腦脊液宏基因組下一代測(cè)序技術(shù)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病診斷中的應(yīng)用

趙雪瑤,李大偉

(1.北華大學(xué),吉林 吉林 132113;2北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132113)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)感染性疾病是由各種病原微生物侵犯腦實(shí)質(zhì)、血管及被膜引起的神經(jīng)系統(tǒng)重癥疾病，具有高病死率和致殘率等特點(diǎn)。因病原微生物檢測(cè)手段有限，極易延誤診斷及治療。宏基因組下一代測(cè)序(mNGS)基于大規(guī)模并行測(cè)序原理，利用多個(gè)DNA小片段平行測(cè)序來(lái)確定序列[1]，可同時(shí)檢測(cè)樣本中全部病原微生物，對(duì)于CNS感染性疾病病原學(xué)診斷與鑒別診斷具有重要意義。本文綜述近幾年mNGS應(yīng)用于CNS感染性疾病病原學(xué)診斷的相關(guān)文獻(xiàn)，比較其在應(yīng)用中的利弊，幫助臨床醫(yī)生提高對(duì)mNGS技術(shù)和其在診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病中應(yīng)用的認(rèn)識(shí)。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病是神經(jīng)系統(tǒng)重癥疾病，早期診斷、及時(shí)治療對(duì)改善患者預(yù)后至關(guān)重要。目前臨床常用腦脊液病原學(xué)檢測(cè)方法主要有：涂片鏡檢、病原菌培養(yǎng)、抗原抗體檢測(cè)及分子生物學(xué)檢測(cè)。涂片法雖然操作簡(jiǎn)便，但敏感性低；培養(yǎng)法是病原學(xué)診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但耗時(shí)較長(zhǎng)，不利于早期診斷；抗原抗體檢測(cè)及分子生物學(xué)檢測(cè)是目前臨床中應(yīng)用較廣泛檢測(cè)方法，但其診斷敏感度也僅能達(dá)到40%～50%。病原學(xué)診斷困難是制約CNS感染性疾病早期診治主要障礙。

宏基因組下一代測(cè)序(mNGS)是一種DNA測(cè)序技術(shù)，基于大規(guī)模并行測(cè)序原理，在不需要靶基因前提下對(duì)樣本中全部核酸進(jìn)行提取、測(cè)序，并進(jìn)行成像及數(shù)據(jù)分析[1]。隨著基因測(cè)序技術(shù)發(fā)展，mNGS已廣泛應(yīng)用于全基因組測(cè)序、基因組多樣性研究、宏基因組學(xué)、表觀遺傳學(xué)、非編碼RNA和蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)研究以及RNA測(cè)序基因表達(dá)譜分析[2]。由于mNGS是無(wú)針對(duì)性對(duì)樣本中全部基因組進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)樣本中全部病原微生物，與傳統(tǒng)腦脊液診斷技術(shù)相比，不僅具有高敏感度優(yōu)勢(shì)，更具有無(wú)偏性特點(diǎn)[3]，這對(duì)CNS感染性疾病診斷與鑒別診斷十分重要。

1 mNGS檢測(cè)原理

基因測(cè)序技術(shù)最早由Sanger和Coulson于1975年首次提出并研發(fā)，被稱(chēng)為第一代測(cè)序技術(shù)。其基本原理是在所需核酸序列任一側(cè)應(yīng)用寡核苷酸引物，添加DNA聚合酶和核苷酸“構(gòu)建塊”混合物，使延長(zhǎng)的核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止，生成一系列不同拷貝“鏈終止”產(chǎn)物，然后在凝膠或毛細(xì)管系統(tǒng)上通過(guò)電泳分離出來(lái)并進(jìn)行檢測(cè)。宏基因組下一代測(cè)序是基于大規(guī)模并行測(cè)序原理，可同時(shí)對(duì)成千上萬(wàn)DNA片段進(jìn)行測(cè)序。主要包括：①文庫(kù)制備：將DNA分成多個(gè)短片段，并在這些小片段兩端添加上不同接頭，構(gòu)建單鏈DNA文庫(kù)；②應(yīng)用不同方法進(jìn)行DNA片段分離并擴(kuò)增，形成不同DNA簇；③測(cè)序及分析。目前臨床中常用的二代測(cè)序平臺(tái)為illumina(舊稱(chēng)Solexa)和454方法(也稱(chēng)為Roche FLX)，雖然不同測(cè)序技術(shù)使用方法不同，但基本原理相似[4]。與一代測(cè)序相比，具有高效低成本優(yōu)勢(shì)，使得測(cè)序技術(shù)能夠在臨床中廣泛應(yīng)用。

2 NGS在腦脊液病原診斷中的應(yīng)用現(xiàn)狀

2.1CNS病毒感染：病毒性腦炎是臨床中常見(jiàn)的CNS感染性疾病，可通過(guò)腦脊液病毒抗體檢測(cè)、PCR檢測(cè)進(jìn)行病原學(xué)診斷。因病原體多樣性，傳統(tǒng)腦脊液檢測(cè)方法敏感性有限。mNGS在CNS病毒感染診斷中已取得了一定進(jìn)展，文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)常見(jiàn)病原菌檢測(cè)有效，如單純皰疹病毒1型、2型、3型(HSV-1、hsv-2、HSV-3)、水痘帶狀皰疹病毒(VZV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、柯薩奇A9病毒等[5-9]。mNGS可在不使用任何引物或探針情況下對(duì)樣本全部核酸進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序[10]，其優(yōu)勢(shì)不僅體現(xiàn)在常規(guī)病毒檢測(cè)，更體現(xiàn)在罕見(jiàn)病毒的檢測(cè)。Julianne等人通過(guò)對(duì)病因不明腦炎病例進(jìn)行腦脊液病原學(xué)NGS檢測(cè)研究[11]中，發(fā)現(xiàn)2例人細(xì)小病毒4 (PARV4)病例；1例人類(lèi)冠狀病毒OC-43病例；1例人星狀病毒MLB1病例及1例腮腺炎疫苗病毒感染病例。盡管對(duì)于此類(lèi)病毒致病性仍有爭(zhēng)議，但此檢測(cè)方法無(wú)疑為腦脊液病原學(xué)診斷帶來(lái)了新的可能。

除腦脊液病原學(xué)檢測(cè)，mNGS技術(shù)在診斷病毒學(xué)方面還有許多潛在應(yīng)用，如發(fā)現(xiàn)和鑒定未知病毒、超靈敏監(jiān)測(cè)抗病毒藥物耐藥性、研究病毒多樣性、進(jìn)化和傳播等[12-13]。2020年新型冠狀病毒橫掃全球，盡管目前新冠病毒侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)病例罕有報(bào)導(dǎo)，但也為我們敲響警鐘，病毒相關(guān)性疾病千變?nèi)f化，及時(shí)診斷對(duì)于疾病治療及遏制傳播至關(guān)重要。隨著測(cè)序技術(shù)發(fā)展，mNGS將成為應(yīng)對(duì)新發(fā)疾病有效手段。

2.2CNS細(xì)菌感染：細(xì)菌感染亦是CNS常見(jiàn)感染類(lèi)型，病情多兇險(xiǎn)，致死致殘率高。迄今為止，已有數(shù)百種病原微生物被證實(shí)可引起此類(lèi)疾病。由于檢測(cè)手段有限，且抗感染藥物濫用，傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率較低，尤其對(duì)未知病原體或混合感染識(shí)別較差?？焖贉?zhǔn)確病原菌鑒定，并給予針對(duì)病原菌精準(zhǔn)抗感染治療是困擾臨床工作的重大問(wèn)題。mNGS檢測(cè)可獲得樣品全部基因組信息，并可通過(guò)16srRNA基因分析進(jìn)行細(xì)菌種類(lèi)鑒定和分類(lèi)學(xué)研究，有效檢測(cè)和鑒定常見(jiàn)及罕見(jiàn)病原菌[14]。同時(shí)mNGS有助于驗(yàn)證常規(guī)方法檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)是否存在合并感染及感染類(lèi)型，尤其是在接受高級(jí)預(yù)防性抗生素治療的患者中[15]。在一項(xiàng)診斷小兒CNS細(xì)菌感染研究中指出，mNGS具有較高敏感性，使病原菌檢出陽(yáng)性率提高13.1%(病原菌檢出陽(yáng)性率由55.6%提高到68.7%)[16]。在尚晶等人研究[17]中發(fā)現(xiàn)，腦脊液mNGS病原學(xué)檢出率為53.33%，與傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)在Aicui等人研究[18]結(jié)果表明，腦脊液細(xì)菌種類(lèi)復(fù)雜，61.5%標(biāo)本呈混合病原感染，mNGS對(duì)于混合感染病原菌鑒定有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。綜上所述，mNGS不僅可提高CNS細(xì)菌感染診斷率，同時(shí)對(duì)混合感染鑒別及指導(dǎo)下一步治療，均有重要意義。

2.3CNS結(jié)核感染：目前，結(jié)核病在全世界范圍仍廣泛流行，CNS結(jié)核感染嚴(yán)重危害著人類(lèi)健康。由于結(jié)核菌特殊性，常規(guī)病原學(xué)檢測(cè)方法敏感度有限，且耗時(shí)長(zhǎng)，早期診斷困難，進(jìn)而延誤治療使預(yù)后不佳。近年來(lái)更多證據(jù)表明，mNGS檢測(cè)CNS結(jié)核，其總敏感性為66.7%～84.4%，特異性為96.4%～100%[19-21]。與其他腦脊液結(jié)核分枝桿菌相關(guān)檢測(cè)相比，mNGS具有較高檢出率[20]。盡管mNGS對(duì)腦脊液結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)敏感度高，但仍存在一定局限性，首先其陰性預(yù)測(cè)值(NPV)僅為46.5%[21]，未達(dá)到排除臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)；其次對(duì)結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測(cè)，不如傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法(如Xpert等)成熟；此外，由于成本較高，且對(duì)檢測(cè)人員技術(shù)及實(shí)驗(yàn)室要求較高，目前在中低發(fā)達(dá)地區(qū)開(kāi)展困難，因此限制了其在CNS結(jié)核病診斷中的應(yīng)用。

2.4CNS真菌感染：CNS真菌感染常見(jiàn)于免疫缺陷患者，近年來(lái)健康成人感染報(bào)道亦逐漸增多。CNS真菌感染類(lèi)型最常見(jiàn)的為新型隱球菌。王芳等人對(duì)7例新型隱球菌腦膜炎患者，進(jìn)行相關(guān)檢查，其中隱球菌莢膜抗原檢測(cè)陽(yáng)性5例(71.4%)，墨汁染色陽(yáng)性3例(42.9%)，培養(yǎng)陽(yáng)性2例(28.6%)，mNGS陽(yáng)性3例(42.9%)，mNGS敏感性與墨汁染色相近[22]。而葛瑛等人對(duì)6例新型隱球菌腦膜炎患者進(jìn)行腦脊液檢測(cè)，5例患者mNGS陽(yáng)性[23]。從目前研究中可以發(fā)現(xiàn)，mNGS對(duì)于真菌檢測(cè)敏感度與傳統(tǒng)檢測(cè)方法無(wú)明顯差異，可能是由于樣本量較小所致。但mNGS可以檢測(cè)樣本中全部病原微生物，能夠在早期對(duì)腦脊液樣本中真菌類(lèi)型進(jìn)行鑒別，對(duì)于臨床精準(zhǔn)治療，提高療效有非常重要的意義。

2.5罕見(jiàn)感染鑒定：對(duì)于常見(jiàn)CNS感染性疾病，常規(guī)病原學(xué)檢測(cè)手段雖然陽(yáng)性率較低，但仍可通過(guò)患者臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室輔助檢查進(jìn)行綜合判斷分析，經(jīng)驗(yàn)性診斷治療。而對(duì)于布魯桿菌病、螺旋體、寄生蟲(chóng)等感染病例，僅能在專(zhuān)科醫(yī)院進(jìn)行檢查鑒別，常會(huì)導(dǎo)致誤診及延誤治療。多項(xiàng)研究表明，mNGS對(duì)于布魯氏桿菌感染[24-25]、囊蟲(chóng)感染[26-27]具有較高檢出率。同時(shí)，對(duì)于臨床中罕見(jiàn)病原感染，mNGS更具優(yōu)勢(shì)。辛子凱及程楊等人報(bào)道[28-29]，應(yīng)用mNGS技術(shù)診斷CNS李斯特菌感染，趙偉麗及Wang等人報(bào)道[30-31]了應(yīng)用mNGS技術(shù)診斷CNS偽狂犬病毒感染，其他還有CNS Powassan病毒感染[32]、豬鏈球菌感染[33]、廣州管線原蟲(chóng)感染[34]、諾卡菌感染[35]、曼陀羅拉木裂體感染[36]等報(bào)道。由此可見(jiàn)，mNGS是CNS少見(jiàn)病原菌感染性疾病的診斷有效檢測(cè)手段。

3 腦脊液mNGS檢測(cè)技術(shù)優(yōu)勢(shì)

①?gòu)V泛識(shí)別已知和少見(jiàn)病原體，甚至發(fā)現(xiàn)新的生物體[37]；②發(fā)現(xiàn)和鑒定新病毒，監(jiān)測(cè)抗病毒藥物耐藥性，并通過(guò)基因測(cè)序研究病毒多樣性、進(jìn)化和傳播等[12-13]；③同時(shí)進(jìn)行多種病原菌檢測(cè)，是混合感染和CNS感染鑒別診斷有效手段[18]；④腦脊液作為無(wú)菌體液，污染可能性較其他樣本低，因此mNGS檢測(cè)更具有臨床診斷意義。

4 現(xiàn)階段面臨問(wèn)題

4.1mNGS檢測(cè)假陰性問(wèn)題：李霞等人研究[38]指出，mNGS假陰性原因主要有：①采樣環(huán)節(jié),如病原載量過(guò)低等；②儲(chǔ)存或運(yùn)輸過(guò)程,如未嚴(yán)格-20℃低溫凍存致核酸降解；③實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié),如真菌破壁效率較低,影響真菌檢出率；④數(shù)據(jù)庫(kù)不完善,如新發(fā)病原體未包含在數(shù)據(jù)庫(kù)中；⑤mNGS方法學(xué)原理不完善,如人源序列比例過(guò)高等。而在Qian等人研究[15]中指出，預(yù)先使用抗生素也可造成mNGS檢測(cè)結(jié)果假陰性。由此可見(jiàn)，多個(gè)環(huán)節(jié)均可影響mNGS檢測(cè)結(jié)果。因此，臨床醫(yī)生應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況，嚴(yán)格把握取材時(shí)間及總量，并嚴(yán)格規(guī)范操作流程，盡量減少假陰性發(fā)生。

4.2假陽(yáng)性結(jié)果：假陽(yáng)性結(jié)果可誤導(dǎo)或干擾臨床診斷，mNGS檢測(cè)臨床標(biāo)本中的微生物可以反映正常微生物群、瞬時(shí)定植菌、樣品污染或感染[3]。腦脊液雖然是常見(jiàn)無(wú)菌樣本，但仍不能排除污染可能，因此還需要進(jìn)一步研究，以尋求區(qū)分定植和感染最佳方法。

4.3新微生物鑒定：對(duì)于新微生物檢測(cè)，mNGS具有強(qiáng)大診斷效能。然而，在臨床樣本中發(fā)現(xiàn)一種新病原體或一組不尋常微生物只表明其潛在致病作用，并不能確定其與疾病因果關(guān)系[39]。因此，對(duì)于檢測(cè)結(jié)果中新微生物或罕見(jiàn)微生物，是否為此次感染致病微生物，仍需根據(jù)此病實(shí)際情況，進(jìn)行綜合分析。

4.4目前已有研究致力于解決mNGS人源DNA污染排除問(wèn)題[40]，如該問(wèn)題能夠得到徹底解決，病原學(xué)檢測(cè)準(zhǔn)確率會(huì)跨越式發(fā)展。

4.5mNGS檢測(cè)可能會(huì)漏掉不存在或短暫存在于腦脊液中的病原菌(如伯士疏螺旋體、神經(jīng)梅毒)。因此對(duì)于mNGS陰性結(jié)果且仍對(duì)診斷存在疑問(wèn)病例，建議聯(lián)合血液學(xué)mNGS檢測(cè)，進(jìn)行綜合診斷[41]。

5 小結(jié)

隨著測(cè)序技術(shù)發(fā)展，mNGS技術(shù)已趨于成熟，對(duì)于腦脊液病原體檢測(cè)率明顯提高，但其敏感度仍不足以滿足臨床診斷需要?，F(xiàn)階段可以通過(guò)改進(jìn)樣本處理、提取、擴(kuò)增和測(cè)序方法，來(lái)提高mNGS病原菌檢測(cè)敏感度[42]。首先，開(kāi)發(fā)新標(biāo)本處理方法，改進(jìn)病原菌富集和捕獲方式，尤其對(duì)于胞內(nèi)寄生菌，有效破壁方案是提取病原菌重要步驟。其次，高效提取核酸進(jìn)行擴(kuò)增，盡可能排除人源性核酸及其他定植菌污染，也是提高敏感度重要方法。最后，需不斷完善DNA文庫(kù)，提供廣泛覆蓋范圍，提高數(shù)據(jù)分析能力，進(jìn)一步提高檢測(cè)敏感度[15]。mNGS技術(shù)目前已開(kāi)始廣泛應(yīng)用于CNS感染檢測(cè)，隨著該技術(shù)的不斷改進(jìn)，將促進(jìn)CNS感染病原學(xué)診斷，為疾病診治提供理論依據(jù)，更好地為臨床服務(wù)。