高危型HPV感染與宮頸上皮組織中P53、CyclinD1基因表達的關系

歐陽良良　袁育珺　汪紅

【摘要】 目的：觀察P53、細胞周期蛋白D1（CyclinD1）基因在高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）感染宮頸上皮組織中表達情況，并分析P53、CyclinD1與HR-HPV感染的關系。方法：收集2019年1月-2020年12月于本院完成宮頸活檢的100例宮頸上皮組織標本的實驗室資料進行回顧性分析。將其根據(jù)病變程度分為子宮頸癌組（n=47）、宮頸上皮內瘤變組（n=27）及正常組（n=26）。比較三組P53、CyclinD1蛋白陽性表達率與HR-HPV陽性檢出率，分析P53、CyclinD1與HR-HPV的關系。結果：子宮頸癌組與宮頸上皮內瘤變組P53、CyclinD1蛋白陽性表達率、HR-HPV陽性檢出率均高于正常組，且子宮頸癌組中P53、CyclinD1蛋白陽性表達率、HR-HPV陽性檢出率均高于宮頸上皮內瘤變組（P<0.05）。HR-HPV陽性宮頸上皮組織中P53、CyclinD1蛋白陽性表達率均高于HR-HPV陰性的宮頸上皮組織（P<0.05）。HR-HPV感染與宮頸上皮組織中P53、CyclinD1蛋白陽性表達均呈正相關（τ=0.459、0.565，P<0.05）。結論：HR-HPV感染與宮頸上皮組織中P53、CyclinD1基因陽性表達存在一定聯(lián)系。

【關鍵詞】 高危型人乳頭瘤病毒 P53 細胞周期蛋白D1 宮頸上皮組織

[Abstract] Objective： To observe the expression of P53 and CyclinD1 genes in high-risk human papillomavirus （HR-HPV） infection cervical epithelial tissues， and analyze the relationship between P53， CyclinD1 and HR-HPV infection. Method： The laboratory data of 100 cervical epithelial tissue specimens completed cervical biopsy in our hospital from January 2019 to December 2020 were collected for retrospective analysis. According to the lesion degree， they were divided into cervical cancer group （n=47）， cervical intraepithelial neoplasia group （n=27） and normal group （n=26）. The positive expression rates of P53 and CyclinD1 protein and the positive detection rates of HR-HPV were compared among the three groups， and the relationship between P53， CyclinD1 and HR-HPV was analyzed. Result： The positive expression rates of P53， CyclinD1 and positive detection rates of HR-HPV in cervical cancer group and cervical intraepithelial neoplasia group were higher than those in normal group， and the positive expression rates of P53， CyclinD1 and positive detection rate of HR-HPV in cervical cancer group were higher than those in cervical intraepithelial neoplasia group （P<0.05）. The positive expression rates of P53 and CyclinD1 protein in HR-HPV positive cervical epithelial tissues were higher than those in HR-HPV negative cervical epithelial tissues （P<0.05）. HR-HPV infection was positively correlated with P53 and CyclinD1 protein in cervical epithelial tissue （τ=0.459， 0.565， P<0.05）. Conclusion： HR-HPV infection has a certain relationship with the positive expression of P53 and CyclinD1 genes in cervical epithelial tissues.

[Key words] High-risk human papillomavirus P53 CyclinD1 Cervical epithelial tissues

First-author’s address： Eastern Hospital of Jiujiang University Affiliated Hospital， Jiujiang 332000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.22.006

人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染是引發(fā)宮頸癌的重要原因，特別是高危型HPV（high-risk HPV，HR-HPV）感染是宮頸癌病變最為重要因素，威脅女性生命安全[1]。研究顯示，宮頸上皮感染HR-HPV后可通過多種生物學途徑引起細胞生物學行為改變，進而造成細胞癌變[2]。宮頸上皮內瘤變發(fā)展過程中，HPV可長期在宮頸相關細胞內繁殖，促進病變發(fā)展，導致病情加重，且HPV含量越高，感染越重，HR-HPV陽性者宮頸病變程度較陰性者重[3]?？梢?，HR-HPV感染在宮頸癌發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用，尋求HR-HPV感染在子宮頸癌病情變化中可能的分子機制十分必要。P53是一種重要的抑癌基因，可抑制DNA聚合酶功能，阻礙多核苷酸延伸，突變型P53基因可與細胞周期蛋白相結合，促進細胞轉化及增生，加速腫瘤發(fā)生、發(fā)展[4]。細胞周期蛋白D1（CyclinD1）是一種原癌基因，通過與細胞周期素依賴性激酶（CDK）4或CDK6相結合形成復合物，增強DNA轉錄，縮短細胞周期，加速細胞增殖速度，在腫瘤發(fā)展中具有一定作用[5-6]。推測CyclinD1、P53可能與HR-HPV有一定關系，相互作用促進子宮頸癌的發(fā)生及發(fā)展，但目前關于兩者與HR-HPV感染的關系鮮見報道。基于此，本研究主要觀察P53、CyclinD1與HR-HPV感染的關系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019年1月-2020年12月于本院完成宮頸活檢的100例宮頸上皮組織標本的實驗室資料進行回顧性分析。納入標準：（1）子宮頸癌、宮頸上皮內瘤病變符合文獻[7]中診斷標準，且均經(jīng)病理學檢查確診;（2）患者入院前未經(jīng)化療或放療干預;（3）病歷資料、本次研究所需實驗室相關資料完整。排除標準：（1）合并乳腺癌、胃癌等其他惡性腫瘤者;（2）合并肝腎功能不全者;（3）既往存在宮頸手術史或宮頸病變史者;（4）伴血液系統(tǒng)疾病者;（5）凝血功能障礙者。根據(jù)病變程度將組織標本分為子宮頸癌組（n=47）、宮頸上皮內瘤變組（n=27）及正常組（正常炎癥，n=26）。本研究已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 HR-HPV檢測方法 用凱普無菌細胞采集刷取患者宮頸脫落細胞，液氮冷凍后保存在-80 ℃冰箱備用;取液氮冷凍的宮頸組織標本，采用HPV-DNA分型檢測試劑盒（山東達安公司）測定宮頸組織標本中HR-HPV DNA的含量，方法為第2代雜交捕獲法，首先采用分離法抽提DNA，而后進行聚合酶鏈反應（PCR）擴增，最后進行雜交檢測并判斷HR-HPV分型，共測定HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，13種HR-HPV，操作嚴格遵照試劑盒說明書進行;以標本表達值相對光單位（RLU）/陽性標準品閾值（CO）作為病毒負荷量，RLU/CO值越高，病毒負荷量越大;RLU/CO≥1.0則判定為HR-HPV陽性，反之為陰性。

1.2.2 P53、CyclinD1蛋白表達檢測方法 常規(guī)石蠟包埋宮頸上皮組織，4 μm切片;90℃烤箱烤片15 min;常規(guī)脫蠟，進行梯度乙醇脫水（100%、95%、80%、75%），沖洗酒精，置于蒸餾水中清洗，枸櫞酸鹽抗原修復，過氧化氫去除內源性過氧化物酶，加入P53、CyclinD1一抗4 ℃過夜;進行二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色（試劑盒均購自北京夢怡美生物科技公司），鏡下觀察可見黃色顆粒顯色，終止染色;蘇木精復染3 min，碳酸鋰返藍10 s;脫水及透明處理后，中性樹膠封片，以磷酸鹽緩沖溶液（PBS）代替一抗作為陰性對照，PBS為0.01 mol/L，pH=7.4。結果判定：P53、CyclinD1蛋白均表達于細胞核，呈棕黃色染色，每張切片于高倍（×400）鏡下選擇5個視野觀察100個細胞，取陽性細胞占比的平均值。P53以陽性細胞占比<10%為陰性（-）;陽性細胞占比10%～25%為弱陽性（+）;陽性細胞占比26%～50%為中度陽性（++）;陽性細胞占比超過50%為強陽性（+++）。CyclinD1以無陽性細胞為陰性（-）;陽性細胞占比低于10%為弱陽性（+）;陽性細胞占比為10%～25%為中度陽性（++）;陽性細胞占比超過25%為強陽性（+++）。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 23.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，三組比較采用方差分析，兩組比較采用t檢驗;計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗，若期望值<5，采用連續(xù)校正字2檢驗;等級資料采用秩和檢驗;宮頸上皮組織中P53、CyclinD1基因表達與HR-HPV的關系采用Kendall’s tau-b等級相關系數(shù)檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組一般資料比較 正常組年齡35～65歲，平均（50.36±2.45）歲;身體質量指數(shù)（BMI）17.6～26.9 kg/m2，平均（22.36±1.21）kg/m2。宮頸上皮內瘤變組年齡34～64歲，平均（50.48±2.41）歲;BMI 17.9～26.7 kg/m2，平均（22.45±1.17）kg/m2。子宮頸癌組年齡32～64歲，平均（50.12±2.50）歲;BMI 18.1～26.8 kg/m2，平均（22.33±1.18）kg/m2。三組一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 三組P53、CyclinD1蛋白表達情況比較 子宮頸癌組與宮頸上皮內瘤變組P53、CyclinD1蛋白陽性表達率均高于正常組，且子宮頸癌組中P53、CyclinD1蛋白陽性表達率均高于宮頸上皮內瘤變組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

2.3 三組HR-HPV陽性檢出率比較 子宮頸癌組、宮頸上皮內瘤變組、正常組患者HR-HPV陽性檢出率分別為93.62%（44/47）、40.74%（11/27）、15.38%（4/26）;子宮頸癌組與宮頸上皮內瘤變組HR-HPV陽性檢出率均高于正常組，差異均有統(tǒng)計學意義（字2=45.497、4.197，P<0.001）;且子宮頸癌組HR-HPV陽性檢出率高于宮頸上皮內瘤變組，差異有統(tǒng)計學意義（字2=25.125，P<0.001）。

2.4 HR-HPV陽性與陰性宮頸上皮組織中P53、CyclinD1蛋白陽性表達情況比較 HR-HPV陽性宮頸上皮組織中P53、CyclinD1蛋白陽性表達率均高于HR-HPV陰性宮頸上皮組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

2.5 宮頸上皮組織中P53、CyclinD1蛋白表達與HR-HPV的關系分析 經(jīng)Kendall’s tau-b相關系數(shù)檢驗，結果顯示，HR-HPV感染與宮頸上皮組織中P53、CyclinD1蛋白陽性表達均呈正相關（P<0.05），見表3。

3 討論

盡管近年宮頸癌篩查及防治工作不斷進展，但其發(fā)病率及病死率仍處于較高水平，且發(fā)病年齡趨于年輕化趨勢[8]。研究顯示，HR-HPV感染是宮頸癌發(fā)生重要原因，且抑癌基因失活、癌基因激活、DNA轉錄失控、細胞周期調控紊亂等均與宮頸癌發(fā)生發(fā)展密切相關[9-10]。宮頸上皮內瘤變中HR-HPV感染不直接影響細胞生物學行為，常通過改變宿主細胞基因表達產生相應作用，細胞中的原癌、抑癌基因均受到HR-HPV調控[11]。

P53是目前常見的抑癌基因，正常情況下，P53基因不穩(wěn)定，半衰期短，一旦細胞內DNA受到異常刺激或損傷時，P53被激活，蛋白表達增加，半衰期延長，參與致癌作用[12]。P53基因活化不僅使細胞停止在G1或者G2期，修復損傷細胞，還可誘發(fā)細胞凋亡，促進細胞轉化及增生，導致腫瘤的發(fā)生[13]。但P53抑癌功能常因突變而消失，當P53功能失活，會使得受損DNA進入細胞周期，促進細胞增殖，導致腫瘤發(fā)生[14]。CyclinD1是原癌基因，在細胞周期中具有正調節(jié)作用，可與相應的激酶結合形成復合物后，促進DNA轉錄，使得細胞發(fā)生分裂及增殖，增強細胞生長活力[15-16]。據(jù)報道，當CyclinD1表達異常時，細胞發(fā)生分裂及增殖紊亂，導致腫瘤發(fā)生及發(fā)展[17]。綜上推測P53、CyclinD1基因表達可能與HR-HPV感染有關，相互作用共同促進宮頸癌發(fā)生及發(fā)展。

本研究結果顯示，子宮頸癌組、宮頸上皮內瘤變組的P53、CyclinD1蛋白陽性表達率、HR-HPV陽性檢出率均高于正常組，且以子宮頸癌組最高，其次是宮頸上皮內瘤變組;HR-HPV陽性宮頸組織中的P53、CyclinD1蛋白陽性表達率高于HR-HPV陰性宮頸組織，說明隨著子宮頸癌病變發(fā)展及HR-HPV的持續(xù)感染，P53、CyclinD1蛋白表達升高，推測HR-HPV感染與P53、CyclinD1蛋白表達有關。分析其原因可能為，HR-HPV的遺傳物質可整合進入宮頸上皮細胞的基因組DNA，引起多種基因表達異常，HR-HPV通過調控原癌、抑癌基因表達影響細胞生物學行為，促進宮頸癌發(fā)展[18]。CyclinD1蛋白表達升高或基因擴增時，CyclinD1-CDK復合物增加，促使細胞異常增殖，抑制細胞凋亡，促進腫瘤發(fā)生及發(fā)展[19]。P53過表達時，受損的DNA常進入細胞周期，促進細胞增殖，導致腫瘤發(fā)生[20]。為驗證假說，本研究進一步做相關性檢驗發(fā)現(xiàn)，HR-HPV與宮頸上皮組織中P53、CyclinD1蛋白陽性表達呈正相關（P<0.05），證實上述假說，提示HR-HPV感染可能與宮頸上皮組織中P53、CyclinD1蛋白表達有關，HR-HPV感染可能通過原癌及抑癌基因異常表達造成生物學行為改變，最終引發(fā)宮頸癌。未來可考慮通過阻斷P53、CyclinD1蛋白表達誘導HR-HPV感染細胞凋亡。但目前關于P53、CyclinD1基因表達與HR-HPV感染關系的具體作用機制尚未明確，未來仍需進一步探究。

綜上所述，子宮頸癌組織中P53、CyclinD1蛋白高度表達，且P53、CyclinD1蛋白陽性表達與HR-HPV感染存在一定聯(lián)系，P53、CyclinD1有望成為子宮頸癌基因治療的潛在靶點。

參考文獻

[1] Zhang L，Xie F，Wang X，et al.Previous cervical cytology and high-risk human papillomavirus testing in a cohort of patients with invasive cervical carcinoma in Shandong Province， China[J/OL].PLoS One，2017，12（6）：e0180618.

[2] Zhang L，Bi Q，Deng H，et al.Human papillomavirus infections among women with cervical lesions and cervical cancer in Eastern China： genotype-specific prevalence and attribution[J].BMC Infect Dis，2017，17（1）：107.

[3] Lu Z，Chen H，Zheng X M，et al.Expression and clinical significance of high-risk human papillomavirus and invasive gene in cervical carcinoma[J].Asian Pac J Trop Med，2017，10（2）：195-200.

[4]趙子騫，梁新苗，張飛躍，等.基于生物信息學技術探討宮頸癌腫瘤組織中P53突變、共表達網(wǎng)絡及臨床轉歸分析[J].中國醫(yī)藥生物技術，2019，14（1）：27-32.

[5]周密，羅祥力，馮露.Beclin1，EGFR，cyclinD1在新輔助化療宮頸癌組織中的表達及臨床意義[J].標記免疫分析與臨床，2020，27（2）：61-67.

[6] Wang P，Liu S，Cheng B，et al.Promoting effect of cyclin D1 overexpression on proliferation and epithelial mesenchymal transition of cervical squamous cell carcinoma SiHa cells[J].Chin J Pathol，2017，46（3）：187-192.

[7]謝幸，孔北華，段濤.婦產科學[M].9版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2018：295-298.

[8] Zhou J，Wu S G，Sun J Y，et al.Clinicopathological features of small cell carcinoma of the uterine cervix in the surveillance，epidemiology，and end results database[J].Oncotarget，2017，8（25）：40425-40433.

[9] Brebi P，Ili C G，Andana A，et al.Frequency of Human papillomavirus in women attending cervical cancer screening program in Chile[J].Bmc Cancer，2017，17（1）：518.

[10]朱若熙，趙衛(wèi)紅，郝敏.細胞因子IL-2、IL-10與高危型HPV感染和宮頸癌關系的研究進展[J].國際婦產科學雜志，2019，46（2）：125-128.

[11]陳佳佳，陸曉媛，經(jīng)莉.宮頸癌組織中CAC1的表達變化及其與宮頸HR-HPV感染的關系[J].標記免疫分析與臨床，2020，27（2）：215-218.

[12]趙若晗，史嘉翊，劉馨璥，等.CDK1，CENPT和P53在乳腺癌中的表達及意義[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2020，17（9）：28-31.

[13] Zhang Y，Na R，Wang X.LncRNA WT1-AS up-regulates P53 to inhibit the proliferation of cervical squamous carcinoma cells[J].BMC Cancer，2019，19（1）：1052.

[14]張桂芳，余靜容，陳小青.卵巢癌患者P53蛋白，COX-2，Bcl-2，GST-π表達情況及其與預后的關系研究[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2019，16（34）：120-123.

[15] Cao L，Liu Y，Wang D，et al.MiR-760 suppresses human colorectal cancer growth by targeting BATF3/AP-1/cyclinD1 signaling[J].J Exp Clin Cancer Res，2018，37（1）：83.

[16] Benard O，Qian X，Qian X，et al.p21CIP1 Promotes Mammary Cancer-Initiating Cells via Activation of Wnt/TCF1/CyclinD1 Signaling[J].Mol Cancer Res，2019，17（7）：1571-1581.

[17] Ramos-García P，González-Moles M á，Ayén á，et al.

Asymmetrical proliferative pattern loss linked to cyclin D1 overexpression in adjacent non-tumour epithelium in oral squamous cell carcinoma[J].Arch Oral Biol，2019，97（9）：12-17.

[18]石麗萍，生秀杰.宮頸癌前病變組織中高危型HPV感染與原癌基因、抑癌基因表達的相關性分析[J].海南醫(yī)學院學報，2017，23（1）：14-17.

[19]侯玉朱，王蓁，袁芳.宮頸癌組織P53和CyclinD1蛋白表達及意義[J].齊魯醫(yī)學雜志，2016，31（2）：130-132.

[20]康連杰，郭勝香，董昂.宮頸上皮病變中高危型HPV感染與病變分級及P53、p16INK4a和細胞周期蛋白表達的關系[J].臨床和實驗醫(yī)學雜志，2020，19（4）：391-394.

（收稿日期：2021-03-10） （本文編輯：田婧）