分光光度法測(cè)定牛奶中的亞硝酸鹽

文│余愛英（河南省鄭州種畜場(chǎng)）

一、前言

亞硝酸鹽（NO2-）主要在食品保鮮、化肥等方面廣泛應(yīng)用，但目前已成為環(huán)境、食品以及生理系統(tǒng)中普遍存在的污染物。過高的亞硝酸鹽濃度對(duì)人體健康可造成傷害，特別是嬰幼兒和孕婦群體，由于人體攝入一定量的亞硝酸鹽（NO2-）可發(fā)生高鐵血紅蛋白癥，而且亞硝酸鹽容易與人體內(nèi)的仲胺、叔胺和酰胺發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生具有致癌作用的亞硝胺化合物，為防止上述現(xiàn)象發(fā)生，應(yīng)限制食品中亞硝酸鹽的含量，特別是乳及乳制品中亞硝酸鹽的含量。

近年來(lái)，亞硝酸鹽的測(cè)定方法主要有分光光度法、色譜法、化學(xué)發(fā)光法等，基于分光光度法操作簡(jiǎn)便、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，目前是牛奶中亞硝酸鹽測(cè)定常用的方法之一。常用的分光光度法主要是基于格里斯試劑比色法，格里斯反應(yīng)由約翰·彼得·格里斯于1879年首次提出，主要用重氮化反應(yīng)測(cè)定唾液中的硝酸鹽。格里斯法用于泌尿生殖道細(xì)菌感染的檢測(cè)已有相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。格里斯法是亞硝酸鹽將芳香伯胺轉(zhuǎn)化為重氮離子，重氮離子隨后與另一種芳香化合物偶聯(lián)生成偶氮燃料。常用的目標(biāo)胺是磺胺酸、硝基苯胺和對(duì)氨基苯乙酮，而苯酚、1-萘酚、1-萘酚-4-磺酸等為偶聯(lián)劑，無(wú)論采用哪種試劑，其都存在樣品適應(yīng)性問題。在GB5009.33—2016中采用的目標(biāo)胺是對(duì)氨基苯磺酸，偶聯(lián)劑是鹽酸萘乙二胺。本文介紹了鹽酸萘乙二胺分光廣度法檢測(cè)亞硝酸鹽的原理以及檢測(cè)過程中的注意事項(xiàng)，以期提高分光光度法檢測(cè)亞硝酸鹽的準(zhǔn)確度，保證牛奶以及乳制品中亞硝酸鹽污染物的有效控制。

二、鹽酸萘乙二胺分光光度法主要檢測(cè)原理

GB5009.33-2016第二法采用的是鹽酸萘乙二胺分光光度法，主要檢測(cè)原理是樣品經(jīng)蛋白質(zhì)沉淀、脂肪去除后，在弱酸條件下亞硝酸鹽與對(duì)氨基苯磺酸重氮化后，再與鹽酸萘乙二胺偶合形成紫紅色染料，與標(biāo)準(zhǔn)品比較定量，測(cè)得亞硝酸鹽含量。

三、樣品提取、過濾澄清原理介紹及注意事項(xiàng)

1.硼砂的作用。在GB5009.33-2016第二法樣品亞硝酸的提取過程中，樣品中加入硼砂，使亞硝酸鹽的總量不會(huì)因?yàn)榧訜岱纸舛鴾p少，硼砂的主要作用是吸收亞硝酸鹽分解。硼砂溶液呈堿性，堿性條件下，能夠有效利用鋅鹽沉淀蛋白質(zhì)。另外在堿性條件下，亞硝酸根以離子形式存在，易溶且穩(wěn)定，如溶液偏酸性，則形成亞硝酸，在加熱條件下容易揮發(fā)，也易分解，導(dǎo)致提取效果不佳。

2.乙酸鋅與亞鐵氰化鉀沉淀澄清劑。作為沉淀澄清劑，乙酸鋅與亞鐵氰化鉀用來(lái)去除牛奶中蛋白質(zhì)、脂肪等影響亞硝酸鹽測(cè)定的物質(zhì)。操作過程中，亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液要嚴(yán)格按照測(cè)定方法的量和次序來(lái)添加，添加亞鐵氰化鉀溶液搖勻后再添加乙酸鋅溶液，在添加過程中應(yīng)邊搖邊添加。

3.過濾。由于分光光度法對(duì)樣品溶液的澄清度要求較高，但食品基質(zhì)復(fù)雜，牛奶樣品經(jīng)提取并澄清后，脂肪浮于上層，若用濾紙過濾后仍不澄清，樣品溶液可經(jīng)4℃冷凍高速離心后再進(jìn)行濾紙過濾，濾液能夠進(jìn)一步澄清。

為驗(yàn)證濾液澄清度、提取過程、提取試劑對(duì)后續(xù)測(cè)定的影響，可向?yàn)V液中加標(biāo)，然后測(cè)定加標(biāo)后濾液的亞硝酸鹽含量，如果測(cè)定值與加標(biāo)量差異不大，可認(rèn)為濾液的澄清度、提取過程、提取試劑對(duì)后續(xù)測(cè)定過程無(wú)影響。

4.試劑對(duì)測(cè)定過程的影響。在實(shí)際檢測(cè)工作中發(fā)現(xiàn)，不同廠家、不同純度、不同保質(zhì)期的試劑會(huì)影響加標(biāo)樣品的回收率，在日常檢測(cè)中應(yīng)做試劑空白試驗(yàn)，以消除試劑對(duì)測(cè)定的影響。

5.測(cè)定過程中的試驗(yàn)儀器。試驗(yàn)儀器有亞硝酸鹽殘留或其他物質(zhì)殘留，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。有文獻(xiàn)指出，洗滌劑殘留可影響偶氮化反應(yīng)，從而影響顯色反應(yīng)及分光光度計(jì)測(cè)定值。

6.顯色反應(yīng)過程。澄清后的濾液要進(jìn)行顯色反應(yīng)，然后進(jìn)行分光光度計(jì)測(cè)定。顯色測(cè)定過程中要嚴(yán)格按照反應(yīng)時(shí)間操作，加完每個(gè)試劑后，要輕輕搖勻后再加下一個(gè)試劑。加完對(duì)氨基苯磺酸溶液后要靜置3～5分鐘，保證重氮化反應(yīng)充分，所有試劑添加并定容后應(yīng)在15～60分鐘內(nèi)進(jìn)行比色。

四、總結(jié)

鹽酸萘乙二胺分光光度法檢測(cè)亞硝酸鹽主要依據(jù)重氮偶合反應(yīng)進(jìn)行測(cè)定，在測(cè)定過程中對(duì)重氮偶合反應(yīng)有影響的因素都會(huì)對(duì)測(cè)定值有影響，如各種試劑、提取澄清過程、試驗(yàn)儀器、顯色反應(yīng)時(shí)間等因素，在日常檢測(cè)過程中應(yīng)避免這些因素的影響，以提高牛奶中亞硝酸鹽測(cè)定的準(zhǔn)確性。