黃芪主要活性成分對糖尿病腎病的療效機制研究進展

倪慧明，董哲毅，陳香美*

1廣東藥科大學中藥學院，廣州 510006；2解放軍總醫(yī)院腎臟病科/解放軍腎臟病研究所/腎臟疾病國家重點實驗室/國家慢性腎病臨床醫(yī)學研究中心/腎臟疾病研究北京市重點實驗室，北京 100853

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是典型的糖尿病微血管病變[1]，也是糖尿病最常見的并發(fā)癥[2]。近年來，DN的發(fā)病率急劇增高，1980－2019年中國約有21.8%的2型糖尿病患者罹患DN[3]。DN臨床上常表現(xiàn)為尿白蛋白水平升高及腎小球濾過率降低，其機制為血流動力學的改變及腎小球濾過屏障受損[4-5]。DN患者的入球小動脈擴張及出球小動脈阻力增加，使腎小球呈高灌注、高濾過狀態(tài)，從而導致腎小球系膜細胞增生、基底膜增厚，腎小球硬化伴結節(jié)性系膜病變等組織病理學改變[6]。目前，血管緊張素轉換酶抑制劑及血管緊張素受體阻滯劑的應用是延緩DN進程的重要手段，但仍然有較多患者繼續(xù)進展至終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)[7]。新近的研究表明，鈉-葡萄糖共轉運蛋白2抑制劑可有效降低血糖，控制蛋白尿的發(fā)生，降低腎衰竭及心血管事件的發(fā)生率[8]，對DN有良好的治療作用，但有小部分患者在使用此藥物時會出現(xiàn)生殖器真菌感染、糖尿病酮癥酸中毒等不良反應[9]。因此，為了有效控制DN的發(fā)展，阻止DN進程，須探索更多高效、安全的治療藥物。

在我國，以黃芪為代表的中草藥已廣泛應用于DN的臨床治療。黃芪是豆科多年生草本植物——蒙古黃芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.的干燥根，具有補氣升陽，利尿消腫等功效[10]。黃芪所含化學成分復雜，主要包括黃酮類、皂苷類、多糖類及氨基酸類物質[11]。 其中黃芪甲甙(astragaloside Ⅳ，AS-Ⅳ)及黃芪多糖(astragalus polysaccharide，APS)是其主要活性成 分[12-13]。本文主要對AS-Ⅳ及APS治療DN的機制進行綜述，旨在為其進一步的藥理研究及臨床應用提供理論依據。

1 黃芪主要活性成分的藥理作用

AS-Ⅳ及APS均具有抗炎、抗氧化、免疫調節(jié)、抗腫瘤等藥理作用[12-14]。AS-Ⅳ可抑制促炎細胞因子的產生，增加γ干擾素的基因表達，增強免疫應答，對擴張型心肌病、乙型肝炎病毒感染等疾病具有潛在的治療作用；調節(jié)線粒體自噬，保護線粒體功能，發(fā)揮抗氧化活性[14]；調節(jié)過度免疫反應，增加細胞毒性T淋巴細胞，從而減少腫瘤細胞的侵襲及轉移，控制腫瘤進展；還可治療多發(fā)性硬化、類風濕關節(jié)炎等自身免疫性疾病[12]。許多研究表明，AS-Ⅳ對心[15]、肺[16]、腎臟[17]及神經系統(tǒng)[18]均有保護作用。APS可通過增強T細胞、B細胞等免疫細胞的功能，提高免疫調節(jié)活性[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，APS對腎結石有預防和治療作用[19]。此外，APS不僅能增強化療藥物的抗癌作用[14]，還能明顯抑制并殺滅腫瘤細胞[20]。

2 黃芪主要活性成分對DN的療效作用機制

DN發(fā)病機制復雜，多種致病因素如內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)、炎癥、細胞損傷及凋亡、腎組織纖維化、糖脂代謝異常等，均可導致糖尿病腎損害。AS-Ⅳ及APS對上述致病因素具有明顯的抑制及改善作用。

2.1 調節(jié)內質網應激 內質網是蛋白質折疊的“工廠”，是分泌性蛋白及生物膜蛋白加工并轉運至高爾基體的關鍵場所，也是細胞內Ca2+存儲的重要部位。當發(fā)生某些病理生理應激時，會導致內質網腔內眾多未折疊蛋白及錯誤折疊蛋白積聚，內質網內環(huán)境及Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡，從而引發(fā)過度的ERS[21]。內質網膜上存在3種蛋白傳感器——蛋白激酶R樣內質網激酶(protein kinase RNA-like ER kinase，PERK)、肌醇依賴酶1α(inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α)及活化轉錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)，均為介導ERS的重要分子，能夠調節(jié)內質網級聯(lián)反應通路[22]。ERS參與了包括DN在內的多種腎臟疾病的病理生理過程，因此，通過藥物治療恢復內質網功能的平衡，是預防或阻止腎臟疾病進展的有效方法[23]。有研究發(fā)現(xiàn)，APS可通過抑制PERK磷酸化，降低ERS標志物CCAAT/增強子結合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein，C/EBP)的同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)水平，從而恢復內質網功能穩(wěn)態(tài)[24]。Guo等[25-26]采用自發(fā)性和誘發(fā)性兩種糖尿病動物模型，即db/db小鼠和鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導的糖尿病小鼠進行研究，均發(fā)現(xiàn)小鼠腎臟組織中PERK、IRE-1α、ATF6及其下游靶點被激活，CHOP表達明顯升高，磷酸化c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminalkinase，JNK)和裂解的半胱氨酸天門冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-12等ERS誘導細胞凋亡的因子表達增加，以上情況均可由AS-Ⅳ逆轉。另有研究發(fā)現(xiàn)，AS-Ⅳ可減少DN大鼠腎組織中ERS標志物——葡萄糖調節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein78，GRP78)的表達，抑制過度ERS的發(fā)生[27]。綜上，黃芪的主要活性成分可通過抑制PERK、IRE-1α、ATF6所介導的ERS信號通路的活化，降低CHOP、GRP78等ERS相關蛋白的表達水平，從而減輕ERS及其誘導的細胞凋亡，發(fā)揮對DN的保護作用。

2.2 抗炎、減少細胞凋亡

2.2.1 抗炎 炎癥是DN病程進展的中心環(huán)節(jié)。在DN動物模型及患者腎組織中均發(fā)現(xiàn)炎性細胞浸潤，隨著炎性細胞大量聚集，腎小球、腎小管出現(xiàn)嚴重損害。因此，抗炎是減緩DN進展的有效方式之一。在DN病理發(fā)展過程中，不同的代謝途徑及細胞因子被激活，如Janus激酶/信號轉導和轉錄激活因子(Janus tyrosine kinase/signal transducer and transcription activator，JAK/STAT)信號通路，核轉錄因子κB(the nuclear transcription factor kappa B，NF-κB)、核轉錄因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)等[28]。AS-Ⅳ可通過作用于以上通路或細胞因子，減輕炎癥反應及細胞凋亡[29-31]。單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)是影響DN患者體內巨噬細胞積聚的關鍵，而某些炎性因子誘導的MCP-1表達則成為腎臟炎癥發(fā)生的啟動因素。有觀點認為，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α是MCP-1最有效的誘導劑[28]。AS-Ⅳ可抑制db/db小鼠MCP-1及TNF-α的表達上調，減輕腎臟炎癥，降低蛋白尿，有效改善腎小球肥大及系膜基質增厚[25]。

2.2.2 減少足細胞凋亡 足細胞是維持腎小球濾過膜屏障功能及結構的主要細胞，也稱腎小球臟層上皮細胞。目前，保護足細胞已成為治療腎小球損傷的有效方式之一[32]。微小RNA(microRNA，miRNA)及長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)與足細胞的損傷及凋亡密切相關，二者均屬于非編碼RNA，可以RNA的形式參與蛋白編碼基因的調控。TNF受體相關因子5(tumor-necrosis factor receptor-associated factor 5，TRAF5)是TRAF家族的成員之一，參與NF-κB等炎性因子的激活，TRAF5過表達可明顯抑制細胞活性，誘導足細胞凋亡[33]。研究發(fā)現(xiàn)，AS-Ⅳ可使高糖誘導的小鼠足細胞miR-378表達增高，而miR-378可靶向負調控TRAF5，因此，AS-Ⅳ可通過miR-378/TRAF5信號通路抑制足細胞凋亡，miR-378及TRAF5可作為治療DN的新靶 點[34]。DN還受某些lncRNA的調節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA-?；撬嵘险{基因1(lncRNA-TUG1)與TRAF5表達呈負相關，而AS-Ⅳ可調節(jié)二者的平衡，通過升高lncRNA-TUG水平，降低TRAF5的過表達，從而減輕高糖誘導的足細胞凋亡，對DN起靶向治療作用[35]。

2.2.3 減少內皮細胞凋亡 內皮功能障礙是DN的病理特征之一[36]。內皮型一氧化氮合酶(endothelial NO synthase，eNOS)在腎臟疾病中不僅發(fā)揮調節(jié)血管生成的作用，還能修復內皮細胞損傷，激活內皮細胞一氧化氮(nitric oxide，NO)的釋放。糖尿病患者體內eNOS活性受到抑制，NO的生成量及生物利用度大大降低，導致內皮功能障礙，成為DN的起始環(huán)節(jié)[37]。eNOS的活性還可通過其磷酸化來調節(jié)。AS-Ⅳ可加速DN大鼠體內血清及腎組織中的NO合成，促進eNOS磷酸化，明顯增強其活性，減輕內皮細胞損傷，同時在高糖環(huán)境下，AS-Ⅳ還可降低人腎小球內皮細胞的通透性，減少細胞凋亡[38]。

2.2.4 減少腎小管上皮細胞凋亡 DN的病理因素還包括腎小管上皮細胞損傷，當其損傷加重時，可加速DN向ESRD的進展[39]。Ju等[27]建立高脂飲食及小劑量STZ誘導的DN大鼠模型，模型組出現(xiàn)典型的腎小管上皮細胞損傷表現(xiàn)，包括腫脹、肥大、脫落，腎小管空泡樣變、基底膜增厚，間質膠原沉積等特征性病理改變，AS-Ⅳ治療后上述組織病理學改變明顯好轉，凋亡相關蛋白Bax/Bcl-2的比值下調，裂解的caspase-3表達水平降低，細胞凋亡減少。Wang等[31]采用TUNEL染色法檢測高糖誘導的HK-2細胞凋亡情況，模型組中陽性細胞數量明顯多于對照組，而經AS-Ⅳ處理后HK-2凋亡明顯減少。Nrf2是外源性毒性物質及氧化應激的靶點，具有關鍵的防御效應?？寡趸磻?antioxidant response element，ARE)可啟動解毒及抗氧化應激的基因轉錄，保護細胞生物系統(tǒng)免受外源性毒物及氧化劑的損害[40]。AS-Ⅳ可增強Nrf2及其下游基因——血紅素加氧酶-1(HO-1)、Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1(Keap1)、醌氧化還原酶1(NQO1)mRNA的表達，調節(jié)Nrf2/ARE信號通路，從而對高糖誘導的HK-2細胞凋亡及氧化應激損傷發(fā)揮保護作用[31]。APS也具有同樣顯著的效應。在高糖條件下，APS可通過下調JAK/STAT信號通路，抑制HK-2細胞凋亡及轉分化的發(fā)生，并能減少細胞內活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)的生成和氧化損傷[29]。APS對HK-2細胞的保護作用還與其抑制Wnt信號通路相關[41]。由此可見，黃芪主要活性成分能夠抑制Bax、caspase-3等細胞凋亡蛋白的表達，增強Nrf2及其靶基因HO-1、Keap1、NQO1的mRNA表達水平，調節(jié)Nrf2/ARE通路，減輕氧化應激導致的細胞損傷，并可抑制JAK/STAT及Wnt信號通路，減少腎小管上皮細胞凋亡，最終延緩DN的病理 進程。

2.3 抑制纖維化進程 在DN進展過程中，細胞外基質(extracellular matrix，ECM)過度沉積可導致腎纖維化的發(fā)生。轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是腎臟炎癥及纖維化發(fā)展的重要因子，與上皮-間質轉化(epithelialmesenchymal transition，EMT)密切相關，TGF-β1過表達可加劇ECM的累積。Wang等[30]發(fā)現(xiàn)，在高糖誘導的小鼠永生化足細胞中，AS-Ⅳ可抑制TGF-β1的表達，并可激活沉默信息調節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)-NF-κB通路，抑制高糖誘導的足細胞EMT；此外，AS-Ⅳ可減少KK-Ay小鼠的微量白蛋白尿，并減輕ECM的過度沉積及腎臟纖維化。TGF-β1可通過調控下游的信號分子發(fā)揮其生物學效應。Smad3及Smad7均為TGF-β1的下游分子。在高糖條件下，Smad3表達增多可引發(fā)腎臟纖維化及炎癥，進而導致腎功能障礙[42]。同時，Smad7可負調控Smad3的活化。Mao等[43]研究發(fā)現(xiàn)，AS-Ⅳ可降低miR-192和TGF-β1、Smad3、肌動蛋 白α、Ⅰ型膠原蛋白等纖維化相關蛋白的表達，增加Smad7的表達，并呈劑量依賴性地減輕高糖誘導的大鼠系膜細胞增殖，其機制可能是通過TGF-β1/Smad/miR-192通路抑制腎纖維化的產生及系膜細胞的過度增殖。

基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)為一類含鋅的肽鏈內切酶，可降解ECM，是觀察DN預后的重要因子。組織金屬蛋白酶抑制因子(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMP)為MMP的抑制劑，這兩種蛋白對維持ECM合成及降解的平衡具有積極的作用[40]。有研究發(fā)現(xiàn)，APS可抑制TGF-β1/Smad信號通路，調控其下游信號分子，升高MMP-2、MMP-9的表達，并降低TIMP-1、TIMP-2的表達，最終可減輕腎臟纖維化損傷[44]。

2.4 調節(jié)糖、脂代謝 眾所周知，糖類及脂肪代謝異常是糖尿病的典型特征。在2型糖尿病的進程中，代謝器官及組織中胰島素敏感性逐漸喪失，出現(xiàn)胰島素抵抗，最終發(fā)生胰島β細胞功能衰竭，導致高血糖及其他并發(fā)癥的發(fā)生。改善胰島素敏感性是治療2型糖尿病及DN等代謝性疾病的有效方式。脂肪組織是胰島素刺激葡萄糖攝取的主要靶點，胰島素抵抗則會影響葡萄糖的攝取。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)及C/EBPα是脂肪細胞形成過程中的兩個關鍵轉錄因子，可誘導前體脂肪細胞向脂肪細胞分化，參與葡萄糖和脂質代謝。Zhang等[45]采用小鼠3T3-L1前體脂肪細胞進行研究，發(fā)現(xiàn)APS可促進細胞增殖，使細胞內PPARγ和C/EBPα的表達升高，此外，負責攝取葡萄糖的主要轉運蛋白——葡萄糖轉運蛋白4(glucose transporter 4，Glut4)的mRNA及蛋白表達水平升高，且AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)含量也明顯增加。AMPK參與了機體的能量代謝過程，是調控能量代謝及胰島素敏感性的中間環(huán)節(jié)，其活性與胰島素敏感性呈正相關。以上結果均表明，APS可增加脂肪細胞對葡萄糖的攝取，并激活AMPK，從而提高胰島素敏 感性。

AS-Ⅳ是一種新型的PPARγ激動劑[46]，可增強db/db小鼠PPARγ的表達，從而調節(jié)小鼠體內的葡萄糖穩(wěn)態(tài)及脂質代謝[25]。以PPARγ為靶點進行靶向治療是維持血糖水平和脂質穩(wěn)態(tài)的有效方式。腎臟內脂質沉積及過量游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FAs)累積可導致腎小管上皮細胞損傷，而AS-Ⅳ可減少脂質在HK-2細胞內的沉積，減輕細胞損傷及凋亡[47]。體內脂質代謝異?？蓪е履I臟纖維化，而恢復脂肪酸代謝則可避免腎臟纖維化的發(fā)生[48]。Su等[49]發(fā)現(xiàn)，AS-Ⅳ可下調棕櫚酸酯誘導的人腎小球系膜細胞(human glomerular mesangial cells，HMCs)中CD36的表達，減少FFAs的吸收，從而抑制HMCs纖維化及氧化應激的發(fā)生。CD36是FFAs攝取的主要轉運蛋白，在調控糖尿病等代謝性疾病中具有重要意義。

3 總結與展望

在DN等代謝性疾病的治療過程中，尋找有效的靶向治療方案十分關鍵。國際上對中醫(yī)藥治療越來越重視，且對中藥的藥理研究也日漸深入。黃芪是中醫(yī)組方應用中最經典、最常用的中藥之一，其主要活性成分AS-Ⅳ及APS在治療DN方面具有積極的作用。首先，可抑制PERK、IRE-1α、ATF6等介導ERS發(fā)生的主要分子的活化，調節(jié)內質網級聯(lián)反應通路，恢復內質網功能穩(wěn)態(tài)，預防DN進展；其次，作用于腎小管上皮細胞，下調JAK/STAT信號通路及Wnt信號通路，上調Nrf2/ARE信號通路，從而抑制細胞凋亡，抑制高糖誘導的足細胞NF-κB、MCP-1、TNF-α等炎性因子的表達，減輕腎臟炎癥反應；再次，作用于系膜細胞，可抑制TGF-β1/Smad信號通路，減輕系膜細胞的異常增殖，調控MMP系列分子，平衡ECM的合成與降解，減輕腎臟的纖維化程度；最后，增加PPARγ及C/EBPα的表達，提高胰島素敏感性，增強脂肪細胞攝取葡萄糖的能力，減輕糖脂代謝紊亂。

有學者基于系統(tǒng)藥理學的方法，從分子水平到病理水平深入探討了AS-Ⅳ治療DN的作用機制，發(fā)現(xiàn)AS-Ⅳ可通過多靶點多通路協(xié)同治療DN，為后續(xù)探索中藥有效成分提供了全新的方法及思路[50]。目前，黃芪及其活性成分APS、AS-Ⅳ均已研制出注射劑型，但未廣泛應用于臨床，不良反應也未見明確報道。因此，未來須更深入而全面地挖掘黃芪活性成分的藥理作用，以期為DN的臨床治療提供更為可靠的理論依據。