玄參配方顆粒制備工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

許洪波，黎彥宏，蔡興航，楊 康，陳素蕓，冀 春，劉乃堯，唐志書△

1 陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽712083；2 西安市第一醫(yī)院；3 西安市中醫(yī)醫(yī)院

中藥玄參Radix Scrophulariae 為玄參科植物玄參Scrophularia ningpoensis Hemsl.的干燥根。玄參具有清熱涼血，滋陰降火，解毒散結(jié)之功效，常用于熱病傷陰、溫毒發(fā)斑、舌絳煩渴、津傷便秘、骨蒸勞嗽、咽痛、目赤等癥的治療［1］。玄參主要含有糖類、環(huán)烯醚萜、苯丙素、萜類、苯酚、甾醇、黃酮等化學(xué)成分［2］，其中，由于玄參含有大量糖類，因此在貯存過程中更容易吸潮、霉變和生蟲［3］。中藥配方顆粒是采用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)將中藥飲片經(jīng)提取、濃縮、干燥制成顆粒劑，具有服用簡單，便于攜帶，利于儲(chǔ)存等特點(diǎn)［4-7］。廣西壯族自治區(qū)和廣東等省份分別頒布了玄參配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，一定程度上為玄參配方顆粒的使用和監(jiān)管提供了依據(jù)，但至今沒有形成統(tǒng)一可控的國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，尤為重要［8-9］。此前，周小雅等［10］采用紫外-高效液相色譜（ultraviolet-highperformance liquid chromatography，UV-HPLC）雙波長法同時(shí)測定了玄參配方顆粒中哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸3 種成分的含量。徐圣秋等［11］采用高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography，HPLC）測定了玄參配方顆粒中哈巴俄苷的量。鈕正睿等［3］用HPLC測定了玄參配方顆粒中哈巴俄苷和肉桂酸的含量。這些研究多針對(duì)玄參配方顆粒中的一種或多種成分的含量進(jìn)行測定，未涉及其薄層色譜鑒別。本研究對(duì)玄參配方顆粒制備提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并在此基礎(chǔ)上制備配方顆粒，建立薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）定性鑒別方法和HPLC 含量測定方法，以期為形成統(tǒng)一的玄參配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料與儀器

1.1 儀器HT-2109 型電磁爐（廣東美的生活電器制造有限公司），EYELA N-1100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會(huì)社），Zirbus-Vaco5 冷凍干燥機(jī)（德國Zirbus科技），島津LC-20A高效液相色譜儀（日本島津），KQ-300DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），CPA2250 型電子天平（賽多利斯公司，讀數(shù)精度0.01 mg）。

1.2 藥物及試劑實(shí)驗(yàn)用玄參飲片購自亳州藥材市場，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)王薇教授鑒別，同時(shí)按照《中華人民共和國藥典》2015 版一部玄參項(xiàng)下薄層鑒別方法進(jìn)行鑒定，為玄參科植物玄參（Scrophularia ningpoensisHemsl.）的干燥根。色譜純乙腈（德國默克公司，批號(hào)：I38579）；哈巴苷（含量96.8%，批號(hào)：111729-201707）和哈巴俄苷對(duì)照品（含量95.9%，批號(hào)：111730-201709）及玄參對(duì)照藥材均購自中國食品藥品檢定研究院；其余試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝優(yōu)化

2.1.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 玄參的傳統(tǒng)用藥方式多為湯劑，因此，本研究使用水作為提取溶媒。國家藥典委員會(huì)在2016 年公布的《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求（征求意見稿）》中將出膏率作為配方顆粒制備中的重要參數(shù)，因此，本實(shí)驗(yàn)以出膏率為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)提取過程中三個(gè)主要因素（提取時(shí)間、提取次數(shù)和料液比）進(jìn)行考察，試驗(yàn)選用L9（34）正交表，見表1。

2.1.2 正交試驗(yàn)方法及結(jié)果 分別稱取9 份玄參飲片，每份50 g，先用純凈水浸泡30 min，之后按照L9（34）正交表安排試驗(yàn)，A列為空白列。實(shí)驗(yàn)所得提取液趁熱濾過，減壓濃縮至適量，經(jīng)冷凍干燥后，計(jì)算出膏量。由極差分析結(jié)果可知：3 個(gè)因素對(duì)玄參出膏量影響程度為：提取次數(shù)＞提取時(shí)間＞料液比；方差分析結(jié)果表明：提取次數(shù)對(duì)結(jié)果的影響顯著，提取時(shí)間和料液比影響不顯著；因此，基于節(jié)約成本考慮，因素A和B均取最小值，即A1、B1，最終確定的提取工藝為：A1B1C3，即玄參飲片用水煎煮3次，每次30 min，3次煎煮分別加入10、8和8倍量水。見表2—3。

表1 玄參提取工藝正交試驗(yàn)因素及水平

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析

表3 正交試驗(yàn)方差分析

2.2 玄參配方顆粒制備取干燥的玄參飲片1500 g，浸泡30 min，按照正交試驗(yàn)確定的最佳工藝進(jìn)行提取，濾過，合并濾液，進(jìn)行適當(dāng)濃縮，加入相當(dāng)于固體含量20% 的糊精，在進(jìn)風(fēng)口溫度110 ℃進(jìn)行噴霧干燥，得到浸膏粉，按照m浸膏粉∶m糊精=1∶0.7 均勻混合，用95%的乙醇制成軟材，過1號(hào)篩制粒，70℃烘箱干燥3 h后，取出用1號(hào)篩和5號(hào)篩雙篩分取即得。

2.3 玄參配方顆粒TLC鑒別

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 分別取哈巴苷、哈巴俄苷適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，即得。

2.3.2 對(duì)照藥材溶液的制備 按照2015 版《中華人民共和國藥典》中玄參［鑒別］（2）項(xiàng)下方法制備玄參對(duì)照藥材溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 取配方顆粒1 g，研細(xì)，加水25 mL 使溶解，用水飽和的正丁醇提取2次，每次25 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，即得供試品溶液。

2.3.4 薄層鑒別 用毛細(xì)管分別吸取適量對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液、供試品溶液點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（8∶2∶0.2）為展開劑，展開至薄層板前沿后取出，晾干，在254 nm紫外光下檢視，之后噴以10%硫酸-乙醇溶液，電爐加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。由圖1 可知，供試品色譜中，在與玄參對(duì)照藥材及對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

圖1 玄參配方顆粒薄層鑒別色譜圖

2.4 玄參配方顆粒HPLC含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱為Agilent TC-C18（250×4.6 mm，5 μm），以0.03%磷酸溶液為流動(dòng)相A，以乙腈為流動(dòng)相B，梯度洗脫：0～10 min，3%～10%B；10～20 min，10%～33%B；20～25 min，33%～50% B；25～30 min，50%～80% B；30～35 min，80%B；35～37 min，80%～3% B；流速為1.0 mL/min，檢測波長210 nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量10 μL。在此條件下，供試品溶液中的哈巴苷和哈巴俄苷分離良好，其他成份及輔料無干擾。見圖2。

圖2 玄參配方顆粒HPLC圖

2.4.2 對(duì)照品溶液制備 分別取哈巴苷和哈巴俄苷對(duì)照品適量，精密稱定，加30%甲醇制成每1 mL含哈巴苷89.06 μg、哈巴俄苷48.05 μg 的溶液，即得混合對(duì)照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 取玄參配方顆粒約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，浸泡1 h，超聲處理30 min放冷，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45 m濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.4.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，分別置10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，按“2.4.1”方法進(jìn)樣，分別測定哈巴苷和哈巴俄苷的峰面積，以濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)X，以峰面積為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得哈巴苷回歸方程為Y=3383.013X+1776.889，R2=1.0000，線性范圍8.91～89.06 μg/mL；哈巴俄苷回歸方程為Y=19457X+10793.11，R2=0.9999，線性范圍4.81～48.05 μg/mL。

2.4.5 方法學(xué)考察

2.4.5.1 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，按“2.4.1”色譜條件重復(fù)測定6 次，計(jì)算哈巴苷和哈巴俄苷峰面積的RSD 分別為1.03%和0.48%。表明儀器精密度良好。

2.4.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別在第0、2、4、8、12、24 h測定，計(jì)算哈巴苷和哈巴俄苷峰面積的RSD 分別為1.92%和0.91%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 按照“2.4.3”方法平行制備6 份供試品溶液，按上述色譜條件測定，計(jì)算哈巴苷和哈巴俄苷峰面積的RSD 分別為1.36%和1.95%。表明建立的方法重復(fù)性良好。

2.4.5.4 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的玄參配方顆粒6 份，精密稱定，根據(jù)配方顆粒中哈巴苷和哈巴俄苷的含量按1∶1添加各對(duì)照品，平行制備6份供試品溶液，按“2.4.1”方法測定。計(jì)算供試品溶液中哈巴苷和哈巴俄苷平均加樣回收率分別為102.47%和97.78%，RSD 分別為1.88%和2.70%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.4.6 樣品測定 根據(jù)建立的色譜方法，對(duì)3 批自制和1 批市售玄參配方顆粒中哈巴苷和哈巴俄苷的含量進(jìn)行測定。見表4。

表4 玄參配方顆粒含量測定 %

3 討論

哈巴苷和哈巴俄苷是玄參中的2 個(gè)主要環(huán)烯醚萜苷類成分，有研究表明：哈巴俄苷能使陰虛小鼠抑制的免疫功能恢復(fù)；哈巴苷、哈巴俄苷均能促進(jìn)陰虛小鼠體外脾淋巴細(xì)胞增殖［11］，具有鎮(zhèn)痛、抗炎等作用，與玄參滋陰和抗炎功效密切相關(guān)［12-13］；因此，哈巴苷和哈巴俄苷被認(rèn)為是玄參特征性成分。2015 年版《中華人民共和國藥典》就以哈巴苷和哈巴俄苷的含量作為玄參藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。本研究以玄參特征性成分哈巴苷和哈巴俄苷含量作為指標(biāo)，能更加全面的反映玄參配方顆粒的質(zhì)量。

目前，有關(guān)玄參配方顆粒的文獻(xiàn)報(bào)道中，尚沒有對(duì)其TLC 定性鑒別進(jìn)行探討，本研究構(gòu)建了玄參配方顆粒的TLC 定性鑒別方法。針對(duì)玄參配方顆粒所含糖苷類化合物較多的特點(diǎn)，研究中反復(fù)比較了石油醚-丙酮-甲酸、氯仿-丙酮-甲酸、氯仿-甲醇-甲酸等多種加酸或不加酸的展開體系，最后發(fā)現(xiàn)以氯仿-甲醇-水為展開劑效果較好。關(guān)于展開劑的配比，最后確定氯仿-甲醇-水的比例為8∶2∶0.2，在該配比下，展開劑可直接配制使用，從而免去了靜置分液的程序，而且主要斑點(diǎn)的比移值適中?？傊摲椒ê啽?，重復(fù)性好，能快速有效控制玄參配方顆粒的質(zhì)量。