巨大口蘑液體發(fā)酵條件優(yōu)化研究

梁大偉，朱 萍，陳靜刁，馬建偉，莫美華，*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510642; 2.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?70228)

巨大口蘑液體發(fā)酵條件優(yōu)化研究

梁大偉1，朱 萍2，陳靜刁1，馬建偉1，莫美華1，*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510642; 2.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?70228)

通過單因素和均勻設(shè)計對巨大口蘑液體菌種發(fā)酵工藝條件進行了優(yōu)化，研究結(jié)果表明，巨大口蘑液體發(fā)酵最佳條件為:裝液量179mL、搖床轉(zhuǎn)速165r/min、發(fā)酵溫度28℃、初始pH6、接種量為4片直徑1.2cm的菌絲塊，干菌絲量達到0.8626g。通過實驗研究，得到了巨大口蘑液體發(fā)酵的最佳條件，為今后巨大口蘑液體菌種的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

巨大口蘑，發(fā)酵，均勻設(shè)計

巨大口蘑(Tricholoma giganteum Massee) 由廣東省連南縣食用菌研究所陳秋來饋贈;PDA培養(yǎng)基(%) 馬鈴薯20，葡萄糖2，瓊脂1.5～2，自來水1000mL，自然pH，121℃滅菌20min;加富PDA固體培養(yǎng)基(%) 馬鈴薯20，葡萄糖2，蛋白胨0.1～0.3，KH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.15，瓊脂1.5～2，自來水1000mL，自然pH，121℃滅菌20min;酵母浸汁 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;乳糖、葡萄糖、蔗糖、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸銨 分析純，廣州化學(xué)試劑廠;石膏、石灰、棉籽殼、麩皮 市售。

YX－280型手提式壓力蒸汽滅菌鍋 北京中西集團;WG800SL23－K6型微波爐 格蘭仕公司; 101AS－3型數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱 東莞市吉之壟電子儀器廠;MC－EP201電磁爐 美的公司;LRH－250－Ⅱ生化培養(yǎng)箱 河南兄弟儀器設(shè)備有限公司; PL602－S電子天平 上海滬沁儀器設(shè)備有限公司; SW－CJ－2FD超凈工作臺 上海標儀儀器有限公司; HZQ－QG搖床 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌絲培養(yǎng) 從母種試管中切出蠶豆大小的巨大口蘑菌絲塊接種于加富PDA平板的中，在30℃培養(yǎng)，菌絲長滿平板后待用。

1.2.2 巨大口蘑液體發(fā)酵培養(yǎng) 在巨大口蘑菌絲平板上用直徑為1.2cm的打孔器取若干片巨大口蘑菌絲塊，將菌絲塊打碎并移接到250mL三角瓶液體培養(yǎng)基中，一定條件下?lián)u床培養(yǎng)得到巨大口蘑菌絲球。

1.2.3 巨大口蘑生物量的測定 細胞干重法。將三角瓶中的菌絲體轉(zhuǎn)移到100mL離心管中，除去多余培養(yǎng)液，加入 50～80mL蒸餾水，6000r/min離心10min，除去多余水分并加入蒸餾水充分洗滌，此步驟重復(fù)3次，將菌絲體轉(zhuǎn)移到干凈平皿中，并在平皿中墊一層保鮮膜，以便干燥后獲取干燥菌絲，50℃真空干燥至恒重，電子天平準確稱重，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.4 單因子實驗確定培養(yǎng)溫度中心點 將2片直徑為1.2cm的巨大口蘑菌絲塊打碎并移接到含180mL PDA液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速170r/min，初始pH為7，發(fā)酵周期10d，重復(fù)三次。觀察不同培養(yǎng)溫度對巨大口蘑液體發(fā)酵的生物量的影響。

1.2.5 單因子實驗確定初始pH中心點 將2片直徑為1.2cm的巨大口蘑菌絲塊打碎并移接到含180mL PDA液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速為170r/min，培養(yǎng)溫度為34℃，發(fā)酵周期為10d，重復(fù)三次，觀察初始pH對巨大口蘑液體發(fā)酵的生物量的影響。

1.2.6 均勻設(shè)計法優(yōu)化巨大口蘑液體發(fā)酵條件 選取4因素、6水平的均勻設(shè)計表及其使用表，根據(jù)單因子實驗確定的各因素中心點安排合適的取值范圍，得出參試因子水平表(表1)和發(fā)酵條件優(yōu)化實驗方案(表2)。按發(fā)酵條件優(yōu)化實驗方案安排實驗，接種量統(tǒng)一為1片直徑為1.2cm的巨大口蘑菌絲塊，將菌絲塊充分打碎并移接到PDA液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，發(fā)酵周期為10d，每個水平做3個重復(fù)。發(fā)酵結(jié)束后測菌絲球干重，并以此為目標函數(shù)進行統(tǒng)計分析，獲得巨大口蘑液體發(fā)酵的最佳工藝條件。

表1 參試因子水平表Table 1 Tested factor lever table

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化的實驗方案Table 2 The experiment scheme of optimization of fermentation conditions

1.2.7 巨大口蘑液體發(fā)酵接種量的確定 根據(jù)上述優(yōu)化結(jié)果，在優(yōu)化后的發(fā)酵溫度、初始pH、裝液量、搖床轉(zhuǎn)速條件下，結(jié)合單因素實驗討論不同接種量(1、2、3、4、5片)對巨大口蘑液體搖瓶發(fā)酵菌絲產(chǎn)量的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因子實驗確定培養(yǎng)溫度中心點

采用單因子實驗法觀察不同溫度對巨大口蘑液體發(fā)酵生物量的影響，并利用SPSS17.0鄧肯新復(fù)極差檢驗法(α=0.05)對不同培養(yǎng)溫度下的菌絲體干重進行方差分析確定合適的培養(yǎng)溫度范圍，培養(yǎng)溫度不同巨大口蘑菌絲體干重差異顯著，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，菌絲體干重逐漸增加，34℃達到最大，隨后，隨溫度繼續(xù)升高，菌絲體的重量反而下降。其中34℃與其它溫度菌絲體干重差異達極顯著水平，此溫度下巨大口蘑生長量最大，為1.4316g/瓶。因此，將34℃確定為中心點。

圖1 不同溫度對巨大口蘑液體發(fā)酵的生物量的影響Fig.1 Effect of biomass of Tricholoma giganteum liquid fermentation in different temperatures

2.2 單因子實驗確定初始pH中心點

采用單因子實驗法，觀察不同初始pH對巨大口蘑液體發(fā)酵生物量的影響，并利用SPSS17.0鄧肯新復(fù)極差檢驗法(α=0.05)對不同初始pH下的巨大口蘑菌絲體干重進行方差分析，確定合適的pH中心點，結(jié)果見圖2。當初始pH為6時，巨大口蘑液體發(fā)酵的生物量達到最大值，為1.6870g/瓶，過高或過低的初始pH會使其生物量有所降低。從分析結(jié)果可知，不同pH條件下，巨大口蘑菌絲體干重差異顯著。其中，pH為5、6、7與其它pH下的菌絲體干重差異達顯著水平，而 pH6時巨大口蘑生長量最大，為1.6870g/瓶。因此，pH6是巨大口蘑菌絲體生長最適初始pH。

圖2 不同初始pH對巨大口蘑液體發(fā)酵的生物量的影響Fig.2 Effect of biomass of Tricholoma giganteum liquid fermentation in different pH

2.3 均勻設(shè)計法優(yōu)化確定巨大口蘑液體發(fā)酵條件

表3 巨大口蘑液體發(fā)酵條件均勻設(shè)計實驗結(jié)果Table 3 Uniform design experiment of liquid fermentation conditions of Tricholoma giganteum

均勻設(shè)計實驗結(jié)果如表3，以菌絲體干重為目標函數(shù)(Y)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，所得結(jié)果用DPS V6.55進行均勻設(shè)計分析，所得回歸方程為:

對回歸方程進行檢驗，最終得出相關(guān)系數(shù)R= 0.9998，F(xiàn)=7.317352E+0002，顯著水平p=0.0277，剩余標準差SSE=0.0099，小于0.05，達到顯著水平，調(diào)整后相關(guān)系數(shù)Ra=0.9991，說明方程的可信度好。

方程中各項實驗因子的回歸系數(shù)和t檢驗結(jié)果見表4。

表4 各回歸項的回歸系數(shù)的t檢驗結(jié)果Table 4 Test results of the regression coefficient t of the return

由表4可知，方程中各回歸項的顯著水平均小于0.05，這說明X1(裝液量)對菌絲體的干重影響較大;裝液量與pH、溫度與pH之間的交互作用對菌絲體干重影響均很大，全部達到極顯著水平，而轉(zhuǎn)速與pH之間的交互作用對菌絲體干重影響達到顯著水平。

2.3.1 觀察值和擬合值 表5中數(shù)據(jù)顯示:觀測值與擬合值接近，最大的擬合誤差絕對值為0.0065，進一步說明了回歸方程的準確性。

表5 樣本的觀察值、擬合值和擬合誤差表Table 5 Observation value and fitting value fitting error table of the sample

2.3.2 數(shù)學(xué)模擬分析結(jié)果 通過數(shù)學(xué)模擬分析，能找出一個最優(yōu)巨大口蘑菌絲培養(yǎng)條件的方案(表6)，得到的巨大口蘑最大干重為0.6475g/瓶。

2.3.3 驗證實驗 驗證實驗要對理論最優(yōu)條件、組間最優(yōu)條件進行比較。接種量統(tǒng)一為1片直徑為1.2cm的巨大口蘑菌絲塊，進行生長對比實驗。發(fā)酵周期10d，重復(fù)3次，比較不同發(fā)酵條件對巨大口蘑液體發(fā)酵生物量的影響，結(jié)果見表7。

表6 液體培養(yǎng)干重最高指標時各個因素組合Table 6 Each factor combination liquid culture of dry weight maximum index

表7 不同培養(yǎng)基對巨大口蘑液體發(fā)酵生物量的影響(g)Table 7 Effects of biomass of Tricholoma giganteum liquid fermentation in different Culture medium(g)

用DPS 8.01軟件進行顯著性分析，得知理論最優(yōu)條件和組間最優(yōu)條件這兩個處理間差異顯著(a= 0.05)，且理論最優(yōu)條件的菌絲平均重量顯著高于組間最優(yōu)條件。

2.4 巨大口蘑液體發(fā)酵接種量的確定

從圖3可以看出，隨著接種量的增加，菌絲體干重逐漸增加，5片時達到最大。對不同接種量的菌絲體干重進行方差分析，結(jié)果表明，接種量不同巨大口蘑菌絲體干重差異顯著(a=0.05)。其中，4片和5片與其它接種量菌絲體干重差異達顯著水平，而4片和5片的菌絲體干重差異不顯著。因此，4片和5片是巨大口蘑菌絲體生長最適接種量?？紤]到經(jīng)濟因素，巨大口蘑生長的接種量設(shè)為4片。

圖3 接種量對巨大口蘑液體發(fā)酵的生物量的影響Fig.3 Effect of biomass of Tricholoma giganteum liquid fermentation in different inoculation

3 討論與結(jié)論

3.1 溫度對菌絲體生長的影響

溫度對發(fā)酵有很大的影響，它既會影響各種酶反應(yīng)的速率，改變菌體代謝產(chǎn)物的合成方向，又會影響食用菌的代謝調(diào)控機制，影響發(fā)酵液的理化性質(zhì)，進而影響發(fā)酵的動力學(xué)特性和產(chǎn)物的生物合成［7］。培養(yǎng)溫度過低，菌絲生長緩慢;培養(yǎng)溫度過高，菌絲球松散、稀疏，活力降低，質(zhì)量變差［8］。最適發(fā)酵溫度隨菌種、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件和菌體生長階段不同而改變［1］。巨大口蘑是熱帶地區(qū)的一種大型食用菌，其子實體只發(fā)生在高溫季節(jié)，一般常發(fā)生在6～8月，氣溫24～32℃。人工栽培時必須考慮到巨大口蘑既要高溫，又要高濕，又必須通風(fēng)［9］。本實驗得到巨大口蘑的最適發(fā)酵溫度為28℃。

上官舟建等［3］通過實驗結(jié)果得出，巨大口蘑菌絲在15～35℃的范圍內(nèi)均能生長，其中最適生長溫度為25～30℃，該區(qū)間菌絲生長最快、最旺盛;溫度低于20℃或高于35℃，菌絲生長速度明顯減緩，菌絲呈稀疏狀，生活能力變?nèi)?當溫度低于10℃或高于40℃時菌絲不生長。肖興等［9］通過實驗得出巨大口蘑菌絲在26～34℃的范圍內(nèi)均能良好生長，最適生長溫度為28～30℃，該溫度范圍內(nèi)菌絲生長最快，長勢最好，菌絲粗壯、濃白、致密。本實驗所得數(shù)據(jù)與此相吻合。

3.2 初始pH對菌絲體生長的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基的pH對食用菌生長具有非常明顯的影響，也是影響發(fā)酵過程中各種酶活的重要因素。pH對穩(wěn)定食用菌菌絲細胞內(nèi)酸堿平衡和促進分解吸收培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)具有很大作用，不同食用菌菌絲生長的最適pH各不相同，酶的活性與pH有很大關(guān)系，酶活在最適pH時表現(xiàn)為最強最大，稍高于或低于最適pH時酶活性就會下降。因而菌絲體的培養(yǎng)必須選擇最適 pH，使其新陳代謝處于最佳狀態(tài)［10－11］。

不同的初始pH導(dǎo)致生物量不同，其主要原因可能是pH影響酶的活性，當其太低或太高時會抑制菌體中某些酶的活性，阻礙菌體的新陳代謝。一般認為，細胞內(nèi)的H+或OH－能影響酶蛋白的解離度和電荷情況，改變酶的結(jié)構(gòu)和功能引起酶活性的改變。但培養(yǎng)基的H+或OH－并不是直接作用在胞內(nèi)酶蛋白上，而是首先作用在胞外的弱酸(或弱堿)上，使之成為易于透過細胞膜的分子狀態(tài)的弱酸(或弱堿)，它們進入細胞后，再行解離，產(chǎn)生H+或OH－，改變胞內(nèi)原先存在的中性狀態(tài)，進而影響酶的結(jié)構(gòu)和活性［9］。pH還影響菌體對基質(zhì)的利用速度和細胞的結(jié)構(gòu)，影響菌體的生長和產(chǎn)物的合成。pH還影響菌體細胞膜的電荷狀況，引起膜透性發(fā)生改變，因而影響菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的形成。正是由于以上原因，導(dǎo)致了不同 pH產(chǎn)生了不同的生物量［13］。

3.3 裝液量和搖床轉(zhuǎn)速對液體培養(yǎng)條件的均勻設(shè)計結(jié)果討論

巨大口蘑菌絲生長需要氧氣，溶氧是液體發(fā)酵的一個重要工藝參數(shù)，裝液量和搖床轉(zhuǎn)速均可以改變培養(yǎng)基中溶氧量從而影響巨大口蘑液體發(fā)酵生物量。只要將裝液量和搖床轉(zhuǎn)速控制在合理的范圍內(nèi)，液體培養(yǎng)基的含氧量就能夠保證巨大口蘑菌絲的正常生長，該均勻設(shè)計實驗中裝液量、搖床轉(zhuǎn)速分別采用方白玉［14］和李敏等［15］的研究作為本實驗的中心點。

3.4 接種量對菌絲體生長的影響

接種量的大小會影響菌絲生長的空間、吸氧量及營養(yǎng)的吸收，食用菌為好氧性真菌，液體培養(yǎng)時，主要靠吸收溶解在培養(yǎng)液中的氧氣。當接種量過多時，菌絲之間會形成競爭，不利于菌絲體的生長。接種量過大時，液體培養(yǎng)過程中易形成菌絲團，使菌絲團內(nèi)部通氧困難，菌絲體得率降低;同時，由于接種量過大使得單個菌絲團之間對營養(yǎng)的競爭加劇，不利于單個菌絲團菌絲的生長。由于巨大口蘑菌絲生長周期長，菇蕾(原基)發(fā)生量多，密集成叢，互相爭奪養(yǎng)分，衰弱的菇蕾相繼萎縮死亡，只有較健壯的原基能繼續(xù)發(fā)育長大［12］。

3.5 結(jié)論

巨大口蘑液體菌絲發(fā)酵的最優(yōu)條件為:裝液量179mL、搖床轉(zhuǎn)速 165r/min、發(fā)酵溫度 28℃、初始pH6、最優(yōu)接種量為4片直徑為1.2cm的菌絲塊。在此組合條件下進行液體發(fā)酵，菌絲體培養(yǎng)周期短、產(chǎn)量高、菌絲球均勻細小，為今后巨大口蘑液體發(fā)酵提供理論依據(jù)。

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Optimizing the fermentation conditions of Tricholoma giganteum

LIANG Da－wei1，ZHU Ping2，CHEN Jing－diao1，MA Jian－wei1，MO Mei－h(huán)ua1，*
(1.College of Food Science，South China Agriculture University，Guangzhou 510642，China; 2.College of Food Science，Hai Nan University，Haikou 570228，China)

The optimization of liquid shake－flask fermentation conditions of Tricholoma giganteum was studied by single factor experiment and uniform design method.The results showed that the optimal liquid shake－flask fermentation conditions Tricholoma giganteum were as follows:volume was 179mL medium in 250mL flask，rotate speed was 165r/min，cultivation temperature was 28℃，pH was 6 and the inoculum size was 4 pieces of 1.2cm sclertium in diameter.The weight of dry mycelia achieved to 0.8626g.Through the experiment research，liquid optimal fermentation conditions of Tricholoma giganteum was obtained，theoretical basis would be provided for the future Tricholoma giganteum liquid strain production.

Tricholoma giganteum;fermentation;uniform design

TS201.3

A

1002－0306(2012)08－0228－04

巨大口蘑(Tricholoma giganteum Massee)，又名金福菇、洛巴口蘑、大白口蘑，其朵形優(yōu)美、菌肉肥嫩、香氣濃郁、味甜而鮮、風(fēng)味獨特、商品形狀好，子實體營養(yǎng)豐富、味道鮮美，是一種蛋白質(zhì)和多糖含量較高的優(yōu)質(zhì)食用菌，也是一種野生珍稀食用菌，有極高的營養(yǎng)價值和抗腫瘤、抗突變、抗病毒、降血脂等保健作用［1－3］。目前，巨大口蘑的生產(chǎn)多采用傳統(tǒng)的固體栽培方式，栽培周期長、生物轉(zhuǎn)化率低，難以滿足市場需求。液體發(fā)酵巨大口蘑不受季節(jié)和原材料的影響，液體菌種培養(yǎng)周期短、成本低、能快速增殖菌體細胞、顯著提高生產(chǎn)效率等，已受到人們的廣泛關(guān)注，具有很好的應(yīng)用前景，而巨大口蘑液體發(fā)酵方面的研究報道很少［4－6］。本文通過單因素和均勻設(shè)計對巨大口蘑液體發(fā)酵工藝條件進行了優(yōu)化，旨在為巨大口蘑的進一步開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2011－07－12 *通訊聯(lián)系人

梁大偉(1985－)，男，碩士研究生，研究方向:應(yīng)用微生物學(xué)。

廣東省科技計劃項目(2011B020303007);廣東省科技特派員專項項目(2010A02050700－18)。