圍生期缺血缺氧性腦損傷動物模型的研究

尉鳳華 (延邊大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林 延吉 133000)

圍生期缺血缺氧性腦損傷(neonatal hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是指圍生期中的胎兒或新生兒由于各種原因引起的腦組織血液供給的減少或暫停而引起的一種疾病。如果不經(jīng)積極治療，患兒的死亡率高，存活者常遺留下或輕或重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥,給家庭和社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。圍生期大部分損傷是從子宮內(nèi)就已經(jīng)開始的，所以復(fù)制與人類宮內(nèi)缺血缺氧性腦損傷環(huán)境相類似的動物模型是上述研究的一個重要條件。近些年圍生期缺血缺氧性腦損傷研究進(jìn)展得益于各種動物模型的廣泛應(yīng)用，現(xiàn)已成功地在諸多動物，如羊、豬、兔、大鼠、小鼠等復(fù)制出圍生期缺血缺氧性腦損傷模型，每種模型都有各自的優(yōu)缺點,選擇最適當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ陀兄诟玫剡M(jìn)行實驗性研究。在缺氧缺血性腦損傷的研究中,建立合適的缺氧缺血性腦損傷動物模型十分重要。現(xiàn)將目前國內(nèi)外學(xué)者建立的HIBD動物模型的各種方法總結(jié)如下。

1 鼠HIBD模型的建立

鼠是目前研究圍生期應(yīng)用缺血缺氧性腦損傷最多的實驗動物，最常用的制模方法是Rice等[1]在1981年首先提出的大鼠動物模型，結(jié)扎一側(cè)新生7 d鼠的頸總動脈，在含氧8%的環(huán)境中將缺氧與缺血相結(jié)合的造模方法。國內(nèi)眾多學(xué)者采也用此方法建立模型。單該模型的最大不足是無法較好的模擬宮內(nèi)復(fù)雜的宮內(nèi)環(huán)境，不能理想地再現(xiàn)由于胎盤宮內(nèi)不全或臍帶伊蘇或母體原因造成的胎兒缺血缺氧是的臨床病理生理多樣性與復(fù)雜性。

吳靜等取大鼠頸部正中切口，分離一側(cè)頸總動脈并進(jìn)行阻斷，在恢復(fù)血供60～90 min后放入氧濃度為8%的缺氧環(huán)境2 h制作新生大鼠缺血缺氧性模型，用于研究高壓氧對新生大鼠腦HIBD后轉(zhuǎn)化生長因子β表達(dá)的影響[2]。該方法能較好地模擬窘迫后腦損傷后的病理表現(xiàn)，同時該模型具有易復(fù)制、成功率高、價格低、容易批量研究等優(yōu)點。但其最大的不足在于無法較好地模擬宮內(nèi)復(fù)雜的環(huán)境。

2 羊、豬、兔HIBD模型的建立

1981年由Clapp等最早提出運用宮內(nèi)手術(shù)制成胎羊模型，此后有了不斷地發(fā)展并完善[3]。近年來有一些學(xué)者將胎羊模型進(jìn)一步發(fā)展，造成實驗動物子宮動脈[4]或臍帶[5]血液供應(yīng)的梗阻，這無疑使宮內(nèi)缺血缺氧性能腦損傷的研究更進(jìn)一步。盡管上述動物模型應(yīng)用比較多，但也存在一定的缺陷。如羊作為實驗動物體型較大，其妊娠周期較長，每胎平均約為150 d，且繁殖能力較低，實驗經(jīng)費較高，加之該方法操作步驟復(fù)雜，實驗難度較高，能確證直言動物腦損傷的可靠證據(jù)仍較少，不適宜大批量的實驗性的研究。Mallard 等[6]在幾內(nèi)亞豬懷孕30 d時阻斷單側(cè)子宮動脈，建立缺血缺氧性腦損傷模型。薄濤等應(yīng)用改良Levine法[8]復(fù)制圍生期HIBD模型來研究高壓氧治療實驗性新生豬缺血缺氧性腦損傷，取新生7 d的健康仔豬，應(yīng)用動脈夾鉗夾右頸總動脈后，放于低氧艙中(02：N2)，艙內(nèi)氧濃度保持在(8.0±0.5)%，艙溫控制在(36.5±0.5)℃,2 h后取出，恢復(fù)血液供應(yīng)[7]。此方法可導(dǎo)致胎豬腦神經(jīng)系統(tǒng)的一系列改變，但是此方法不足同樣為操作較為復(fù)雜、實驗成本較高，同時單結(jié)扎一側(cè)子宮動脈不能很好阻斷宮內(nèi)血液供應(yīng)，不能很好地模擬宮內(nèi)復(fù)雜的宮內(nèi)環(huán)境。胡電、古航、洪新如等制備胎兔宮內(nèi)窘迫模型來研究阿片μ及δ受體與胎兔宮內(nèi)窘迫發(fā)生的關(guān)系[9]。將妊娠30 d的母兔放在一個5 L容積的長方形玻璃器皿中，器皿一端連接于混合氣鋼瓶，以20 l/min速率向容器中充入含7%CO2的N2氣體，3～4 min后母兔死亡。充氣8 min后取出孕兔，立即打開腹腔暴露子宮。此種方法通過使孕兔缺氧窒息，雖然間接造成胎兔宮內(nèi)窘迫狀態(tài)，但卻不能直接模擬人類復(fù)雜的宮內(nèi)環(huán)境，所以無法再現(xiàn)由于胎盤功能因素或臍帶因素等直接原因造成的胎兒HIBD。

3 鉗夾結(jié)扎HIBD動物模型建立中的應(yīng)用

Trescher等采用鉗夾孕鼠雙側(cè)子宮動脈30 min，研究子宮胎盤缺血對胎鼠體重及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育造成的不良影響[10-11]。宋薇薇、韓玉昆等在實驗研究中鉗夾孕21 d的Wistar大白鼠的雙側(cè)子宮動、靜脈，用以研究宮內(nèi)窘迫胎鼠腦組織與肝組織氧自由基的損傷[12-13]。此種方法造成新生大鼠左側(cè)腦組織缺氧缺血性腦損傷病理學(xué)評分較高,并且早產(chǎn)新生大鼠全腦組織呈缺氧缺血性病理學(xué)改變?？捎锰ナ笾谱魈簩m內(nèi)窘迫動物模型，因鼠在缺氧缺血后可以存活很長時間所以更適合長期研究，但胎鼠在子宮內(nèi)是靠子宮和卵巢的血管共同攝取養(yǎng)分，建模時中如果單結(jié)扎子宮的血管，靠在子宮上段的胎鼠就會缺血缺氧不充分，不能很好的模擬臨床宮內(nèi)窘迫后腦損傷狀況，可能人為造成實驗結(jié)果的偏差。

1988年Magal等利用妊娠20 d大鼠，鉗夾進(jìn)入每個胎盤的血管共15 min，制成宮內(nèi)窘迫胎鼠模型，在無菌環(huán)境條件下,剖開腹部,用止血鉗完全阻斷子宮體、子宮角的動脈血管,造成乳鼠急性腦缺氧缺血,致使腦部發(fā)生病理改變以及存活乳鼠行為的變化。結(jié)扎臨產(chǎn)大鼠子宮,可造成乳鼠急性腦缺氧缺血動物模型，此法操作簡單、快速,腦缺氧缺血徹底,乳鼠腦部病理改變明顯，存活的乳鼠出現(xiàn)程度不同的神經(jīng)麻痹疾病癥狀。

農(nóng)紹漢等采用了此方法建立胎鼠宮內(nèi)窘迫模型，妊娠20 d SD大鼠麻醉后，剖腹暴露子宮角，分離出進(jìn)入每個胎盤的分支血管，用無創(chuàng)性血管夾阻斷分支血管15 min，解除阻斷，恢復(fù)血液供應(yīng)[14]。實驗證明此模型可以較好地用于胎兒宮內(nèi)窘迫腦損傷的進(jìn)一步研究。本模型的優(yōu)點是價格相對低廉，缺點是動物實驗在操作上較為復(fù)雜，分離血管時需注意避免傷及細(xì)小的分支血管及鄰近器官組織。

薄濤等采用妊娠19.5 d的小鼠，游離并結(jié)扎其雙側(cè)子宮動脈完全阻斷血液供應(yīng)復(fù)制圍產(chǎn)期缺血缺氧性腦損傷動物模型[15]。實驗組胎鼠腦的病理改變與人類缺血缺氧性腦損傷相似，而且病變也以大腦皮層最為顯著。此操作較簡便的復(fù)制缺血缺氧性腦損傷動物模型的方法，但是其不足之處是小鼠體積較小，胎鼠更小，如實驗中需進(jìn)一步研究胎鼠各器官各項指標(biāo)的變化，在實驗操作上要求會更高一些。

4 近年來研究成果與展望

近年，很多研究人員嘗試通過同時鉗夾雙側(cè)子宮、卵巢血管的方法建立胎鼠HIBD模型，這是對阻斷子宮動、靜脈血供方法的進(jìn)一步探討與完善。有研究人員通過鉗夾單側(cè)子宮及卵巢血管30 min后形成缺血再灌注制成FGR大鼠模型,從而研究了宮內(nèi)生長受限(IUGR)的新生大鼠腦組織及肝臟組織中SOD、MDA水平的變化。毛萌、趙肱等鉗夾妊娠17 d的雌性大鼠雙側(cè)子宮及卵巢動脈建立簡便、可靠的大鼠宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)模型并觀察胎盤的結(jié)構(gòu)與功能變化[16]。該實驗證實了此模型的優(yōu)點是操作方法簡單、胎鼠死亡率低，成功率較高等。同時阻斷子宮與卵巢血管是一種更為科學(xué)合理的復(fù)制缺血缺氧性腦損傷動物模型的方法。充分模擬宮內(nèi)窘迫造成的缺血缺氧性腦損傷，實驗證實，此模型是模仿臨床圍生期胎兒窘迫較為理想的動物模型，此方法簡單，剖宮手術(shù)時間短，腦缺血缺氧時間易于掌握且病理變化更明顯，同時大鼠繁殖力極強，在相同的實驗條件下可繁殖出多批相同的動物模型。大鼠繁殖生長的整個過程比較短，在實驗周期可以有效地節(jié)省一定的時間。與其他方法相比，此模型可以在臨床表現(xiàn)及腦部病理改變上達(dá)到一致，大鼠便于長期飼養(yǎng)，該模型重復(fù)性好,操作簡便,大鼠為雙子宮的哺乳動物，實驗中并可成功設(shè)立同體對照,以減少由于外界因素對實驗結(jié)果造成的誤差，為進(jìn)行HIBD相關(guān)的產(chǎn)科理論研究提供了一個有利的技術(shù)平臺。

綜上所述，同時鉗夾孕鼠子宮、卵巢血管造成胎鼠缺氧模型是臨床圍生期胎兒窘迫較為理想的動物模型。