超聲降解影響多糖理化特性和生物活性研究進(jìn)展

王子朝，張 迪，盛麗麗，梁小娜，鄭欣欣，潘亞萍，張慧茹

河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

多糖，又稱多聚糖，一般來說是由10個(gè)以上單糖分子通過α-或β-糖苷鍵連接而成的一種高分子碳水化合物，是維持生命活動(dòng)正常運(yùn)轉(zhuǎn)的基本物質(zhì)之一；同時(shí)，多糖還具有多種生物活性，如抗氧化、抗菌、消炎、抗疲勞、降血糖、抗腫瘤、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)、提高機(jī)體免疫力和促生長(zhǎng)等[1-4]，在紡織、油氣開采、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)藥、化妝品、食品等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。在2020年席卷全球的新冠肺炎病毒防治過程中，多糖也發(fā)揮出了巨大的潛力[5-6]。但單糖組成、分子量、官能團(tuán)、化學(xué)鍵、高聚合度、高分支度、空間纏繞等特征不僅限制了多糖結(jié)構(gòu)特征與其生物活性之間的構(gòu)效關(guān)系研究，還妨礙了以結(jié)構(gòu)特征為標(biāo)志設(shè)計(jì)、構(gòu)建、篩選和生產(chǎn)功能多糖[7]。多糖在生物體內(nèi)的活性體現(xiàn)在與功能蛋白受體相互識(shí)別、相互作用的過程中，多糖與蛋白受體結(jié)合時(shí)，只有其中的幾個(gè)寡聚糖與受體真正相結(jié)合，與酶作用過程相似，多糖分子中可能也存在著一個(gè)或幾個(gè)結(jié)構(gòu)功能域。因此，如何獲得大量純度高、均一性好和結(jié)構(gòu)特征明確的多糖片段，是研究多糖相關(guān)構(gòu)效關(guān)系和作用機(jī)制的基礎(chǔ)與關(guān)鍵。

多糖活性片段的制備，主要有以下3種策略：一是基于化學(xué)合成策略，采用化學(xué)法或酶法從單糖出發(fā)合成不同結(jié)構(gòu)特征多糖活性片段[8]；二是基于代謝調(diào)控策略，采用分子生物學(xué)[9]或合成生物學(xué)[10]技術(shù)手段，對(duì)微生物合成胞外多糖的代謝途徑進(jìn)行調(diào)控，實(shí)現(xiàn)不同結(jié)構(gòu)特征多糖活性片段的發(fā)酵生產(chǎn)；三是基于降解策略，采用酶法[11]、化學(xué)法[12]和物理法[13]等降解方法對(duì)多糖進(jìn)行可控降解，進(jìn)而獲得不同結(jié)構(gòu)特征多糖活性片段。對(duì)比分析上述3種多糖結(jié)構(gòu)調(diào)控策略，對(duì)多糖進(jìn)行體外降解，不僅易獲得不同結(jié)構(gòu)特征多糖活性片段，而且在技術(shù)上也最容易實(shí)現(xiàn)和控制。

采用酶法進(jìn)行降解是獲得多糖片段最有效和最直接的方法，但酶的昂貴價(jià)格以及專一性和特異性限制了其應(yīng)用[11]?；瘜W(xué)降解法也可獲得多糖片段，但可控性較低，且化學(xué)試劑增加了降解后多糖片段分離純化的難度[14]。采用超聲波、微波、射線、光照等物理方法在體外降解多糖，不僅降解效率高、綠色環(huán)保、操作簡(jiǎn)便，而且反應(yīng)條件溫和、可控，尤其是超聲降解法[14]。雖然Yang等[14]和Qiu等[15]發(fā)現(xiàn)超聲降解后，多糖片段中單糖組成與比例會(huì)發(fā)生一定程度變化，但更多學(xué)者[16-18]則證實(shí)，采用超聲波體外降解多糖時(shí)，只會(huì)降解和打斷多糖的主鏈結(jié)構(gòu)，且降解后所得寡糖片段只是聚合度存在差異，并且體外超聲降解有成熟的降解動(dòng)力學(xué)模型可參考。

1 超聲降解多糖機(jī)理

超聲降解多糖有空氣泡破碎和化學(xué)反應(yīng)兩種機(jī)理[13]?？諝馀萜扑榧礄C(jī)械性斷鍵作用，利用超聲波的極速振動(dòng)，多糖可具有極高的運(yùn)動(dòng)加速度，激烈而快速變化的機(jī)械運(yùn)動(dòng)使多糖在介質(zhì)中隨著波的高速振動(dòng)及剪切力的作用而降解，且超聲降解主要使多糖的糖苷鍵斷裂，官能團(tuán)不發(fā)生變化?；瘜W(xué)反應(yīng)即自由基氧化還原反應(yīng)，主要是液體在超聲波作用下產(chǎn)生空化效應(yīng)所導(dǎo)致的。超聲波足夠大時(shí)導(dǎo)致溶液內(nèi)部出現(xiàn)空穴，空穴破碎時(shí)可以產(chǎn)生局部高壓和劇烈溫度變化，為自由基的產(chǎn)生提供一定能量。Yang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)，超聲波功率越大，空化能量越高，空化泡的數(shù)量越多，反應(yīng)系統(tǒng)的能量傳遞效率越高?？栈?yīng)也可導(dǎo)致機(jī)械性斷鍵，因此也常把空化效應(yīng)視為超聲降解的主要機(jī)理。例如Pu等[16]研究發(fā)現(xiàn)，超聲降解在較高功率、較低溫度、多糖濃度較低情況下，多糖降解的效果尤其顯著。

2 超聲降解對(duì)多糖理化特性的影響

2.1 超聲降解對(duì)多糖分子量的影響

分子量對(duì)多糖的生物活性具有重要影響，多糖分子中存在著一個(gè)或幾個(gè)寡糖片段活性中心，超聲降解后多糖分子量均有一定程度降低。如徐雅琴等[19]以黑加侖果實(shí)為原料，采用復(fù)合酶法制備黑加侖果實(shí)多糖(BFPs)，并經(jīng)700 W超聲作用15 min和30 min降解BFPs，研究表明隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖的黏均分子量Mv顯著降低，降解15 min時(shí)，Mv減少56.97%，降解時(shí)間延長(zhǎng)至30 min時(shí)，Mv減少65.94%。Yang等[14]采用超聲法對(duì)黑加侖果實(shí)多糖進(jìn)行降解時(shí)也發(fā)現(xiàn)，多糖分子量隨超聲時(shí)間和功率的增加而降低，當(dāng)采用300、500、700 W超聲波功率對(duì)黑加侖果實(shí)多糖降解100 min后，多糖的黏均分子量由6.12×107Da分別降低至9.40×106、8.00×106、4.65×106Da，數(shù)均分子量由8.13×106Da降低至3.39×106、1.74×106、4.57×105Da。李彩金等[20]利用超聲法對(duì)猴頭菌(Hericiumerinaceus)多糖H6PC20進(jìn)行降解，發(fā)現(xiàn)多糖H6PC20經(jīng)超聲降解處理后重均分子量和數(shù)均分子量均顯著下降，降解處理10 min后，多糖重均分子量從2.39×106Da下降至4.66×105Da，30 min后下降趨緩。Zhong等[21]研究超聲降解對(duì)裂褶菌多糖(SPG)分子量降解效應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)超聲降解可顯著降低SPG的分子量，當(dāng)采用796 W/cm2功率密度降解30 min后，多糖SPG分子量由2 404 kDa降低至389 kDa。此外，眾多學(xué)者也證實(shí)，超聲降解可以有效降低多糖分子量和提高降解所得多糖片段的生物活性[22-23]。

2.2 超聲降解對(duì)多糖溶液黏度的影響

多糖溶液的黏度會(huì)影響其生物活性和實(shí)際應(yīng)用，高分子量多糖往往具有黏度大、生物利用度低等缺點(diǎn)[24]，對(duì)多糖進(jìn)行超聲降解可降低其分子量和溶液黏度，進(jìn)而提高其生物利用度。如徐雅琴等[19]采用超聲降解黑加侖果實(shí)原多糖，并使用振動(dòng)黏度計(jì)分別測(cè)量質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL的原多糖和降解多糖溶液黏度，在700 W超聲功率下分別降解15 min和30 min后，多糖溶液的黏度分別降低了11.86%和16.49%。李彩金等[20]利用超聲降解猴頭菌多糖H6PC20，發(fā)現(xiàn)多糖H6PC20溶液黏度隨超聲降解時(shí)間的增加而逐漸降低。Wang等[25]采用大功率超聲波對(duì)藥用真菌菌絲培養(yǎng)的高分子量胞外多糖(EPS)的理化性質(zhì)進(jìn)行改性，在35 W/cm2或較高超聲波功率密度下，EPS的表觀黏度和特性黏度下降了近85%。Li等[26]研究了丙酮酸基團(tuán)對(duì)黃原膠在水溶液中超聲降解效果的影響，對(duì)天然和無丙酮酸的黃原膠進(jìn)行了20倍超聲降解，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲降解對(duì)黃原膠結(jié)構(gòu)和黏度都有影響。Xu等[22]研究發(fā)現(xiàn)，超聲降解在降低黑加侖果實(shí)多糖的分子量后，不僅提高了黑加侖果實(shí)多糖對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性，還使其溶液黏度分別下降了27.88%和33.63%。

2.3 超聲降解對(duì)多糖溶解性的影響

多糖溶于水是其發(fā)揮生物學(xué)活性的首要條件，如香水蓮花多糖溶解度增加可使其抗氧化活性顯著提高[27]，殼聚糖在水中的溶解性影響其抑菌效果[28]。徐雅琴等[19]采用超聲降解黑加侖果實(shí)原多糖(BFPs)，并對(duì)降解后的多糖進(jìn)行溶解度測(cè)定，結(jié)果表明超聲降解可以顯著增加BFPs的溶解度，且超聲降解15 min和30 min時(shí)，多糖的溶解度分別增加了27.97%和61.53%。Wang等[25]研究也發(fā)現(xiàn)，超聲降解可以提高藥用真菌菌絲培養(yǎng)的高分子量胞外多糖(EPS)溶解性，當(dāng)采用35 W/cm2超聲功率降解10 min后，胞外多糖EPS的溶解性提高了4倍。

2.4 超聲降解對(duì)多糖流變特性的影響

對(duì)多糖進(jìn)行超聲降解可改變其流變學(xué)特性，進(jìn)而影響多糖在加工和生產(chǎn)中的應(yīng)用。如Yang等[14]發(fā)現(xiàn)黑加侖果實(shí)多糖在高超聲波功率下由假塑性流體轉(zhuǎn)變?yōu)榕ｎD流體。謝建華等[29]研究了不同強(qiáng)度的超聲波對(duì)魔芋葡甘聚糖(KGM)-大豆分離蛋白(SPI)復(fù)配體系流變學(xué)特性的影響，發(fā)現(xiàn)120 W和200 W的超聲降解會(huì)提高KGM-SPI體系的黏彈性，280 W超聲降解則會(huì)降低體系的黏彈性，說明適當(dāng)超聲降解可使KGM-SPI體系黏稠系數(shù)增大，流變學(xué)特性指數(shù)減小。夏強(qiáng)等[30]研究證實(shí)，超聲降解可以使大粒車前子多糖溶液的表觀黏度急劇下降，流體性質(zhì)從假塑性流體變成牛頓流體，彈性模量與黏性模量均下降，凝膠性質(zhì)明顯減弱。喬楊波等[31]研究狹果茶藨子果實(shí)多糖的流變學(xué)特性時(shí)發(fā)現(xiàn)，超聲降解后的狹果茶藨子果實(shí)多糖溶液屬非牛頓流體，具有良好的流變學(xué)特性。Li等[32]研究超聲功率對(duì)食品多糖魔芋葡甘聚糖(KGM)分子量和流變學(xué)特性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲降解能夠改變KGM的流變學(xué)特性。同時(shí)，Zhang等[33]和Zhong等[21]的研究也證實(shí)，超聲降解可以有效改變果膠和裂褶菌多糖的流變學(xué)特性，使降解后的多糖更適于在食品加工和生產(chǎn)中應(yīng)用。

2.5 超聲降解對(duì)多糖結(jié)構(gòu)的影響

多糖的特定結(jié)構(gòu)是其產(chǎn)生生物學(xué)活性所必需的，如Chen等[34]發(fā)現(xiàn)共聚草多糖中糖醛酸含量最高，分子量最小時(shí)，其抗氧化活性最佳。夏強(qiáng)等[30]發(fā)現(xiàn)，超聲降解可以使大粒車前子多糖的溶液構(gòu)象從高支化結(jié)構(gòu)向無歸線團(tuán)轉(zhuǎn)變。雖然Yang等[14]和Qiu等[15]發(fā)現(xiàn)，超聲降解可使多糖片段中單糖組成及比例發(fā)生一定程度的變化，但更多學(xué)者[16-18]則證實(shí)，超聲降解多糖時(shí)，只會(huì)降解和打斷多糖的主鏈結(jié)構(gòu)，降解后所得寡糖片段只是聚合度上存在差異，單糖組成及比例未發(fā)生明顯變化。同時(shí)，徐雅琴等[19]采用傅里葉紅外光譜、剛果紅和碘-碘化鉀實(shí)驗(yàn)對(duì)超聲降解后的黑加侖果實(shí)多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)超聲波作用于黑加侖果實(shí)多糖后并沒有改變其基本結(jié)構(gòu)和復(fù)雜分支結(jié)構(gòu)。Zhou等[35]研究超聲降解對(duì)紫菜多糖結(jié)構(gòu)的影響，通過傅里葉變換紅外光譜和核磁共振光譜分析，發(fā)現(xiàn)超聲降解并未改變紫菜多糖的結(jié)構(gòu)。

3 超聲降解對(duì)多糖生物活性的影響

3.1 超聲降解對(duì)多糖抗氧化活性的影響

自由基是人體生命活動(dòng)中各種生化反應(yīng)的中間代謝產(chǎn)物，在新陳代謝過程中發(fā)揮著重要作用，人體內(nèi)自由基平衡一旦被打破，若不及時(shí)清除，將不斷攻擊機(jī)體內(nèi)的生命大分子物質(zhì)以及各種細(xì)胞器，進(jìn)而加速機(jī)體的衰老并引發(fā)一系列疾病。多糖類化合物具有清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、抑制亞油酸氧化等抗氧化作用，并且超聲降解可以提高多糖的抗氧化效果。如徐雅琴等[19]研究發(fā)現(xiàn)，通過超聲降解能使黑加侖果實(shí)多糖中糖醛酸含量增加，提高多糖供給氫原子的能力，進(jìn)而增強(qiáng)多糖的抗氧化活性，且降解多糖對(duì)DPPH、O2-·和NO2-自由基的清除能力及其對(duì)脂質(zhì)過氧化的抑制作用均強(qiáng)于原多糖。Yan等[17]研究也發(fā)現(xiàn)，超聲降解可有效降低桑黃菌絲多糖的分子量和提高多糖片段中O-H比例，進(jìn)而提高桑黃菌絲多糖的羥基自由基清除活性。Wang等[13]研究超聲波輻射對(duì)不同分子量黃茶多糖結(jié)構(gòu)特征和抗氧化性能的影響，發(fā)現(xiàn)超聲波輻照增加了黃茶多糖的自由基清除活性，降解后的多糖片段表現(xiàn)出高水平DPPH、O2-·和·OH自由基清除活性。Xu等[23]采用超聲波對(duì)靈芝多糖進(jìn)行降解，比較其降解前后的抗氧化活性，研究發(fā)現(xiàn)，超聲降解能夠顯著提高靈芝多糖的體外抗氧化活性。此外，Xu等[22]研究發(fā)現(xiàn)，超聲降解不僅提高了黑加侖果實(shí)多糖的抗脂質(zhì)過氧化和DNA保護(hù)作用，還有效提高了其體外抗氧化活性。綜上所述，超聲降解是一種在不破壞多糖原有結(jié)構(gòu)的條件下有效提高其抗氧化活性的手段和技術(shù)。

3.2 超聲降解對(duì)多糖免疫調(diào)節(jié)活性的影響

多糖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性主要是通過誘導(dǎo)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，如促進(jìn)干擾素、白細(xì)胞介素等，從而激活巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)和淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞，提高機(jī)體特異性和非特異性免疫功能，進(jìn)而發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)活性。趙婷婷等[36]研究發(fā)現(xiàn)壇紫菜多糖及其超聲降解組分片段顯著影響了淋巴細(xì)胞增殖，呈劑量依賴性，兩者均能顯著抑制B細(xì)胞增殖、促進(jìn)T細(xì)胞增殖，且小分子量多糖片段的效果更加明顯。楊秀艷[37]采用超聲降解紅芪多糖時(shí)發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)超聲降解的原多糖相比，經(jīng)超聲降解后的多糖片段對(duì)小鼠脾細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增殖活性具有促進(jìn)作用。Yao等[38]采用陰離子交換柱和凝膠過濾色譜法從薏苡種子中分離和純化得到了多糖及其兩種亞組分，發(fā)現(xiàn)經(jīng)超聲降解后的多糖片段對(duì)巨噬細(xì)胞有顯著的免疫增強(qiáng)作用。

3.3 超聲降解對(duì)多糖其他生物活性的影響

除抗氧化活性和免疫調(diào)節(jié)活性之外，超聲降解還可能影響多糖的其他活性。如Xu等[22]研究超聲降解對(duì)黑醋栗果實(shí)多糖(BCP)生物活性的影響，結(jié)果表明超聲降解不僅能夠增強(qiáng)多糖BCP片段的抗氧化活性，還能提高BCP片段對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性。Liu等[39]研究發(fā)現(xiàn)，采用超聲波對(duì)4種不同分子量的脫乙酰度殼聚糖進(jìn)行降解，降解后殼聚糖片段對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗增殖活性顯著增加。多糖發(fā)揮抗菌活性的主要作用靶點(diǎn)可能為細(xì)菌的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、胞質(zhì)膜、蛋白質(zhì)和DNA等，從而能夠解決致病菌耐藥性的問題，為開發(fā)綠色安全的抗菌劑提供一定參考價(jià)值。此外，Zhu等[40]對(duì)古尼蟲草多糖進(jìn)行超聲降解，發(fā)現(xiàn)超聲降解顯著提高了古尼蟲草多糖片段的抗腫瘤活性。

4 展望

超聲降解不僅高效、環(huán)保，而且可以通過改變多糖的結(jié)構(gòu)、流變性和溶解性等，影響多糖的抗氧化、抑菌、降血糖、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等生物活性。但由于設(shè)備和技術(shù)不成熟、生產(chǎn)成本高等因素限制了其大規(guī)模生產(chǎn)，而且空化氣體、溶液pH、黏滯系數(shù)、表面張力系數(shù)、溶液溫度等因素對(duì)超聲降解的影響也較大。因此，超聲降解的作用時(shí)間、強(qiáng)度、頻率等物理因子對(duì)多糖介質(zhì)各物化性質(zhì)作用的具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。探明超聲波對(duì)多糖生物大分子鍵斷裂的作用機(jī)理和自由基反應(yīng)機(jī)理，并建立物理因子和化學(xué)因子對(duì)多糖生物大分子微觀結(jié)構(gòu)與宏觀性能影響機(jī)理的物理與數(shù)學(xué)模型，可從根本上解決該技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的問題。