細(xì)小動(dòng)脈硬化性腦小血管病動(dòng)物模型☆

魏佳婷 陳藝聰 曾進(jìn)勝

細(xì)小動(dòng)脈硬化性腦小血管?。╝rteriolosclerotic cerebal small vessel disease，aCSVD）是最常見的腦小血管?。╟erebral small vessel disease，CSVD）類型[1]，明確 aCSVD 的病理機(jī)制是探索其診療手段的關(guān)鍵所在，復(fù)制合適的動(dòng)物模型對aCSVD的病理機(jī)制或治療靶點(diǎn)等的研究具有重要意義。因此，本文將從行為學(xué)、影像學(xué)和病理改變等角度對目前常用的 aCSVD動(dòng)物模型進(jìn)行綜述，為建立更接近臨床實(shí)際的 aCSVD動(dòng)物模型提供參考。

1 模型動(dòng)物選擇

嚙齒類動(dòng)物是目前最常用于構(gòu)建aCSVD模型的動(dòng)物，其主要優(yōu)勢有成本-效益比低、繁育周期短和腦體積小，適于行全腦切片。而且，隨著基因編輯技術(shù)在嚙齒類動(dòng)物中的應(yīng)用日趨成熟，嚙齒類動(dòng)物已成為研究分子機(jī)制和探索治療靶點(diǎn)的重要工具。超高場強(qiáng)磁共振的應(yīng)用也促進(jìn)了嚙齒類動(dòng)物神經(jīng)影像學(xué)的發(fā)展[2-3]。但嚙齒類動(dòng)物模型也存在顯著的不足之處，嚙齒類動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)、生理和行為學(xué)與人類差異大，限制了其研究結(jié)果的臨床轉(zhuǎn)化。比如，人類腦白質(zhì)非常豐富，約占全腦體積 50%，而且尸檢結(jié)果顯示腦白質(zhì)損害是人類aCSVD的重要病理改變，但嚙齒類動(dòng)物腦白質(zhì)量少，僅占全腦體積14%，與人類差異大，降低了其在腦白質(zhì)高信號等研究中的應(yīng)用價(jià)值[4-6]。而且人類大腦的腦回和腦溝豐富，但嚙齒類動(dòng)物為無腦回動(dòng)物，各腦區(qū)之間缺乏明確的分界標(biāo)志[7]。另外，研究顯示阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征與aCSVD密切相關(guān)[8]，雖然嚙齒類動(dòng)物已廣泛應(yīng)用于睡眠障礙的研究中，但其睡眠特征與人類截然不同，首先，人類為單相性或雙相性睡眠，而嚙齒類動(dòng)物為多相性睡眠；其次，人類為夜間睡眠，嚙齒類動(dòng)物則晝伏夜動(dòng)；最后，與人類相比，嚙齒類動(dòng)物的快速動(dòng)眼睡眠和非快速動(dòng)眼睡眠周期顯著縮短。因此，如果利用嚙齒類動(dòng)物研究睡眠障礙與aCSVD之間的關(guān)系，其結(jié)果能否延伸至人類仍不明確[9-10]。

近年來，有研究者采用非人靈長類動(dòng)物（non-human primate，NHP）構(gòu)建 aCSVD模型[11-15]。與嚙齒類動(dòng)物模型相比，構(gòu)建NHP動(dòng)物模型的主要不足包括繁育成本高和倫理要求更嚴(yán)格。但NHP具有嚙齒類動(dòng)物無法比擬的優(yōu)勢，其神經(jīng)系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)、血流動(dòng)力學(xué)、生理和行為學(xué)與人類更為相似。比如，NHP的大腦白質(zhì)體積占比與人類相似，并且具有腦回腦溝結(jié)構(gòu)，因此更適用于腦白質(zhì)高信號或腦萎縮等的基礎(chǔ)研究[7]；另外，NHP的睡眠覺醒周期、睡眠結(jié)構(gòu)、長度和穩(wěn)定性都與人類接近[16]，在探索睡眠障礙與aCSVD相關(guān)性的研究中，其應(yīng)用價(jià)值高，而且，針對NHP的行為學(xué)評估方法和睡眠行為監(jiān)測方法都已建立[15，17]，這也提高了NHP應(yīng)用于aCSVD相關(guān)研究中的可行性。再者，神經(jīng)影像學(xué)是 aCSVD研究的重要部分，不同于嚙齒類動(dòng)物，NHP對磁共振檢查的場強(qiáng)要求較低，目前臨床上常用的3.0 T磁共振也適用于NHP的影像研究[18-19]。因此，在aCSVD的臨床前研究中，NHP具有嚙齒類動(dòng)物無法取代的地位。

2 模型構(gòu)建方法

目前常用于復(fù)制CSVD動(dòng)物模型的方法主要包括慢性低灌注、微小栓子血管栓塞、激光誘導(dǎo)穿支動(dòng)脈閉塞和慢性高血壓導(dǎo)致的CSVD模型等，其中僅慢性高血壓導(dǎo)致的CSVD模型存在細(xì)小動(dòng)脈硬化的病理改變，因此成為復(fù)制aCSVD動(dòng)物模型的重要方法。該方法多采用嚙齒類動(dòng)物或NHP，其中常用的嚙齒類動(dòng)物模型包括易卒中型自發(fā)性高血壓大鼠、易卒中型腎血管性高血壓大鼠和血管緊張素II誘導(dǎo)慢性高血壓導(dǎo)致的aCSVD模型，NHP動(dòng)物模型則主要通過胸主動(dòng)脈狹窄復(fù)制慢性高血壓導(dǎo)致的aCVSD模型。

2.1 易卒中型自發(fā)性高血壓大鼠（stroke-prone spontaneously hypertensive rats，SHRSP） 19 世紀(jì) 60 年代，日本京都大學(xué)研究人員發(fā)現(xiàn)部分雄性Wistar大鼠具有自發(fā)性高血壓，于是研究人員將這些雄性大鼠與血壓稍高于平均水平的雌性大鼠進(jìn)行交配，接著從所得的F1代中篩選收縮壓大于150 mmHg的子代，并進(jìn)行近交，近交約20代后，最終形成了所有成年雄性和雌性大鼠均發(fā)生自發(fā)高血壓的近交系自發(fā)性高血壓大鼠 （spontaneous hypertensive rats，SHR）[20]，SHRSP是在 SHR的基礎(chǔ)上給予特殊的高鹽低蛋白飲食發(fā)展而來的[21]。9～12周齡時(shí)，SHRSP血壓可達(dá) 200 mmHg以上[22-23]。24周齡時(shí)，新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)（novel-object recognition test，NORT）和 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示SHRSP的非空間記憶能力顯著下降，而空間學(xué)習(xí)能力沒有顯著受損[24]。SHRSP在9～12月齡時(shí)出現(xiàn)自發(fā)性皮層和皮質(zhì)下卒中，包括出血性和缺血性卒中，卒中發(fā)病率約80%[22-23]。在出現(xiàn)腦卒中癥狀的SHRSP大鼠中，MRI上可以觀察到缺血性卒中、出血性卒中病灶和腦白質(zhì)高信號病灶，動(dòng)態(tài)對比增強(qiáng)磁共振顯示病灶的血腦屏障滲透性顯著增強(qiáng)，動(dòng)脈自旋標(biāo)記顯示病灶腦血流量顯著下降[25]，而在尚未出現(xiàn)卒中癥狀的SHRSP中，MRI上則尚不能觀察到腦白質(zhì)高信號病變[26]。小動(dòng)脈內(nèi)皮功能障礙和血腦屏障受損是 SHRSP的早期病理改變，3～5周齡時(shí)，SHRSP雖尚未出現(xiàn)高血壓，病理結(jié)果卻顯示其已出現(xiàn)內(nèi)皮功能障礙和內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白減少[27]。隨著年齡增長，SHRSP小動(dòng)脈病變逐漸加重，雙光子活體光學(xué)成像顯示，17～28周齡時(shí)其小動(dòng)脈病變主要表現(xiàn)為血管壁完整性受損、紅細(xì)胞流速減慢和管壁紅細(xì)胞附著，30～32周齡時(shí)小動(dòng)脈管腔中紅細(xì)胞栓塞形成顯著增多[28]，而且在病變嚴(yán)重的小動(dòng)脈壁上可以觀察到淀粉樣蛋白沉積[28-29]。在出現(xiàn)腦卒中癥狀的SHRSP中，病理顯示其腦小動(dòng)脈病變包括大分子物質(zhì)滲出、血管壁重構(gòu)、管腔狹窄、管腔栓塞，腦組織呈海綿狀改變，即腦組織疏松和空泡形成[25]，但是在尚未出現(xiàn)卒中癥狀的SHRSP中，病理只能觀察到腦小動(dòng)脈病變，尚未出現(xiàn)顯著的腦白質(zhì)脫髓鞘或空泡形成[26]。

慢性低灌注可促進(jìn)SHRSP的腦白質(zhì)病變，對12周齡的SHRSP行單側(cè)頸動(dòng)脈閉塞術(shù)，術(shù)后動(dòng)態(tài)對比增強(qiáng)磁共振顯示其白質(zhì)滲透常數(shù)顯著增大，彌散張量成像顯示其表面彌散系數(shù)顯著增大，各向異性系數(shù)顯著減小，提示血腦屏障受損和腦白質(zhì)微結(jié)構(gòu)損害加重。病理顯示，與SHRSP假手術(shù)組相比，單側(cè)頸動(dòng)脈閉塞術(shù)后，內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)進(jìn)一步下降，腦白質(zhì)中IgG滲出顯著增加，提示血腦屏障受損加重，血腦屏障受損與星形膠質(zhì)細(xì)胞中HIF-α和MMP表達(dá)上調(diào)密切相關(guān)[30-31]。

SHRSP可較好地模擬人類aCSVD的臨床癥狀、影像學(xué)和病理改變，慢性低灌注的 SHRSP可進(jìn)一步模擬臨床上高血壓和頸動(dòng)脈狹窄共同作用導(dǎo)致的aCSVD。但是，該模型的遺傳背景特殊，不能排除遺傳因素對血管病變或腦實(shí)質(zhì)病變的影響。

2.2 易卒中型腎血管性高血壓大鼠（stroke-prone renovascular hypertensive rat，RHRSP） 該模型采用內(nèi)徑0.3 mm的銀夾縮窄大鼠雙側(cè)腎動(dòng)脈近腹主動(dòng)脈端，成功復(fù)制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)依賴的慢性高血壓。術(shù)后 12～20周 RHRSP血壓可升至～200 mm Hg，術(shù)后 6～34周，～60%的RHRSP出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，包括偏癱、四肢麻痹和癲癇發(fā)作等，其發(fā)病率顯著高于單側(cè)腎動(dòng)脈狹窄模型[32]。術(shù)后20周Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示 RHRSP的空間學(xué)習(xí)能力顯著受損[33-34]。MRI T2加權(quán)序列顯示嚴(yán)重腦白質(zhì)高信號病灶形成，其中以胼胝體和外囊最為顯著[34]。病理顯示其腦白質(zhì)出現(xiàn)顯著脫髓鞘、神經(jīng)纖維丟失和空泡形成，其中以胼胝體和外囊最為顯著，腦白質(zhì)中白蛋白滲出顯著增多、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞顯著增生、TNF-α水平顯著升高，提示血腦屏障受損和炎癥反應(yīng)增強(qiáng)[33-34]。梗死或者出血病灶主要位于皮層、頂葉和枕葉腦白質(zhì)，小腦和基底節(jié)卒中灶較少見，梗死灶由小動(dòng)脈閉塞引起，出血灶則由小動(dòng)脈壁纖維素性壞死或者微動(dòng)脈瘤破裂導(dǎo)致[32]。小動(dòng)脈病理改變包括血管壁α-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)顯著上調(diào)、平滑肌細(xì)胞增生、膠原蛋白I/IV沉積顯著增加、管壁纖維素性壞死、透明變性、管壁增厚和管腔狹窄[32-34]，除了小動(dòng)脈病變，側(cè)腦室附近的小靜脈壁膠原蛋白-I/IV沉積也顯著增加[35]。

慢性低灌注可進(jìn)一步促進(jìn)RHRSP的腦白質(zhì)病變，與RHRSP相比，雙側(cè)頸動(dòng)脈閉塞的RHRSP的空間學(xué)習(xí)能力進(jìn)一步下降，病理顯示其彌漫性腦白質(zhì)病變、內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白減少、血腦屏障受損和小靜脈壁膠原蛋白-I/IV沉積加劇[35]。

RHRSP可較好地模擬人類aCSVD的臨床癥狀、影像學(xué)和病理改變，RHRSP聯(lián)合慢性低灌注可進(jìn)一步模擬臨床上高血壓和頸動(dòng)脈狹窄共同作用導(dǎo)致的aCSVD，而且與SHRSP相比，RHRSP能夠避免遺傳因素對血管或腦實(shí)質(zhì)病變的影響。其不足是不同的大鼠個(gè)體之間腎動(dòng)脈直徑存在差異，實(shí)際建模時(shí)難以統(tǒng)一腎動(dòng)脈縮窄程度。

2.3 血管緊張素II（Angiotensin II，Ang II）誘導(dǎo)高血壓該模型使用Ang II誘導(dǎo)嚙齒類動(dòng)物形成高血壓，既往研究通常采用皮下注射的方法間斷給藥，現(xiàn)在則主要通過皮下埋泵的方法持續(xù)給藥，給藥速度一般為400～1000 ng/（kg·min），血壓改變程度和給藥速度相關(guān)。Ang II[800～1000 ng/（kg·min）] 持續(xù)給藥 4 周后 C57Bl/6 小鼠收縮壓升至170 mmHg[36]，NORT顯示其非空間記憶能力顯著受損，常規(guī) MRI和 DTI顯示小鼠腦室體積增大、海馬萎縮、腦白質(zhì)各向異性系數(shù)值減小，但是尚未觀察到腦白質(zhì)高信號，提示白質(zhì)微結(jié)構(gòu)受損，但尚未引起顯著髓鞘脫失，這可能與觀察時(shí)間較短有關(guān)[37]。病理結(jié)果顯 Ang II誘導(dǎo)的高血壓小鼠的穿支動(dòng)脈呈向心性重構(gòu)，表現(xiàn)為管腔狹窄和管壁/管腔比值增大[36]。此外，研究顯示腎素-血管緊張素系統(tǒng)的各個(gè)組分亦均在大腦中獨(dú)立存在，Ang II除了通過引起高血壓導(dǎo)致腦小血管病變之外，還可直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞Ang II 1型受體（angiotensin II type 1 receptor，AT1R），引起小動(dòng)脈內(nèi)皮素-1合成增加，內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，微循環(huán)血管阻力增大[38]，并促進(jìn)神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)。與AT1R不同，表達(dá)于大腦中的Ang II 2型受體（an giotensin II type 2 receptor，AT2R）具有抗神經(jīng)炎癥和神經(jīng)保護(hù)作用[39]。

Ang II誘導(dǎo)高血壓能夠模擬臨床高血壓引起的小動(dòng)脈病變和腦白質(zhì)微結(jié)構(gòu)受損等，可用于早期腦白質(zhì)微結(jié)構(gòu)受損的研究，但是Ang II誘導(dǎo)高血壓僅適用于小動(dòng)物，而大動(dòng)物如NHP等由于體重大和觀察周期長，其藥物需求大，成本-效益比高，使得Ang II誘導(dǎo)高血壓在大動(dòng)物中難以應(yīng)用。而且，Ang II引起腦血管病變的機(jī)制并不限于高血壓，Ang II還可直接作用于大腦中的腎素-血管緊張素系統(tǒng)，使得慢性高血壓導(dǎo)致的aCSVD的研究變得更加復(fù)雜。

2.4 胸主動(dòng)脈縮窄 MOSS等[13-15]采用血管夾夾閉恒河猴部分胸主動(dòng)脈腔徑，并用縫線縫合夾閉的部分管腔，使其胸主動(dòng)脈腔徑縮窄至2.0～2.5 cm，狹窄率達(dá)75%～80%。術(shù)后狹窄部位以上血壓平均水平可達(dá)170 mmHg/100 mmHg，狹窄部位以下血壓平均水平為80 mmHg/50 mmHg。術(shù)后1年，延遲樣本非匹配任務(wù) （delayed non-matching to sample test，DNMS） 和概念變換任務(wù) （concept set-shifting task，CSST）測試顯示術(shù)后收縮壓＞150 mmHg的恒河猴的注意力、短期記憶和執(zhí)行功能顯著受損，而術(shù)后血壓輕度升高（＜150 mmHg）的恒河猴的認(rèn)知功能受損不明顯。病理結(jié)果顯示其小動(dòng)脈病變主要表現(xiàn)為血管壁增厚，但纖維蛋白原滲出不明顯，并且未觀察到節(jié)段性小動(dòng)脈壞死、微動(dòng)脈瘤形成或動(dòng)脈粥樣硬化等尚未觀察到，腦實(shí)質(zhì)病理改變主要表現(xiàn)為大腦皮層、白質(zhì)、小腦和腦干微梗死灶形成（直徑＜500 μm），以內(nèi)囊、放射冠和半卵圓區(qū)最為顯著，梗死灶形狀不一，皮層微梗死灶主要表現(xiàn)為神經(jīng)元丟失，白質(zhì)微梗死灶則表現(xiàn)為有髓纖維丟失，兩者均伴小膠質(zhì)細(xì)胞激活和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，但尚未觀察到顯著脫髓鞘、腔隙性梗死或微出血。不足的是，研究者未對該模型的神經(jīng)影像學(xué)改變進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。該模型腦實(shí)質(zhì)病變以微梗死為主要病理改變的原因可能有兩個(gè)：一是微梗死為aCSVD的早期表現(xiàn)，而術(shù)后觀察時(shí)間較短，僅 1年，因此病理改變?nèi)砸晕⒐Ｋ罏橹?，尚未出現(xiàn)其他病理改變；二是胸主動(dòng)脈狹窄雖然成功構(gòu)建了高血壓模型，但此時(shí)大腦處于高灌注條件下，而臨床上aCSVD患者常合并顱內(nèi)外大動(dòng)脈狹窄，處于低灌注狀態(tài)，與該動(dòng)物模型明顯不同，因此該動(dòng)物模型無法成功復(fù)制aCSVD的病理改變。

胸主動(dòng)脈狹窄恒河猴模型可模擬慢性高血壓導(dǎo)致的微梗死，并采用復(fù)雜的行為學(xué)評估方法對其認(rèn)知功能改變進(jìn)行研究，證實(shí)高血壓與執(zhí)行功能和注意能力受損密切相關(guān)。但是該模型亦具有顯著不足之處，首先，胸主動(dòng)脈狹窄操作難度大，難以推廣。其次，該模型中，恒河猴腦部處于高灌注狀態(tài)，與臨床上aCSVD患者的血流動(dòng)力學(xué)明顯不同。最重要的是，該模型的病理改變和aCSVD患者的病理改變?nèi)源嬖陲@著差異，其腦實(shí)質(zhì)中未出現(xiàn)腔隙性梗死或顯著腦白質(zhì)脫髓鞘病灶，小動(dòng)脈病變以血管壁增厚為主，而缺乏人類aCSVD所具有的纖維素樣壞死、或透明變性等改變。

除了胸主動(dòng)脈縮窄，有研究亦使用腎動(dòng)脈狹窄的方法復(fù)制慢性高血壓非人靈長類動(dòng)物模型，但是其所得結(jié)論不一。WOOD等[40]通過單側(cè)腎動(dòng)脈狹窄構(gòu)建慢性高血壓狨猴模型，術(shù)后僅約40%的狨猴出現(xiàn)高血壓，并且在術(shù)后6周，狨猴血壓開始回落，而PANEK等[41]亦通過單側(cè)腎動(dòng)脈狹窄，使腎動(dòng)脈血流速度下降50%，成功復(fù)制慢性高血壓食蟹猴模型，術(shù)后4周75%（6/8）的食蟹猴血壓顯著升高，平均血壓由95 mmHg升至130 mmHg，并維持至術(shù)后 24周。GOLDBLATT[42]通過雙側(cè)腎動(dòng)脈狹窄術(shù)構(gòu)建慢性高血壓獼猴模型，術(shù)后獼猴血壓顯著升高，收縮壓可達(dá)200 mmHg，但是該模型術(shù)后獼猴死亡率高，這可能與該研究使用同一大小的血管夾縮窄腎動(dòng)脈有關(guān)，不同獼猴個(gè)體之間動(dòng)脈直徑變異大，使用同一大小的銀夾可導(dǎo)致部分獼猴腎動(dòng)脈嚴(yán)重狹窄，術(shù)后出現(xiàn)嚴(yán)重腎衰，導(dǎo)致死亡。但是，至今尚無研究觀察腎血管性高血壓非人靈長類動(dòng)物模型是否存在與人類 aCSVD相似的癥狀、影像學(xué)或病理改變。

3 總結(jié)和展望

aCSVD的臨床診斷和治療仍面臨許多局限和挑戰(zhàn)，構(gòu)建能夠精確模擬人類aCSVD病理改變和臨床過程的動(dòng)物模型對推動(dòng)aCSVD臨床研究具有重要意義。慢性高血壓導(dǎo)致的aCSVD模型能較好地模擬人類aCSVD病理生理改變，目前，aCSVD動(dòng)物模型的復(fù)制多采用嚙齒類動(dòng)物，但嚙齒類動(dòng)物的大腦解剖結(jié)構(gòu)、生理和行為學(xué)等方面與人類之間差異較大，限制了其研究結(jié)果的臨床轉(zhuǎn)化。復(fù)制慢性高血壓非人靈長類動(dòng)物模型將為aCSVD的臨床前研究提供較理想的實(shí)驗(yàn)工具，目前胸主動(dòng)脈狹窄是用于復(fù)制慢性高血壓非人靈長類動(dòng)物模型的主要方法，但是該模型腦部高灌注狀態(tài)和病理改變等與人類aCSVD仍存在明顯差異。RHRSP在aCSVD研究中的成功應(yīng)用，提示雙側(cè)腎動(dòng)脈狹窄導(dǎo)致慢性高血壓可能是構(gòu)建aCSVD非人靈長類動(dòng)物模型的可行方法。