免疫評分在腫瘤預(yù)后及療效預(yù)測中的研究進(jìn)展

李玉婷，丁軍利，王惠宇，許雋穎

0 引言

一直以來，臨床上普遍采用美國癌癥聯(lián)合委員會/國際癌癥控制聯(lián)盟（AJCC/UICC）提出的TNM系統(tǒng)作為經(jīng)典的指導(dǎo)方針來對腫瘤進(jìn)行分期，主要根據(jù)原發(fā)腫瘤范圍（T）、區(qū)域淋巴結(jié)受累程度（N）、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M）來對腫瘤進(jìn)行評估，是一種基于腫瘤細(xì)胞特征的分類方法。盡管沿用至今的TNM系統(tǒng)在多種腫瘤中顯示出其強(qiáng)大的功能性，但越來越多的研究表明TNM系統(tǒng)不能提供完整的預(yù)后信息，同一TNM分期的患者在預(yù)后方面存在顯著差異，甚至分期較早的患者比分期晚的患者預(yù)后更差[1]。這可能是由于TNM分期未能對宿主免疫狀態(tài)及腫瘤微環(huán)境的特征進(jìn)行評估，因此不能全面而精準(zhǔn)地預(yù)測患者的預(yù)后。由此，Galon等基于免疫結(jié)構(gòu)這一概念提出了免疫評分（Immunoscore,IS）來彌補(bǔ)傳統(tǒng)TNM分期在預(yù)后方面的不足[2]。免疫評分最早在結(jié)腸癌患者中展現(xiàn)出優(yōu)于傳統(tǒng)TNM分期預(yù)測預(yù)后的作用[3]，而不斷進(jìn)行規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化改進(jìn)后的免疫評分系統(tǒng)也在多種實體瘤中展現(xiàn)出其作為一種潛在生物標(biāo)志物對腫瘤患者預(yù)后及療效的強(qiáng)大預(yù)測潛力。本文就免疫評分在腫瘤預(yù)后、療效預(yù)測及其在臨床中的應(yīng)用研究進(jìn)展作一綜述。

1 免疫評分——基于免疫結(jié)構(gòu)的腫瘤分類新方法

越來越多的證據(jù)表明，癌癥發(fā)展依賴于其發(fā)生發(fā)展過程中所處的復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境，腫瘤微環(huán)境由腫瘤細(xì)胞及其周圍的免疫細(xì)胞、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴管等構(gòu)成。有學(xué)者提出用“免疫結(jié)構(gòu)”（immune contexture）這一概念來描述腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment,TME）浸潤的空間組織和密度，主要指獲得性免疫細(xì)胞在不同腫瘤區(qū)域內(nèi)的類型、功能定位、密度和位置[4]。免疫結(jié)構(gòu)主要由CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）和記憶T細(xì)胞（CD45RO+）的密度、它們在腫瘤中心（tumor center,CT）和腫瘤浸潤交界（invasive margin,IM）的位置以及第三級淋巴結(jié)構(gòu)（tertiary lymphoid structures,TLS）的質(zhì)量和其他功能成分，如TH1相關(guān)因子（IFNG、Tbet、IRF1、IL12）、趨化因子（CX3CL1、CXCL9、CXCL10、CCLL10）等構(gòu)成[2]。在結(jié)腸癌、肺癌、膀胱癌、肝細(xì)胞肝癌等多個瘤種中已證實免疫結(jié)構(gòu)對患者預(yù)后的評估有重要意義[5]。

腫瘤發(fā)展過程和宿主免疫反應(yīng)之間存在著復(fù)雜而持續(xù)的相互作用[3-4,6-7]。而經(jīng)典的TNM分期卻未能基于宿主免疫狀態(tài)對預(yù)后進(jìn)行評估，盡管目前做了一些改進(jìn)，包括納入腫瘤生物標(biāo)記的免疫組織化學(xué)因素[8-9]、亞細(xì)胞群體的流式細(xì)胞術(shù)[10]、分子標(biāo)記[11]、深層蛋白質(zhì)組[12]或遺傳特征[13]等，但這些方法仍主要基于腫瘤細(xì)胞的特征，而忽略了腫瘤微環(huán)境和免疫成分的影響[14]。

經(jīng)過不斷的研究與驗證，Galon和他的團(tuán)隊探索出較完善的免疫評分操作方法：收集結(jié)腸癌患者的腫瘤組織標(biāo)本，制作成石蠟包埋福爾馬林固定組織切片后，對切片進(jìn)行CD3+、CD8+免疫組織化學(xué)染色，再通過專用的分析軟件（Immunoscore? Analyzer）對腫瘤中心和腫瘤浸潤邊緣的CD3+和CD8+細(xì)胞密度進(jìn)行檢測和量化，該軟件可計算出每個區(qū)域中每個標(biāo)志物的密度水平，然后轉(zhuǎn)換為在大型國際回顧性驗證研究中定義的密度百分位數(shù)[15]。根據(jù)平均密度百分位數(shù)分類，免疫評分可分為三類，IS=0～1：低CD3+和CD8+淋巴細(xì)胞浸潤（0～25%）；IS=2：中度CD3+和CD8+淋巴細(xì)胞浸潤（25%～75%）；IS=3～4：高CD3+和CD8+淋巴細(xì)胞浸潤（75%～100%）[16]。這一創(chuàng)新、便捷、可操作性強(qiáng)的評估方法引起了許多學(xué)者的興趣。隨后，越來越多的研究探討了在不同瘤種中，選擇不同的目標(biāo)淋巴細(xì)胞組合（如CD45RO T和CD8T；CD3、CD8和CD20）對腫瘤患者進(jìn)行免疫評分，以進(jìn)一步驗證免疫評分在不同腫瘤預(yù)后及療效評估中的適用性。

目前，腫瘤免疫細(xì)胞浸潤在腫瘤的預(yù)后及療效中扮演著重要的角色，而免疫評分可對CT和IM的免疫浸潤細(xì)胞進(jìn)行直接量化分析。因此，不難推測，作為首個用于癌癥分類的標(biāo)準(zhǔn)化免疫檢測方法，免疫評分對腫瘤患者預(yù)后的評估與免疫治療療效的預(yù)測有著重要意義。

值得注意的是，由于不同腫瘤間免疫結(jié)構(gòu)的差異，不同免疫細(xì)胞在腫瘤中心及侵襲邊緣的浸潤密度對腫瘤預(yù)后及療效的預(yù)測意義存在差異，應(yīng)選擇最有意義的免疫細(xì)胞進(jìn)行免疫評分，因此，不同腫瘤的免疫評分方法不盡相同。

2 免疫評分對腫瘤預(yù)后的預(yù)測作用

腫瘤免疫結(jié)構(gòu)、免疫微環(huán)境等特征對腫瘤患者的預(yù)后有著重要的意義，且原位免疫細(xì)胞在腫瘤中的浸潤與良好的預(yù)后相關(guān)[7]，而免疫評分系統(tǒng)可對腫瘤中心及浸潤邊緣的特異性免疫細(xì)胞直接進(jìn)行定量分析，從而在對患者預(yù)后的評估中發(fā)揮作用。

有研究表明，在結(jié)腸癌中，免疫評分是預(yù)測結(jié)腸癌患者復(fù)發(fā)風(fēng)險的可靠、有效的臨床方法，且其對預(yù)后的評估優(yōu)于包括TNM、MSI在內(nèi)的其他預(yù)后因素[15]。在癌癥免疫治療協(xié)會（society for immunotherapy of cancer,SITC）的支持下，來自13個國家的14個中心共同組成了一個國際聯(lián)盟，在臨床試驗中驗證免疫評分對Ⅰ～Ⅲ期結(jié)腸癌患者預(yù)后的預(yù)測作用[15]。這一國際性的合作試驗收集了3 539例患者的腫瘤組織樣本，通過質(zhì)控分析后納入2 681例患者的樣本（實驗組700例、內(nèi)部驗證組636例和外部驗證組1 345例）。實驗組中，免疫評分高的患者5年復(fù)發(fā)風(fēng)險最低，且在預(yù)后能力評估方面，免疫評分顯著優(yōu)于TNM評估的無病生存期（DFS）和總生存期（OS）。與鏡下人工測量經(jīng)HE染色的腫瘤組織T淋巴細(xì)胞密度相比，免疫評分定量結(jié)果在多中心不同病理學(xué)家的定量分析結(jié)果中有著更高的一致性和重復(fù)性。該研究通過Cox多變量分層分析發(fā)現(xiàn)，免疫評分與腫瘤復(fù)發(fā)時間相關(guān)，且獨立于患者年齡、性別、T分期、N分期、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和現(xiàn)有預(yù)后因素等其他因素。在包括TNM分期在內(nèi)的所有臨床參數(shù)對結(jié)腸癌風(fēng)險預(yù)測分析的研究中，免疫評分對結(jié)腸癌患者預(yù)測風(fēng)險的相對貢獻(xiàn)率最高。上述研究顯示了免疫評分在評估結(jié)腸癌患者預(yù)后方面的優(yōu)越性、可行性和可重復(fù)性。

隨著免疫評分在結(jié)腸癌研究中的開展，證實了其在評估患者預(yù)后方面有著優(yōu)于經(jīng)典TNM分期的預(yù)測價值，目前越來越多的國內(nèi)外研究進(jìn)一步對免疫評分在其他實體腫瘤中的預(yù)測作用進(jìn)行了探索與驗證。

在肝細(xì)胞肝癌中，有研究[17]評估了免疫評分的預(yù)后作用：研究中對接受根治性切除的90例肝癌患者和未經(jīng)治療的359例肝癌患者的兩個獨立隊列的腫瘤標(biāo)本進(jìn)行免疫評分。通過對患者腫瘤標(biāo)本腫瘤中心和腫瘤浸潤邊緣中的CD8+T、CD3+T細(xì)胞密度進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)較高IS與較長的DFS和OS顯著相關(guān)，而較低的IS與較差的預(yù)后顯著相關(guān)。此外，該研究還提出了一個與較好預(yù)后相關(guān)的最佳臨界值：與CD8+T細(xì)胞密度＜93/mm2的患者相比，＞93/mm2的患者的生存期顯著延長。此后，另一研究[18]對65例經(jīng)手術(shù)切除治療的Ⅰ～Ⅳ期肝癌患者的腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行免疫評分，發(fā)現(xiàn)經(jīng)免疫評分分組后，各組肝癌患者的復(fù)發(fā)率分別為：IS 0分組65%，IS 1分組22%，IS 2分組10%，IS 3分組10%，IS 4分組11%。這表明免疫評分高的患者肝癌復(fù)發(fā)率顯著降低。此外，該研究調(diào)整了血管侵襲和細(xì)胞分化等變量后進(jìn)行多變量Logistic回歸模型分析發(fā)現(xiàn)，在調(diào)整其他協(xié)變量后，CD3+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞密度仍然是預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)的重要危險因素。因此，免疫評分可以獨立于其他風(fēng)險因素（如血管侵襲和細(xì)胞分化）來預(yù)測經(jīng)手術(shù)切除治療的肝癌患者復(fù)發(fā)風(fēng)險。

在胰腺癌中，有研究[19]對108例胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC）手術(shù)患者進(jìn)行免疫評分，發(fā)現(xiàn)高IS和低組織學(xué)分級與較好的疾病特異性生存期（disease-specific survival,DSS）和總生存期（OS）顯著相關(guān)。低、中、高IS組的5年DSS率分別為5.0%、15.2%和33.4%（P=0.007），5年OS率分別為4.2%、13.4%和31.5%（P=0.004）。同時，該研究通過多因素分析發(fā)現(xiàn)，高IS是改善5年DSS和OS的獨立預(yù)后因素，且IS對預(yù)后的評估優(yōu)于TNM分期。因此，對PDAC患者初次手術(shù)治療后，免疫評分可能是一個有效的預(yù)后標(biāo)志物。

在胃癌中，國內(nèi)有團(tuán)隊對診斷為胃癌的患者生存預(yù)測進(jìn)行回顧性研究[20]：對251例胃癌樣本中的27種免疫細(xì)胞進(jìn)行了篩選，使用Lasso-Cox模型，最終確定了5個特異性免疫細(xì)胞CD3IM、CD3CT、CD8IM、CD45ROCT（記憶T細(xì)胞）和CD-66bIM，并將其合并到免疫評分系統(tǒng)中，通過推導(dǎo)出的公式對胃癌患者進(jìn)行免疫評分。發(fā)現(xiàn)免疫評分高和免疫評分低患者的5年無病生存率（45.0%vs.4.4%,P＜0.001）和5年總生存率（48.8%vs.6.7%,P＜0.001）差異有統(tǒng)計學(xué)意義。此外免疫評分預(yù)測了具有相同TNM分期的患者的生存期，表明IS可能具有補(bǔ)充TNM分期的預(yù)后價值。

這些研究表明免疫評分系統(tǒng)在不同瘤種中具有重要的預(yù)后預(yù)測價值。同時，免疫評分具有作為一種良好生物標(biāo)志物所需的穩(wěn)定性、便捷性、簡便性、可行性和可重復(fù)性特征。因此，在未來可能作為生物標(biāo)志物而被廣泛應(yīng)用于臨床。

3 免疫評分對多種腫瘤療效的預(yù)測作用

顯然，免疫評分作為預(yù)后標(biāo)志物對評估多種實體瘤患者的生存是非常有意義的，然而，它是否能為腫瘤患者的治療提供有價值的預(yù)測也是近年來許多學(xué)者關(guān)注與研究的方向。目前，惡性腫瘤的治療方法包括手術(shù)、化療、放療、靶向和免疫治療等。而隨著腫瘤免疫逃逸機(jī)制的提出與研究的深入，免疫治療已經(jīng)廣泛應(yīng)用于腫瘤的臨床治療。目前認(rèn)為，治療前腫瘤微環(huán)境中淋巴細(xì)胞的浸潤對免疫治療的療效有著積極的影響，而免疫評分作為對腫瘤中心及浸潤邊緣淋巴細(xì)胞進(jìn)行定量分析的一種新方法，可能與免疫治療的療效相關(guān)。

有研究報道[21]，在接受抗PD-1治療的Ⅲ期黑色素瘤患者中，最能預(yù)測臨床療效的標(biāo)志物不是PD-1或PD-L1，而是腫瘤中心和腫瘤浸潤邊緣中CD8+T細(xì)胞的密度：產(chǎn)生免疫應(yīng)答者的CD8+T細(xì)胞密度在治療期間增加，而無應(yīng)答者的CD8+T細(xì)胞密度仍然很低。因此推測，腫瘤中心和腫瘤浸潤交界部位存在天然的CD8+細(xì)胞似乎是用抗PD-1誘導(dǎo)或激活抗腫瘤免疫反應(yīng)的必要條件。一項研究[22]通過Logistic回歸模型選擇8個免疫標(biāo)志物建立免疫評分模型來預(yù)測黑色素瘤患者抗PD1治療的療效，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：免疫評分高的患者客觀緩解率顯著高于免疫評分低的患者，且免疫評分高的患者有更長的生存期；免疫評分高的患者腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞（TIL）比例更高，對干擾素-γ有更強(qiáng)的應(yīng)答；此外，基因富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）結(jié)果表明，免疫評分高的患者富含抗腫瘤免疫相關(guān)信號通路。因此，該研究構(gòu)建了一個穩(wěn)健、有效的免疫評分模型，可預(yù)測轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的抗PD1治療反應(yīng)。

一項Ⅱ期生物標(biāo)志物研究[23]探索了82例接受Ipilimumab（IPI）治療的黑色素瘤患者的療效與生物標(biāo)志物的相關(guān)性。該研究發(fā)現(xiàn)Ipilimumab的臨床活性與TIL的升高呈正相關(guān)，提示浸潤的淋巴細(xì)胞可能具有抗腫瘤活性，腫瘤免疫微環(huán)境的改變可能延緩了疾病的進(jìn)展。此外，有學(xué)者提出TIL在IM或CT的定位可能會影響IPI治療的臨床反應(yīng)，進(jìn)而對CTLA-4+TIL的潛在相關(guān)性及其定位與IPI的療效展開研究[24]：來自17例接受IPI治療的40個黑色素瘤病變組織進(jìn)行IHC染色后，由3位病理學(xué)家進(jìn)行獨立評估，對組織切片腫瘤浸潤邊緣和腫瘤中心的TIL進(jìn)行評分，發(fā)現(xiàn)在IPI治療后，大多數(shù)TIL亞群在原位增加，尤其是FoxP3+細(xì)胞，且腫瘤浸潤邊緣高于腫瘤中心，還發(fā)現(xiàn)高TIL評分和CD3+、CD8+細(xì)胞密度與免疫應(yīng)答顯著相關(guān)。因此該研究發(fā)現(xiàn)CTLA-4+TIL可能是單獨或與CD3+/CD8+細(xì)胞一起代表IPI反應(yīng)的標(biāo)志物，但這一結(jié)論仍需要在更大規(guī)模的研究中得到證實。此外，在黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)，CD45ROT、CD8+T細(xì)胞的基線水平可作為預(yù)測Ipilimumab抗PD-1治療療效的生物標(biāo)志物。

免疫評分不僅在腫瘤免疫治療療效中表現(xiàn)出強(qiáng)大的預(yù)測潛力，在輔助化療中，也展示了與腫瘤患者治療療效的相關(guān)性，提示免疫評分可協(xié)助制定治療方案從而使患者能得到更好的治療。在2020 ESMO指南中，免疫評分已被明確推薦用于早期結(jié)腸癌的預(yù)后及指導(dǎo)輔助化療。一項研究對492例Ⅲ期結(jié)腸癌患者中的481例分別采用mFOLFOX6方案輔助化療3月和6月的患者進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與接受輔助化療3月相比，接受輔助化療6月的中-高IS患者在DFS方面觀察到了有益的效果，而低IS患者并沒有從6月的輔助化療方案中顯著獲益[25]，這表明IS可能預(yù)測結(jié)腸癌患者輔助化療療效。在一項Ⅲ期胃癌輔助化療的療效研究[20]中也發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果：在251例胃癌樣本中，使用Lasso-Cox模型對27種免疫細(xì)胞進(jìn)行了篩選，基于最終確定的5個特異性免疫細(xì)胞（CD3IM、CD3CT、CD8IM、CD45ROCT和CD66bIM）對胃癌患者進(jìn)行免疫評分。對于IS高的胃癌患者，輔助化療顯著增加DFS和OS，但對IS低的患者無明顯影響；且在高IS的Ⅲ期胃癌患者中，兩年復(fù)發(fā)率明顯低于低IS患者，這表明IS可幫助區(qū)分更適合輔助化療的Ⅱ、Ⅲ期胃癌患者。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，高IS的Ⅱ期和Ⅲ期胃癌患者對輔助化療有良好的反應(yīng)。通過構(gòu)建nomograms，成功預(yù)測了將從術(shù)后輔助化療中獲益的是Ⅱ期和Ⅲ期胃癌患者。該研究表明免疫評分是一種有用的預(yù)測工具。

隨著對免疫評分與腫瘤患者療效相關(guān)性研究的深入開展，免疫評分已漸漸展現(xiàn)其對腫瘤治療反應(yīng)的預(yù)測能力，目前仍需在更深入、更大規(guī)模的研究中探究免疫評分的預(yù)測能力，以確定其應(yīng)用于臨床的價值。

4 免疫評分技術(shù)進(jìn)展

免疫評分系統(tǒng)對腫瘤患者的預(yù)后有著強(qiáng)大的評估能力，經(jīng)典的免疫評分系統(tǒng)和根據(jù)不同腫瘤特性而選擇不同目標(biāo)淋巴細(xì)胞的免疫評分模型均對腫瘤的療效展示出很好的預(yù)測能力，由此可期待，免疫評分可在未來的臨床應(yīng)用中更好地識別能從治療中受益的患者，從而協(xié)助臨床醫(yī)生更好地制定治療方案。為確保免疫評分的穩(wěn)定性，目前已開展經(jīng)體外免疫評分試驗（CE-IVD）批準(zhǔn)的應(yīng)用于臨床的體外免疫評分試驗。對免疫評分方法的不斷完善，大大增加了免疫評分應(yīng)用于臨床的可能性。

經(jīng)典的免疫評分大多通過對腫瘤組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色以進(jìn)行數(shù)字病理定量分析，該方法對免疫組織化學(xué)染色操作及病理分析要求嚴(yán)格，為了確保該檢測方法的穩(wěn)健性，HalioDx開發(fā)的免疫評分專用分析軟件Immunoscore?Analyzer已用于經(jīng)批準(zhǔn)臨床使用的CE-IVD。而隨著檢測技術(shù)的不斷進(jìn)步以及免疫評分系統(tǒng)的逐漸完善，目前提出了更加便捷的可用于臨床的活檢免疫評分，且活檢免疫評分也在患者預(yù)后中表現(xiàn)出強(qiáng)大的預(yù)測能力。同時，越來越多的研究采用生信分析工具以選擇更有意義的目標(biāo)免疫細(xì)胞進(jìn)行免疫評分，而不僅局限于經(jīng)典的CD3+、CD8+細(xì)胞，這使免疫評分可在不同瘤種中發(fā)揮更優(yōu)的作用。

但免疫評分也存在一些亟待解決的問題：首先，免疫評分是一項運用數(shù)字病理方法對特定CD3、CD8細(xì)胞進(jìn)行定量檢測的方法，盡管這種方法已顯示出強(qiáng)大的功能，但仍尚未被病理學(xué)界完全接受；其次，在臨床中活檢組織很難取到腫瘤侵襲邊緣的標(biāo)本，因此對免疫評分中的IM定量較難實現(xiàn)。針對這一問題，目前已開發(fā)了用于臨床活檢的免疫評分方法，盡管不及免疫評分（含IM）的預(yù)測能力強(qiáng)大，該方法也能顯著預(yù)測患者的預(yù)后[26]；再者，免疫評分還需對不同腫瘤進(jìn)行更加規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化的定量，以提高其臨床適用性；最后，關(guān)于免疫評分對不同腫瘤單一或聯(lián)合治療方法的療效預(yù)測作用，還需進(jìn)行更多可靠的且具代表性的前瞻性試驗來進(jìn)一步論證。

5 結(jié)語與展望

作為首個基于免疫因素對腫瘤進(jìn)行分類的檢測方法，免疫評分可對經(jīng)典的TNM分期進(jìn)行優(yōu)化，從而形成TNM-I分期，以對腫瘤患者進(jìn)行更全面、精準(zhǔn)地評估。目前，免疫評分已在多種腫瘤的預(yù)后及療效研究中展現(xiàn)出其強(qiáng)大的預(yù)測能力，增加了免疫評分作為生物標(biāo)志物進(jìn)入臨床的可能性。在未來，若免疫評分應(yīng)用于臨床，不僅可以預(yù)測患者的生存期，還能評估免疫治療及輔助治療的效果，從而指導(dǎo)臨床治療方案的制定，實現(xiàn)個體化的治療，延長患者的生存期。