三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用研究*

王蘭林 綜述，戚仁莉，余化霖 審校

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院微創(chuàng)神經(jīng)外科，云南 昆明 650000)

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見(jiàn)惡性腫瘤。在成人致死性腦腫瘤中，高級(jí)別膠質(zhì)瘤最多，其生長(zhǎng)迅速、細(xì)胞豐富、有明顯的色差和多形性，即使確診后積極治療，包括手術(shù)最大限度切除病灶、術(shù)后放化療等綜合治療措施，療效仍不盡人意。膠質(zhì)瘤患者平均生存時(shí)間僅為12～14個(gè)月，長(zhǎng)期存活比例很低(<5%)[1]，其原因是膠質(zhì)瘤細(xì)胞呈侵襲性生長(zhǎng)及生物學(xué)特征異質(zhì)性導(dǎo)致。科學(xué)家們?yōu)榇诉M(jìn)行了大量基礎(chǔ)與臨床研究，而細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是基礎(chǔ)研究的基礎(chǔ)。

二維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)成熟，具有經(jīng)濟(jì)、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，一直以來(lái)是腫瘤生物學(xué)研究體外實(shí)驗(yàn)的重要方法，但也存在不能反映腫瘤體內(nèi)真實(shí)生長(zhǎng)情況等不足。自20世紀(jì)中期有人提出三維細(xì)胞培養(yǎng)(3DCC)這一概念以來(lái)，經(jīng)過(guò)數(shù)十年發(fā)展，三維體外模型彌補(bǔ)了二維細(xì)胞培養(yǎng)與整個(gè)動(dòng)物系統(tǒng)之間的空白。通過(guò)模仿體內(nèi)環(huán)境特征，三維模型為干細(xì)胞的行為、發(fā)育中的組織和器官及腫瘤的行為提供了獨(dú)特視角，有助于加速癌癥生物學(xué)和組織工程學(xué)的轉(zhuǎn)化研究。

1 3DCC概念

3DCC是指將具有三維結(jié)構(gòu)的不同材料載體與各種不同種類的細(xì)胞在體外共同培養(yǎng),使細(xì)胞與周?chē)h(huán)境中的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)、各種細(xì)胞因子、化學(xué)因子、物理因子及其他細(xì)胞發(fā)生交流與相互作用，進(jìn)而在三維立體空間結(jié)構(gòu)中遷移、生長(zhǎng),構(gòu)成三維的細(xì)胞-載體復(fù)合物[2]。相比于二維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，3DCC既可模擬細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)的微環(huán)境，還同時(shí)具有體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的直觀性和條件可控性等優(yōu)勢(shì)。3DCC因體外模型與腫瘤體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境具有相似的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)特性，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)研究。

三維培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、增殖速度、細(xì)胞周期等方面與二維培養(yǎng)細(xì)胞有明顯差異,并且具有類似體內(nèi)高級(jí)別膠質(zhì)瘤的免疫組化特點(diǎn),三維膠原復(fù)合支架能更好地模擬體內(nèi)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境,可作為膠質(zhì)瘤體外模型，并用于多種研究[3]。與現(xiàn)有的源自患者的細(xì)胞培養(yǎng)方法相比，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)的三維培養(yǎng)支架提供了更好的生理表現(xiàn)和異種移植模型[4]。

2 3DCC在膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用

2.1抗腫瘤藥物耐藥性或新的抗腫瘤藥物篩選方面 傳統(tǒng)的體外研究方法是將細(xì)胞培養(yǎng)為單層細(xì)胞或神經(jīng)球細(xì)胞(富含癌癥干細(xì)胞的細(xì)胞簇)，但這兩種方法都不能準(zhǔn)確反映GBM三維化學(xué)耐受微環(huán)境的復(fù)雜性。三維微腫瘤是一種多功能的高通量模型系統(tǒng)，比傳統(tǒng)方法更能在體內(nèi)復(fù)制腫瘤生物學(xué)[5]。使用三維細(xì)胞模型評(píng)價(jià)藥物的耐藥性有利于得到更加準(zhǔn)確的結(jié)果，從而為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供更可靠的參考[6]。MUSAH-EROJE等[7]研究發(fā)現(xiàn)，與二維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相比，三維培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的耐藥性更強(qiáng)，而缺氧則增強(qiáng)了這種耐藥。研究結(jié)果表明，微環(huán)境因素影響GBM對(duì)替莫唑胺的敏感性。因此，了解三維模型中涉及替莫唑胺耐藥的機(jī)制可能有助于確定新的策略，從而更有效地使用現(xiàn)有的藥物標(biāo)準(zhǔn)。有學(xué)者提出了一種新穎的三維水凝膠平臺(tái)VersaGel，其可以使患者或患者衍生的異種移植物模型在離體組織中生長(zhǎng)，并在臨床相關(guān)的時(shí)間范圍內(nèi)評(píng)估對(duì)批準(zhǔn)的療法(如替莫唑胺)的敏感性，這在轉(zhuǎn)化研究和個(gè)性化醫(yī)學(xué)中將非常有用[8]。

KAPHLE等[9]研究指出，在二維或三維培養(yǎng)環(huán)境中，藥理分子對(duì)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的作用不同。也有學(xué)者建立了用于三維膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)的膠原支架，在這些三維支架上培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞比二維培養(yǎng)細(xì)胞表現(xiàn)出更大程度的去分化和靜止。三維培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)化療藥物烷基化劑的耐受性也增強(qiáng)了，使膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的比例大大增加，并且上調(diào)O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶。而且，三維培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞顯示出與膠質(zhì)瘤患者相似的化療耐藥模式。這表明三維膠原支架在體外篩選新的抗膠質(zhì)瘤藥物的研究平臺(tái)是有希望的[10]。MA等[11]建立了三維體外腫瘤模型，并證明其是了解GBM內(nèi)在本質(zhì)的有力工具，可以被視為潛在的藥物篩選平臺(tái)。KESSEL等[12]開(kāi)發(fā)了實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)半胱氨酸蛋白酶3/7凋亡和碘化丙啶三維多細(xì)胞腫瘤球活性測(cè)定，這兩種方法均可用于二級(jí)篩選，以更好地了解從一級(jí)篩選中識(shí)別出的這些潛在候選藥物的作用機(jī)制，從而可以鑒定出更合格的候選藥物并簡(jiǎn)化藥物的發(fā)現(xiàn)過(guò)程、研究與開(kāi)發(fā)。BERNARDO等[13]利用3DCC篩選出LQB-118。該藥物是用于GBM單藥治療并與放療或順鉑相關(guān)的有希望的藥物，其作用與抑制GBM相關(guān)的生存信號(hào)通路有關(guān)。

2.2腫瘤血管生成方面 近年來(lái)，抗血管生成療法一直是神經(jīng)腫瘤學(xué)的主要研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)。血管生成在腫瘤生長(zhǎng)和存活中起重要作用，為抗癌治療提供了靶標(biāo)。GBM是最具侵襲性和血管化的腫瘤之一，貝伐單抗被認(rèn)為是使GBM患者受益最多的抗血管生成藥物。到目前為止，沒(méi)有一種藥物能超過(guò)貝伐單抗的治療益處。此外，抗血管生成藥物的抗?jié)B透作用可以顯著減少腫瘤相關(guān)的水腫，從而能夠穩(wěn)定或改善患者神經(jīng)功能和生活質(zhì)量。特別是，抗血管生成劑可顯著延長(zhǎng)患者無(wú)進(jìn)展生存期[14]。KO等[15]介紹了一種注塑成型的塑料陣列三維球體培養(yǎng)平臺(tái)，其可用于研究腫瘤球體誘導(dǎo)的血管生成模型，有潛力提供與血管化癌癥研究相關(guān)的強(qiáng)大且可重復(fù)的體外測(cè)定。這個(gè)易于使用、隨時(shí)可用的平臺(tái)可以轉(zhuǎn)化為增強(qiáng)的臨床前模型，可以忠實(shí)地反映復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境。

有學(xué)者利用3DCC模擬體內(nèi)血管生成的三維空間，真實(shí)有效地評(píng)估各因素對(duì)血管生成的影響。該研究以膠質(zhì)瘤球體和纖維蛋白凝膠中的人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞作為腫瘤模型，觀察阿托伐他汀對(duì)GBM細(xì)胞的抗血管生成和凋亡活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這種具有纖維蛋白的仿生模型可以提供廣泛適用的三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，以研究阿托伐他汀等抗癌藥對(duì)體內(nèi)和體外腫瘤惡性的影響，并且阿托伐他汀可以用作GBM的治療藥物[16]。

2.3膠質(zhì)瘤細(xì)胞基因表達(dá)和生物學(xué)功能方面 目前，3DCC已越來(lái)越多地用于研究腫瘤細(xì)胞生物學(xué)，以改進(jìn)對(duì)自然發(fā)育環(huán)境的模擬。STOCZYNSKA-FIDELUS等[17]結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)、酶細(xì)胞化學(xué)、5-溴脫氧尿嘧啶核苷摻入法和實(shí)時(shí)顯微鏡觀察異檸檬酸脫氫酶1(IDH1) R132H突變的8種膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)物中的衰老特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3DCC可延長(zhǎng)腫瘤IDH1 R132H陽(yáng)性細(xì)胞的存活，但是并不能提高穩(wěn)定效率。提示膠質(zhì)瘤細(xì)胞的衰老是在體外自動(dòng)觸發(fā)的，為基于這種現(xiàn)象的潛在新治療策略提供了機(jī)會(huì)。

有研究使用具有不同大小空隙的三維膠原蛋白支架與傳統(tǒng)二維細(xì)胞培養(yǎng),用于基因表達(dá)譜的比較和相關(guān)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生理功能研究，包括U87 U251 HS683細(xì)胞系。該研究結(jié)果顯示，三維膠原支架培養(yǎng)可上調(diào)與干性、細(xì)胞周期、凋亡、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移、侵襲和膠質(zhì)瘤惡性相關(guān)基因的表達(dá)，并誘導(dǎo)相應(yīng)的功能改變；膠原支架的孔徑大小似乎不影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的基因表達(dá)或功能。提示三維膠原支架增強(qiáng)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性程度，可作為膠質(zhì)瘤研究的體外研究平臺(tái)[18]。

與二維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相比，三維培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞顯示出對(duì)細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的抵抗力增強(qiáng)。然而，三維培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞是否具有增強(qiáng)的對(duì)NK細(xì)胞毒性的抗性，目前尚不清楚。有研究者通過(guò)比較蛋白質(zhì)組學(xué)在二維培養(yǎng)和三維培養(yǎng)的U251細(xì)胞之間的363個(gè)差異表達(dá)蛋白，并通過(guò)生物學(xué)信息構(gòu)建了基于這些差異蛋白的免疫相關(guān)蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，三維培養(yǎng)細(xì)胞中人類白細(xì)胞抗原-E的上調(diào)可能導(dǎo)致腫瘤對(duì)NK細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的抵抗力增強(qiáng)[19]。

GBM的侵襲和遷移、滲透到非腫瘤腦實(shí)質(zhì)是導(dǎo)致目前治療困難的關(guān)鍵生物學(xué)行為。而HUANG等[20]應(yīng)用三維水凝膠模型研究發(fā)現(xiàn)，Rac1和RhoA信號(hào)的聯(lián)合抑制將是抑制GBM入侵的有前途的策略，為GBM的侵襲和遷移研究提供了方向。DIAO等[21]的研究在微型三維模型中培養(yǎng)了4種類型的典型GBM細(xì)胞系(LN229、SNB19、U87、U251),結(jié)果顯示，GBM細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)、增殖、遷移和侵襲方面顯示出特定的特性，其中一些很少見(jiàn)。此外，該研究詳細(xì)觀察了細(xì)胞如何侵入周?chē)腅CM及相應(yīng)的特定侵襲模式。提示這4種類型的細(xì)胞在其癌癥發(fā)展過(guò)程中具有不同特征。如果將這種復(fù)雜的體外模型應(yīng)用于患者衍生的細(xì)胞，則具有成為臨床相關(guān)預(yù)測(cè)模型的潛力。

2.4腫瘤細(xì)胞對(duì)輻射敏感性方面 放射治療已成為高級(jí)別膠質(zhì)瘤術(shù)后常規(guī)治療手段，其利用高能射線(X線、重粒子等)破壞腫瘤細(xì)胞DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，殺傷、殺死腫瘤細(xì)胞[22]。放射治療是否有效取決于膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)射線的敏感性，CARAGHER等[23]總結(jié)和分析了3DCC系統(tǒng)的發(fā)展，并特別關(guān)注了其如何加強(qiáng)化合物的設(shè)計(jì)和識(shí)別，從而提高放療的療效。JIGUET-JIGLAIRE等[24]對(duì)U87-MG GBM細(xì)胞和人GBM的7種原代細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行放療和化療，結(jié)果顯示，三維水凝膠保留了原始的癌癥生長(zhǎng)行為，并能夠評(píng)估惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤對(duì)放射線和藥物的敏感性，以反映治療反應(yīng)的腫瘤間異質(zhì)性。因此，該方法可以用于新療法的臨床前評(píng)估。

CHIBLAK等[25]研究了不同CD133狀態(tài)的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在光子、質(zhì)子和碳照射后的三維模型中的輻射敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，碳輻照在消除膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中是有效的，其相對(duì)生物學(xué)效應(yīng)范圍大約為2～3。該研究數(shù)據(jù)強(qiáng)烈建議使用經(jīng)典的放射生物學(xué)端點(diǎn)進(jìn)一步探索膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。GOMEZ-ROMAN[26]等建立的GBM三維模型能夠可靠地預(yù)測(cè)臨床療效，在GBM藥物放射聯(lián)合治療的臨床前評(píng)估中的具有潛在價(jià)值。隨后從3DCC模型中獲得的數(shù)據(jù)確定了GBM中DNA修復(fù)和放射敏感性的新決定因素和機(jī)制，以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子/蛋白激酶B(Akt)信號(hào)傳導(dǎo)通過(guò)調(diào)節(jié)非同源末端連接與同源重組介導(dǎo)的DNA修復(fù)之間的平衡來(lái)影響放射敏感性的新作用，并確認(rèn)Akt是有希望的治療靶標(biāo)[27]。

2.5膠質(zhì)瘤干細(xì)胞方面 目前缺乏支持臨床侵襲性的GBM干細(xì)胞生長(zhǎng)的體外模型，阻礙了針對(duì)GBM的新型有效療法的開(kāi)發(fā)。雖然原位癌患者來(lái)源的GBM異種移植模型可以最好地反映體內(nèi)腫瘤行為，但建立異種移植耗時(shí)、昂貴且成功率較低。為了解決這些限制，合成了由多殼聚糖和透明質(zhì)酸組成的三維多孔支架，并直接從生長(zhǎng)在支架上或附著單層細(xì)胞的新鮮異種植物中獲取GBM干細(xì)胞，對(duì)其細(xì)胞表型生長(zhǎng)、表達(dá)進(jìn)行比較。雖然二維貼壁培養(yǎng)物為扁平上皮細(xì)胞的單層生長(zhǎng)，但GBM細(xì)胞以自黏卵形細(xì)胞簇的形式在透明質(zhì)酸支架孔內(nèi)增殖。支架上的生長(zhǎng)伴隨著基因的更高表達(dá)，這些基因介導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化并維持原始的、未分化的表型，這是腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志。支架生長(zhǎng)的細(xì)胞還顯示出更高的基因表達(dá)，這些基因促進(jìn)了對(duì)低氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的抗性。與貼壁細(xì)胞相比，支架生長(zhǎng)的細(xì)胞對(duì)臨床利用的烷基化劑表現(xiàn)出明顯的抗性。提示三維透明質(zhì)酸支架能更好地模仿體內(nèi)生物學(xué)和臨床行為，并為開(kāi)發(fā)新型的個(gè)性化治療提供了依據(jù)[28]。WANG等[29]將神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系與三維透明質(zhì)酸支架一起培養(yǎng)，以探索神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞富集的可能性，結(jié)果顯示，三維透明質(zhì)酸支架具有更好的富集膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的能力，可以作為一種簡(jiǎn)單有效的體外培養(yǎng)和富集腫瘤干細(xì)胞的方法，以支持腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)研究和新型抗癌療法的發(fā)展。

3 小 結(jié)

3DCC作為一項(xiàng)新技術(shù)，近年來(lái)在腫瘤研究領(lǐng)域成為熱門(mén)話題，但其仍存在很多不足，有待進(jìn)一步改善和發(fā)展。一方面，3DCC費(fèi)用高、對(duì)操作技術(shù)要求高、操作過(guò)程較復(fù)雜、用時(shí)長(zhǎng)；另一方面，培養(yǎng)環(huán)境與人體真實(shí)狀態(tài)存在差異，尚不能完全模擬體內(nèi)環(huán)境，而且由于模型中心缺乏營(yíng)養(yǎng)或供氧，細(xì)胞無(wú)法無(wú)限生長(zhǎng)。隨著3DCC技術(shù)與材料學(xué)、生命科學(xué)等技術(shù)的交叉融合和不斷發(fā)展，這些不足都會(huì)逐步解決，其在腫瘤領(lǐng)域的研究具有廣闊的前景和價(jià)值。相信隨著3DCC的發(fā)展，新的時(shí)期、新的領(lǐng)域?qū)?huì)產(chǎn)生新的研究成果，使膠質(zhì)瘤的治療邁上新的臺(tái)階，最終造福廣大患者。