49］。

3.2 鎮(zhèn)痛藥

有文獻(xiàn)報(bào)道，DRG神經(jīng)元是鎮(zhèn)痛藥發(fā)揮作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)，對(duì)新型鎮(zhèn)痛藥的研發(fā)具有重要作用［50］。DRG神經(jīng)元表達(dá)的Nav1.7通道與疼痛的發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)，選擇性阻斷Nav1.7通道能增加DRG神經(jīng)元的放電閾值，并引起CGRP遞質(zhì)釋放減少［51］。此外，TRPV1和TRPA1通道在DRG神經(jīng)元中表達(dá)較多，炎癥和神經(jīng)損傷會(huì)改變DRG神經(jīng)元內(nèi)TRPV1和TRPA1的表達(dá)和功能，從而產(chǎn)生慢性疼痛［52-53］。目前一些TRP通道拮抗劑已作為鎮(zhèn)痛藥進(jìn)行研發(fā)，如一些強(qiáng)效的小分子TRPA1通道拮抗劑已進(jìn)入治療神經(jīng)性疼痛的臨床試驗(yàn)，TRPM8通道拮抗劑也用于治療冷觸痛［54-55］。除DRG神經(jīng)元的鈉離子通道、TRP通道和炎癥反應(yīng)參與疼痛機(jī)制研究外，膠質(zhì)細(xì)胞和交感神經(jīng)機(jī)制也在一定程度上參與了疼痛。目前以DRG神經(jīng)元為靶點(diǎn)的基因治療和干細(xì)胞療法在鎮(zhèn)痛藥研發(fā)上已取得一定進(jìn)展，但仍存在許多挑戰(zhàn)，如干細(xì)胞的再生、修復(fù)和鎮(zhèn)痛作用仍不確定［56］。

3.3 麻醉藥

全身麻醉藥的應(yīng)用可能會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重不可逆的神經(jīng)毒性，也會(huì)對(duì)患者的神經(jīng)行為造成嚴(yán)重影響。局部麻醉藥如利多卡因、羅哌卡因和布比卡因在臨床上也可能引起外周神經(jīng)毒性，已有研究者應(yīng)用嚙齒類動(dòng)物DRG神經(jīng)元對(duì)局麻藥引起的神經(jīng)毒性進(jìn)行機(jī)制研究［57］。敲除鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱβ亞型基因可保護(hù)DRG神經(jīng)元免受羅哌卡因誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的影響，提高細(xì)胞存活率，減少細(xì)胞凋亡，并使T型電壓門控鈣離子通道的表達(dá)下調(diào)［58］。另外，Zhang等［59］采用小鼠 DRG 神經(jīng)元模型探討腫瘤壞死因子信號(hào)通路在布比卡因誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性中的作用，研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子-α對(duì)防治麻醉藥引起的DRG神經(jīng)元凋亡損傷具有關(guān)鍵作用。當(dāng)前已有多種手段可減輕麻醉藥誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性，如下調(diào)微RNA或應(yīng)用蟲草素等［60］。未來(lái)更多不同來(lái)源的DRG神經(jīng)元模型還可用于研究麻醉藥誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性，為臨床安全用藥提供參考。

3.4 其他

上述3類藥物在臨床上均有明顯的外周神經(jīng)毒性癥狀，且已有基于DRG神經(jīng)元模型的毒性評(píng)價(jià)和機(jī)制研究的相關(guān)報(bào)道，然而有關(guān)其他藥物的報(bào)道很少，可能是因?yàn)镈RG神經(jīng)元僅針對(duì)于藥物誘導(dǎo)的外周神經(jīng)毒性，對(duì)藥物誘導(dǎo)的中樞神經(jīng)毒性不適用。目前僅發(fā)現(xiàn)吡哆醇可引起DRG神經(jīng)元壞死和周圍感覺(jué)纖維退化，其引起的神經(jīng)病變的癥狀與CIPN相似［61］。另外，DRG神經(jīng)元也已用于一些化合物誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性研究，如研究發(fā)現(xiàn)甲基汞對(duì)大鼠DRG神經(jīng)元的外周神經(jīng)毒性與小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的增加與施萬(wàn)細(xì)胞的增殖有關(guān)［62］。

4 結(jié)語(yǔ)

DRG神經(jīng)元是研究藥物神經(jīng)毒性尤其是外周神經(jīng)毒性重要的體外模型，在藥物篩選、毒性評(píng)價(jià)和機(jī)制研究等多方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。近年干細(xì)胞分化和成纖維細(xì)胞重編程領(lǐng)域的快速發(fā)展，使研究者可獲得大量的hPSC和成纖維細(xì)胞來(lái)源的DRG神經(jīng)元，為藥物神經(jīng)毒性的研究提供了充足且可靠的體外DRG神經(jīng)元模型［3］。然而，在體外DRG神經(jīng)元能完全模擬人DRG神經(jīng)元之前，仍然存在許多困難，干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化方案、成纖維細(xì)胞的重編程方法以及DRG神經(jīng)元的純度仍需不斷優(yōu)化，DRG神經(jīng)元的應(yīng)用領(lǐng)域可進(jìn)一步擴(kuò)展，藥物外周神經(jīng)毒性機(jī)制研究還有待加強(qiáng)。未來(lái)還需要增強(qiáng)新型體外神經(jīng)毒性研究模型的驗(yàn)證，使神經(jīng)毒性相關(guān)指標(biāo)的研究更加標(biāo)準(zhǔn)和全面，從而更加準(zhǔn)確、靈敏地預(yù)測(cè)候選化合物神經(jīng)毒性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究和臨床試驗(yàn)研究提供參考。