腦缺血/再灌注損傷后線粒體結(jié)構(gòu)與功能穩(wěn)態(tài)失衡機制的研究進展

吳 丹 漆仲文 張 偉 馬 妍

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院腦病科，天津 300151

腦卒中具有高致死率、高致殘率、低治愈率的特點，預(yù)計到2030 年，腦卒中患病人數(shù)將繼續(xù)上升到7700 萬，造成更多的經(jīng)濟和社會負擔(dān)[1-2]。腦卒中包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中發(fā)病率占腦卒中總數(shù)的70%～80%[3]，遠高于出血性腦卒中。靜脈溶栓是目前治療急性缺血性腦卒中的重要內(nèi)科治療手段[4]，但因治療時間窗及應(yīng)用風(fēng)險等原因，其在臨床應(yīng)用受到限制。諸多研究表明，線粒體結(jié)構(gòu)完整性及其功能穩(wěn)態(tài)平衡的破壞是缺血性腦卒中主要病理環(huán)節(jié)之一[5]。缺血性腦卒中首先表現(xiàn)為腦缺血損傷[6]，再灌注對于保護受損腦組織是必不可少的，但恢復(fù)血流后腦缺血/再灌注損傷也是不可避免的[7]。腦缺血/再灌注損傷主要包括鈣超載、氧化應(yīng)激及線粒體功能紊亂等環(huán)節(jié)[8]。線粒體是一種半自主細胞器，不僅在能量代謝中發(fā)揮重要作用，而且在控制細胞存亡的過程中也扮演著重要角色，腦缺血/再灌注損傷后細胞凋亡的發(fā)生主要取決于線粒體[5]。近年來，有關(guān)腦缺血/再灌注損傷后線粒體結(jié)構(gòu)及功能變化研究取得了一定進展，對促進缺血性腦損傷神經(jīng)元保護具有較大意義。本文對腦缺血/再灌注損傷后線粒體結(jié)構(gòu)與功能穩(wěn)態(tài)失衡的研究進展進行論述，旨在為臨床及實驗研究提供參考。

1 線粒體與腦缺血/再灌注損傷

線粒體是細胞鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的主要結(jié)構(gòu)，細胞鈣超載可導(dǎo)致氧化應(yīng)激，產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮，其中以線粒體內(nèi)ROS 大量生成為主[9-10]。線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）是ROS 依賴的位于線粒體內(nèi)外膜之間的一組蛋白復(fù)合體，線粒體內(nèi)鈣超載及氧化應(yīng)激可通過脂質(zhì)過氧化、損傷線粒體呼吸鏈等導(dǎo)致mPTP 的大量開放，進而使線粒體膜電位下降，釋放細胞色素C 等[11]。細胞色素C 為位于線粒體內(nèi)膜的小分子蛋白，它作為線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ和復(fù)合物Ⅳ之間的電子載體，其釋放可活化Caspase-9，繼而活化凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡[8]。可見線粒體結(jié)構(gòu)完整性及其功能穩(wěn)態(tài)平衡的破壞是腦缺血/再灌注損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，保護線粒體結(jié)構(gòu)和功能是腦缺血/再灌注損傷后神經(jīng)元保護的重點。

2 腦缺血/再灌注損傷后線粒體穩(wěn)態(tài)失衡的機制

2.1 氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激是腦缺血主要有害因素之一。正常生理條件下適量ROS 在一些重要生理過程中起關(guān)鍵作用，它可以被超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶和如谷胱甘肽等抗氧化劑迅速清除[12]。腦缺血時引起的線粒體呼吸鏈功能障礙在細胞中產(chǎn)生氧化應(yīng)激，對線粒體功能穩(wěn)態(tài)及防御造成巨大影響，使其無法正常清除氧自由基而導(dǎo)致細胞死亡。腦缺血后線粒體中氧氣減少，限制氧化磷酸化，ATP 生成減少，導(dǎo)致電子傳輸鏈釋放氧自由基，并在線粒體中產(chǎn)生大量ROS；而在再灌注過程中，供氧恢復(fù)后，促氧化劑酶系統(tǒng)和線粒體利用氧氣作為底物產(chǎn)生大量氧自由基，在細胞中產(chǎn)生大量ROS 并最終觸發(fā)從細胞信號通路改變到細胞死亡一系列過程[13]。所以線粒體是細胞內(nèi)ROS 的主要貢獻者，通過氧化磷酸化和其他酶反應(yīng)將分子氧轉(zhuǎn)化為SOD 和過氧化氫。電子傳輸鏈?zhǔn)浅趸锏闹饕獊碓?，線粒體在氧化磷酸化過程中通過細胞色素C 氧化酶將氧氣還原成水。

此外，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX）也被認為是腦缺血后ROS 形成的來源之一。NOX 作為一種促氧化酶，缺血會誘導(dǎo)其激活，加劇腦組織氧化應(yīng)激；而ROS 對缺氧條件敏感，腦血流再灌注后缺氧誘導(dǎo)因子會誘導(dǎo)NOX 產(chǎn)生更大量的ROS[14]。再灌注期間SOD 等內(nèi)源性抗氧化酶表達降低，無法進行有效氧化清除工作，不能有效阻止氧化劑介導(dǎo)的腦損傷，導(dǎo)致缺血后的線粒體功能障礙及隨后的細胞凋亡[15]。

2.2 線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔

mPTP 是控制線粒體基質(zhì)和細胞質(zhì)間分子交換的調(diào)節(jié)孔，由三種蛋白質(zhì)組成：線粒體外膜（outer mitochondrial membrane，OMM）中的電壓依賴性陰離子通道、線粒體內(nèi)膜（inner mitochondrial membrane，IMM）中的腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶及線粒體基質(zhì)中的親環(huán)素D（cyclophilin D，CypD）[16]，其中CypD 對mPTP 的調(diào)節(jié)最為關(guān)鍵，是參與神經(jīng)元缺血性死亡的重要部分。正常情況下mPTP 處于關(guān)閉狀態(tài)，IMM 選擇性地使小分子代謝底物與離子通過，當(dāng)細胞發(fā)生氧化應(yīng)激，基質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高，IMM 特異性孔位開放，mPTP 通透性增加，使大量小分子物質(zhì)及帶電離子如ROS 等進入胞內(nèi)，造成線粒體損傷，同時將細胞色素C、絲氨酸蛋白酶等從線粒體釋放到胞漿中，細胞色素C 與胞漿中促凋亡激活因子Apaf1 結(jié)合，觸發(fā)Caspase 級聯(lián)效應(yīng)，激活Caspase-3，導(dǎo)致神經(jīng)元細胞死亡[17]。臨床上多使用CypD 抑制劑環(huán)孢菌素進行干預(yù)，但因其毒性和免疫抑制作用在應(yīng)用時受到限制[18]。

2.3 鈣超載

正常情況下細胞內(nèi)Ca2+主要分布于線粒體及肌漿網(wǎng)中。腦缺血時腦血流中斷，供氧減少，大腦在缺氧狀態(tài)下ATP 生成減少，線粒體功能障礙，使Na+/K+/ATP 酶等離子通道無法維持正常的電化學(xué)梯度，導(dǎo)致膠質(zhì)細胞和神經(jīng)細胞持續(xù)去極化[19]，致使電壓門控通道持續(xù)開放，細胞內(nèi)濃度升高；細胞外基質(zhì)內(nèi)谷氨酸因再攝取而蓄積，過量的谷氨酸與突觸后神經(jīng)元上N-甲基-D-天冬氨酸和腺苷酸等離子受體結(jié)合，引起Ca2+大量內(nèi)流，造成興奮性毒性。持續(xù)的Ca2+內(nèi)流導(dǎo)致磷脂酶和蛋白酶的激活，誘導(dǎo)ROS 的生成、細胞膜破壞，細胞外液進入細胞內(nèi)部，導(dǎo)致細胞毒性水腫并最終造成細胞壞死[20]。在缺血期和再灌注期，Ca2+超載使超氧陰離子自由基及其他氧自由基升高，Ca2+超載僅是觸發(fā)因素，而后續(xù)L 型鈣通道的持續(xù)下調(diào)可能是遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的原因之一[21]。

2.4 線粒體自噬

線粒體動力學(xué)（線粒體分裂、線粒體融合和線粒體自噬）在線粒體穩(wěn)態(tài)調(diào)控中起關(guān)鍵作用，調(diào)節(jié)線粒體動力學(xué)的機制與線粒體自噬的啟動密切相關(guān)[22]，機體可選擇性通過自噬消除受損線粒體，恢復(fù)線粒體功能穩(wěn)態(tài)[23]。細胞凋亡或饑餓時，線粒體通過有絲分裂進行降解與再循環(huán)，這是線粒體自噬的特殊形式，可分為泛素依賴途徑和受體依賴途徑[24]。

泛素依賴途徑通過線粒體泛素化，使受損線粒體被吞噬并通過溶酶體降解去除。目前該途徑研究重點集中在調(diào)節(jié)PINK1/Parkin 通路上。線粒體損傷導(dǎo)致線粒體膜電位破壞，使PINK1 在OMM 表面堆積，進行PINK1 招募并激活磷酸化PINK1 泛素樣域中的Parkin，使其聚集到受損的線粒體中[25-26]。Parkin 激活導(dǎo)致OMM 上的駐留蛋白發(fā)生泛素化級聯(lián)效應(yīng)，線粒體表面泛素信號增加，激活泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解OMM 蛋白及自噬受體蛋白，使自噬細胞發(fā)育[27]。自噬由一組被稱為自噬相關(guān)（autophagy-related gene，Atg）蛋白的核心蛋白驅(qū)動，Atg 蛋白控制自噬體的啟動，隨后展開其雙膜結(jié)構(gòu)包裹溶酶體降解所用的細胞質(zhì)內(nèi)容物[28]。此外，有研究表示作用于上游或獨立于PINK1激活的泛素特異性蛋白酶30，能通過去泛素化OMM蛋白與調(diào)節(jié)神經(jīng)元中的PINK1/Parkin 通路，起到適度有絲分裂及吞噬作用[29]。

受體依賴途徑主要通過腺病毒E1B 相互作用蛋白3（Bcl2/adenovirus E1B19kDa interacting protein 3，BNIP3）/NIP 樣蛋白X（NIP-like protein X，NIX）信號通路實現(xiàn)，Bcl2/BNIP3 和NIX 的相互作用蛋白被認為參與了缺氧誘導(dǎo)的有絲分裂。早期對這些蛋白作用的研究主要集中在細胞凋亡上，NIX 與BNIP3 有約50%的同源性，兩者均位于OMM 上，含有一個非典型的Bcl2 同源3 結(jié)構(gòu)域，并且具有主要的細胞質(zhì)N-末端[30-31]。NIX 是一種自噬受體，在線粒體損傷后和紅細胞分化過程中介導(dǎo)線粒體清除。當(dāng)線粒體受到壓迫時，NIX 和微管相關(guān)蛋白輕鏈3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）的相互作用增加，靶向線粒體進入自噬體降解[32]。過去對BNIP3 研究主要針對其激活Bax 或Bak 細胞介導(dǎo)線粒體功能障礙方面[33]。近期研究發(fā)現(xiàn)BNIP3 具有激活線粒體自噬和誘導(dǎo)死亡的功能，參與線粒體自噬的多個調(diào)控過程[34]。BNIP3 過表達誘導(dǎo)廣泛自噬，其中線粒體被認定為“貨物”，當(dāng)被缺氧情況或羰基氰化物間氯苯腙激活時，BNIP3 表達量增加，BNIP3 二聚化導(dǎo)致LC3B 募集，從而促進選擇性線粒體清除，實現(xiàn)自噬[35]。

腦缺血/再灌注后造成腦內(nèi)缺氧環(huán)境，致使線粒體無法正常合成ATP，與此同時線粒體膜電位下降，為維持線粒體膜電位穩(wěn)定，線粒體消耗ATP 大幅增加。細胞內(nèi)ATP 濃度降低與AMP 因能量損耗而減少使AMP 活化蛋白激酶活性增強，其激活抑制mTOR 活性，從而上調(diào)自噬[36]。此外，在腦缺血后的再灌注時期，受之前缺血缺氧影響，腦神經(jīng)元中的線粒體結(jié)構(gòu)與功能穩(wěn)態(tài)失衡，所以當(dāng)血流再灌注時，所帶來的氧氣除為細胞供能外，也同時產(chǎn)生了大量ROS。過量的ROS 直接損傷線粒體，使線粒體應(yīng)對氧化應(yīng)激的能力減低，影響細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)，且能開放mPTP，導(dǎo)致線粒體腫脹，啟動線粒體自噬[37]。缺血/再灌注發(fā)生后不僅細胞能量缺失，ATP 通道受損，細胞內(nèi)Ca2+也隨之升高，線粒體吸收Ca2+濃度增加，從而影響線粒體代謝，造成線粒體腫脹、崩解，促進細胞色素C 釋放，最終導(dǎo)致細胞凋亡，所以啟動線粒體自噬清除受損線粒體以保護神經(jīng)細胞[38]。但目前對于線粒體自噬在腦缺血/再灌注中發(fā)揮的作用還沒有統(tǒng)一答案，綜合近期多數(shù)研究還是表明線粒體自噬過程對于腦缺血/再灌注損傷，在一定程度上具有神經(jīng)保護作用[39-41]。

3 小結(jié)

腦卒中是一個復(fù)雜的病理生理過程，恢復(fù)血流后的腦缺血/再灌注損傷不可避免。線粒體不僅在能量代謝中起關(guān)鍵作用，而且對神經(jīng)元細胞凋亡也有重要影響。腦缺血后失血失氧狀態(tài)會導(dǎo)致線粒體功能穩(wěn)態(tài)失衡。過量ROS 產(chǎn)生的氧化應(yīng)激導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)和功能的損傷，細胞抗氧化能力失常，無法清除自由基而致細胞死亡。線粒體內(nèi)鈣超載以及氧化應(yīng)激可通過脂質(zhì)過氧化、損傷線粒體呼吸鏈等導(dǎo)致mPTP 的大量開放，使線粒體膜電位下降，釋放細胞色素C 等物質(zhì)，繼而活化Caspase-9，并向下活化凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。腦缺血/再灌注損傷后，Ca2+的大量內(nèi)流導(dǎo)致鈣超載，而鈣超載是導(dǎo)致細胞死亡的重要因素。機體在腦缺血后可選擇性通過自噬的受體依賴途徑及泛素依賴途徑消除受損線粒體，使其恢復(fù)功能穩(wěn)態(tài)。因此保護線粒體結(jié)構(gòu)和功能是腦缺血/再灌注損傷后神經(jīng)元保護的重點。但對其作用機制間的相互作用及有效干預(yù)措施的研究尚不完善，相信隨著對腦缺血/再灌注損傷后線粒體結(jié)構(gòu)與功能穩(wěn)態(tài)失衡研究的不斷深入，以線粒體為作用重點的治療方法將為腦卒中的發(fā)生、發(fā)展提供新的防治思路及方法。