棉鈴蟲乙醇脫氫酶5的原核表達(dá)和活性分析及其抗血清的制備*

古新蓉，羅生慧，魏林昱，姜巖，劉小寧

(新疆大學(xué) 新疆生物資源和基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊830046)

0 引言

棉鈴蟲嚴(yán)重危害棉花產(chǎn)量，被認(rèn)為是寄主范圍廣泛且破壞性強(qiáng)的毀滅性農(nóng)業(yè)害蟲，在世界范圍內(nèi)對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]．在植物和害蟲的協(xié)同進(jìn)化中，植物在受到害蟲的危害時(shí)，不會(huì)完全處于被動(dòng)地位，許多植物已進(jìn)化出有效自衛(wèi)的植物次生物質(zhì)，來抵御害蟲的危害[2]．而植食性害蟲通過增強(qiáng)解毒酶含量或提高解毒酶的活性，來抵抗這種次生物質(zhì)以保證正常生命活動(dòng)，如野番茄依賴高濃度的2-十三烷酮（2-TD）來抵抗棉鈴蟲、棉蚜等害蟲的取食[2,3]．有文獻(xiàn)報(bào)道長(zhǎng)時(shí)間的2-TD脅迫提高了棉鈴蟲對(duì)氨基甲酸酯殺蟲劑耐受性[3]．在害蟲防治措施中，化學(xué)殺蟲劑被長(zhǎng)期且廣泛地使用，加之不合理用藥，導(dǎo)致棉鈴蟲的抗藥性快速形成，且抗性背景復(fù)雜，所以對(duì)棉鈴蟲抗藥性的治理迫在眉睫[4]．由于2-TD能誘導(dǎo)害蟲細(xì)胞色素P450超家族中多個(gè)基因的過量表達(dá)，表現(xiàn)為mRNA或蛋白質(zhì)水平的增加，導(dǎo)致昆蟲對(duì)有毒物質(zhì)代謝能力增強(qiáng)，從而提高昆蟲對(duì)殺蟲劑的耐受力[5]．細(xì)胞色素P450酶系（P450s）是多功能氧化酶，參與對(duì)很多殺蟲劑產(chǎn)生抗性[6]．目前已經(jīng)報(bào)道的昆蟲P450s基因分屬于10個(gè)家族，發(fā)現(xiàn)CYP6家族與昆蟲的抗藥性密切相關(guān)[7]．實(shí)驗(yàn)研究表明，果蠅（Drosophila melanogaster）P450 CYP6G1和CYP6G2基因的過量表達(dá)導(dǎo)致了其對(duì)DDT、烯啶蟲胺、環(huán)蟲腈的抗性[8]．而棉鈴蟲體內(nèi)的P450CYP6B6基因在苯巴比妥的誘導(dǎo)下，有受轉(zhuǎn)錄調(diào)控的可能[8]．棉鈴蟲CYP6B7、CYP6B6、家蠅（Musca domestica L.）CYP6D1等基因的啟動(dòng)子區(qū)存在一些響應(yīng)元件，可以調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，以應(yīng)對(duì)外界的脅迫[8,9]．

本文基于酵母單雜交篩選出響應(yīng)2-十三烷酮（2-TD）的P450 CYP6B6啟動(dòng)子的候選調(diào)控因子-乙醇脫氫酶ADH5[2,10]．花椒毒素會(huì)誘導(dǎo)黑尾鳳蝶（Palio polyxene）的P450 CYP6B1、CYP6B3過表達(dá)，而在果蠅中參與Adh基因表達(dá)的元件和參與CYP6B1、CYP6B3過表達(dá)的元件有位置及序列上的相似性，因此Adh基因表達(dá)的元件如GATA被認(rèn)為可能參與CYP6B1、CYP6B3過表達(dá)，并且也可能存在蛻皮激素反應(yīng)元件和生長(zhǎng)發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子的類似物參與該類P450s的過表達(dá)[10]．文獻(xiàn)[11]指出在果蠅中ADH作為一種轉(zhuǎn)錄因子的輔因子參與脂肪體的合成，說明ADH在昆蟲體內(nèi)可能會(huì)參與某些代謝通路．ADH5雖然不是典型的轉(zhuǎn)錄因子，但是ADH5定位于細(xì)胞核并且具有核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域，實(shí)驗(yàn)表明HaADH5能與CYP6B6響應(yīng)2-TD的核心啟動(dòng)子區(qū)HE1結(jié)合[2]．因此HaADH5可能響應(yīng)2-TD參與CYP6B6的表達(dá)．

為進(jìn)一步闡明HaADH5在棉鈴蟲中的作用，本研究同源克隆了棉鈴蟲乙醇脫氫酶（HaADH5）基因，進(jìn)行原核表達(dá)和分析融合蛋白的酶活特性，免疫小鼠制備His-HaADH5的抗血清，并用酶聯(lián)免疫吸附（EILSA）實(shí)驗(yàn)測(cè)定該抗血清中抗體的效價(jià)，同時(shí)檢測(cè)此抗血清的免疫特異性，并且應(yīng)用此抗血清探索HaADH5在棉鈴蟲不同組織的表達(dá)量．此結(jié)果為后續(xù)深入研究在2-TD脅迫下HaADH5對(duì)CYP6B6的調(diào)控表達(dá)奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

本研究中昆明白小鼠購(gòu)自新疆烏魯木齊市新市區(qū)鯉魚山路新疆醫(yī)科大學(xué)北校區(qū)．pET32a質(zhì)粒為實(shí)驗(yàn)室保存；蛋白Marker購(gòu)自Thermo Fisher Scientif ic公司；小鼠抗His-tag多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體和大腸桿菌Transetta菌株感受態(tài)細(xì)胞等購(gòu)自北京全式金公司；DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司；ELISA板購(gòu)自廣州潔特生物過濾制品有限公司．

1.2 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、鑒定及純化

將鑒定正確的p ET32a-HaADH5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Transetta菌株的感受態(tài)細(xì)胞中，菌液PCR鑒定正確后，將陽(yáng)性克隆37℃過夜培養(yǎng)，次日以1∶100的比例接種于新鮮的LB液體培養(yǎng)基（含有50 mg/L的Amp）．將菌液在37℃、220 r/min的搖床內(nèi)培養(yǎng)（約4小時(shí)）至OD600為0.4～0.6，再加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG培養(yǎng)6 h后離心收集菌體，并用p H 8.0的PBS重懸菌體，超聲破碎后離心獲得上清（可溶性蛋白）和沉淀（包涵體蛋白），誘導(dǎo)前、后的菌體和上清沉淀用SDS-PAGE電泳分離再轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)膜成功后用封閉液（5%的脫脂奶粉）于4℃封閉過夜，加入鼠抗His-tag多克隆抗體為一抗（按照1∶3 000稀釋一抗后使用），在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育2 h，用洗滌緩沖液PBST在水平搖床上洗膜5次，每次10 min．辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠IgG作為二抗（按照1∶5 000稀釋二抗后使用），在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，用PBST充分洗滌5次后按照使用說明用DAB顯色鑒定．

將鑒定正確的重組菌接種于含Amp的LB培養(yǎng)基中，于37°C、220 r/min的搖床內(nèi)培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG作為誘導(dǎo)劑，在22℃、220 r/min的搖床內(nèi)培養(yǎng)6 h．將誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌液離心收集菌體重懸于PBS中并超聲破碎，離心后獲得的可溶性蛋白溶液與Ni-NTA柱子于4℃結(jié)合3 h，然后用低濃度咪唑（10 mmol/L洗2次、20 mmol/L洗2次）洗脫除去大量雜蛋白；再以50 mmol/L，100 mmol/L去除殘留的雜蛋白，最終以200 mmol/L咪唑洗脫目的蛋白，分部收集洗脫液，電泳檢測(cè)洗脫液．將超濾后得到的目的蛋白用Bradford蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白含量，立即用2 mL的EP管分裝并凍存于-80℃冰箱中備用．

1.3 乙醇脫氫酶的酶活測(cè)定

通過酶活定義：一個(gè)乙醇脫氫酶的酶活相當(dāng)于25℃條件下1 min氧化NAD+生成1μmoL NADH所需的酶量．本文對(duì)常開霞等人測(cè)定乙醇脫氫酶活性的方法進(jìn)行了一些完善和修改[12-14]．在融合蛋白His-HaADH5酶活測(cè)定反應(yīng)體系中含有100 mmol/L Tris-HCl緩沖液（p H 8.3），5.0 mmol/L NAD+，50μL融合蛋白，100 mmol/L底物和總體積為1.0 mL的0.05 mmol/L ZnSO4．在酶活測(cè)定試驗(yàn)中用甲醛、乙醇、丙三醇、正丁醇、異戊醇作為底物研究溫度和p H對(duì)His-HaADH5活性影響．根據(jù)上述反應(yīng)體系在15°C～75°C條件下研究不同溫度對(duì)His-HaADH5的活性影響．使用100 mmol/L乙酸鈉（p H 4.0～6.0），Tris-HCl緩沖液（p H 7.0～8.0）和甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（p H 9.0～13.0）在25℃條件下按照上述反應(yīng)體系測(cè)量不同p H對(duì)His-HaADH5活性的影響．

1.4 鼠抗His-HaADH5多克隆抗體的制備

將昆明白小鼠在本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)一周后，眼眶靜脈采血得到的血清作為陰性對(duì)照，次日開始第一次免疫，用0.2 mol/L咪唑洗脫目的蛋白作為抗原蛋白與等體積完全弗氏佐劑（僅第1次免疫用）超聲混合，鑒定超聲乳化后，用足墊和肌肉注射法免疫小鼠，一只小鼠用50μg抗原蛋白并且注射總體積不超過150μL．在間隔14 d后第2次、3次免疫使用不完全弗氏佐劑與抗原蛋白充分乳化，第2次、3次免疫時(shí)間間隔均14 d．完成第3次免疫后精心照顧小鼠并在第10 d開始采血，眼眶靜脈采血法可以連續(xù)采血，血樣37℃放置0.5 h，4℃放置0.5 h，3 500 r/min離心20 min，所得血清即為抗血清，于-80℃冰箱保存．

1.5 ELISA檢測(cè)鼠抗His-HaADH5抗體效價(jià)

以每孔1μg的His-HaADH5融合蛋白包被ELISA板于4℃過夜，次日在37℃恒溫培養(yǎng)箱中用5%的脫脂奶粉封閉2 h后，用PBST緩沖液洗滌3次后加入不同稀釋比例的小鼠血清作為一抗，以免疫前的血清做對(duì)照，稀釋后的血清體積為150μL/孔，于37℃孵育1 h再洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG作為二抗（按照1∶3 000稀釋二抗使用后使用），在37℃下孵育1 h．PBST洗滌3次，加TMB底物顯色液在室溫下孵育5 min后，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育5 min，加入2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)A450，免疫前血清和免疫后血清的A450值分別為N和P，以P/N＞2.1判斷為陽(yáng)性．

1.6 Western blot檢測(cè)His-HaADH5抗血清的特異性

融合蛋白His-HaADH5經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉作為封閉液4℃過夜，次日用效價(jià)檢測(cè)為陽(yáng)性的小鼠抗血清作為一抗（按照1∶3 000稀釋一抗后使用）于37℃孵育2 h后洗滌3次，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗（按照1∶5 000稀釋二抗后使用）于37℃孵育1 h，充分洗滌后用DAB（中杉金橋公司）顯色．提取棉鈴蟲、黃粉蟲全蟲的天然總蛋白，以及棉鈴蟲的體壁、脂肪體、中腸各個(gè)組織部位天然總蛋白．將黃粉蟲、棉鈴蟲全蟲以及棉鈴蟲的體壁、脂肪體、中腸各個(gè)組織部位用液氮研磨至粉末狀后加入適量的蛋白酶抑制劑，充分混勻后，在冰上靜置15 min后低溫離心10 min（4℃，10 000 r/min），將離心后獲得的上清通過12%SDS-PAGE電泳檢測(cè)．檢測(cè)結(jié)果正確后用Western blot檢測(cè)鼠抗His-HaADH5抗血清的特異性．不同組織天然總蛋白（45μg）經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，室溫封閉2 h，以鼠抗HaADH5抗血清為一抗（按照1∶1 000稀釋一抗后使用），室溫孵育2 h，洗滌，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG作為二抗（按照1∶5 000稀釋二抗后使用）于室溫孵育1 h，充分洗滌后用DAB（中杉金橋公司）顯色．

2 結(jié)果與分析

2.1 棉鈴蟲乙醇脫氫酶融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及活性測(cè)定

重組質(zhì)粒p ET32a-HaADH 5轉(zhuǎn)化大腸桿菌Transetta菌株的感受態(tài)，鑒定得到陽(yáng)性克隆，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后、在45.0 kDa至66.2 kDa之間有一條帶表達(dá)量增加，這與His-HaADH5融合蛋白的理論大?。?6.67 kDa）相符合（圖1A）．Western blot結(jié)果也顯示56.00 kDa處有一條明顯的雜交帶出現(xiàn)（圖1B），表明融合蛋白在宿主菌中穩(wěn)定表達(dá)．可溶性分析發(fā)現(xiàn)其存在于上清和沉淀中．離心收集菌體重懸于PBS中并超聲破碎，收集上清與Ni-NTA柱子于4°C結(jié)合3 h，然后用低濃度咪唑（10 mmol/L洗2次、20 mmol/L洗2次）洗脫除去雜蛋白；再以200 mmol/L咪唑洗脫目的蛋白，分部收集洗脫液（洗脫2次），電泳檢測(cè)洗脫液（圖2）．

圖1 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及Western blot驗(yàn)證Fig 1 Expression and Western blot verif ication of fusion protein（A）：SDS電泳；M：蛋白Marker；1～4：未經(jīng)誘導(dǎo)的Transetta菌體、經(jīng)誘導(dǎo)的Transetta菌體、經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的融合蛋白上清、經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的融合蛋白沉淀；（B）：Western blot:1：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的融合蛋白.

圖2 融合蛋白的純化Fig 2 Purif ication of fusion proteinM：蛋白Marker；1：未結(jié)合組分；2：10 mmol/L咪唑第1次；3：10 mmol/L咪唑第2次；4：20 mmol/L咪唑第1次；5：20 mmol/L咪唑第2次；6：50 mmol/L咪唑；7：100 mmol/L咪唑；8：200 mmol/L咪唑．

用融合蛋白His-HaADH5和輔因子NAD+進(jìn)行酶活測(cè)定，分別以甲醛、乙醇、丙三醇、正丁醇、異戊醇為底物．結(jié)果表明融合蛋白可以催化這五種反應(yīng)，其中異戊醇的活性顯著高于其他底物（圖3A）．不同溫度和p H值對(duì)融合蛋白的活性有明顯影響．在15℃、異戊醇底物的條件下，隨著外界溫度的升高，融合蛋白的活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，其中在35℃時(shí)達(dá)到最大值（圖3B）．在從6到13的寬p H范圍內(nèi)，融合蛋白對(duì)異戊醇作為底物的活性隨p H的升高而增加，而在p H=10時(shí)，活性逐漸下降．融合蛋白的最佳p H為10（圖3C）．

圖3 重組蛋白His-HaADH5的酶學(xué)性質(zhì)Fig 3 Enzyme characterization of recombinant protein His-HaADH5

2.2 ELISA檢測(cè)鼠抗His-HaADH5多克隆抗體效價(jià)

融合蛋白His-HaADH5免疫小鼠3次后，ELISA測(cè)定抗血清的效價(jià)．從圖4中可以看到當(dāng)陽(yáng)性血清稀釋409 600倍時(shí)樣本吸收值大于陰性樣本吸收值的2.1倍，即抗血清的效價(jià)大于409 600，說明抗血清滴度達(dá)到預(yù)期要求并可用于后續(xù)試驗(yàn)．

2.3 Western blot檢測(cè)His-HaADH5抗血清的特異性及應(yīng)用

用制備的抗His-HaADH5血清對(duì)純化的融合蛋白、棉鈴蟲和黃粉蟲的天然總蛋白做Western blot，結(jié)果顯示，融合蛋白能被鼠抗HaADH5多克隆抗體識(shí)別，并在預(yù)期條帶大小處有特異性結(jié)合條帶（圖5），該多克隆抗體也識(shí)別棉鈴蟲總蛋白中的HaADH5，但是不識(shí)別黃粉蟲總蛋白，說明制備的His-HaADH5多克隆抗體具有較好的特異性，并用此抗體檢測(cè)了棉鈴蟲不同組織的天然總蛋白，結(jié)果表明在中腸、脂肪體和體壁中均能檢測(cè)到，條帶大小與理論大小（36 kDa）相符合，且在棉鈴蟲脂肪體中條帶顏色更深（圖6C），說明HaADH5主要存在于脂肪體中．

圖4 ELISA測(cè)定His-HaADH5抗血清效價(jià)Fig 4 ELISA assay the titer of His-HaADH5 antiserum

圖5 Western blot檢測(cè)His-HaADH5多克隆抗體免疫學(xué)活性Fig 5 Western blot detect immunological activity of His-HaADH5 polyclonal antibody（A）M：蛋白Maker；1：黃粉蟲天然總蛋白的Western印記雜；2：棉鈴蟲天然總蛋白；（B）M：蛋白Marker；3：融合蛋白；4：棉鈴蟲天然總蛋白．

圖6 His-HaADH5多克隆抗血清的應(yīng)用Fig 6 Application of anti-His-HaADH5 poly clonal antibody（A）棉鈴蟲不同組織天然總蛋白的SDS-PAGE電泳；M：蛋白Marker；1：體壁；2：脂肪體；3：中腸；（B）多克隆抗體與融合蛋白His-HaADH5的特異性結(jié)合檢測(cè)；M：蛋白Marker；4：His-HaADH5融合蛋白；（C）多克隆抗體與棉鈴蟲不同組織天然總蛋白的特異性結(jié)合檢測(cè)；M：蛋白Marker；5：體壁；6：脂肪體；7：中腸.

3 討論

昆蟲P450s的表達(dá)受順式調(diào)控元件、反式作用因子或順式作用元件和反式因子的共同調(diào)控，調(diào)控可能涉及轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄機(jī)制[8,15]．P450超家族中，CYP6家族被認(rèn)為與抗藥性密切相關(guān)，P450 CYP6B6基因的表達(dá)與2-TD的代謝具有密切聯(lián)系[5,16]．前期研究表明2-TD會(huì)誘導(dǎo)棉鈴蟲P450 CYP6B6的過量表達(dá)，同時(shí)獲得CYP6B6響應(yīng)2-TD的核心元件，繼而基于酵母單雜交技術(shù)通過核心元件篩選出調(diào)控因子-HaADH5[2]．有文獻(xiàn)報(bào)道，在花椒毒素的處理下，黑色鳳尾蝶P450s的過表達(dá)受到參與Adh基因表達(dá)的GATA元件的調(diào)控，在果蠅幼蟲Adh啟動(dòng)子中，GATA元件的功能獨(dú)立于其他元件，在胚胎和脂肪體的形成過程中有轉(zhuǎn)錄激活的功能[10]．在果蠅幼蟲中，ADH作為轉(zhuǎn)錄因子的輔因子參與脂肪體的形成[11]，Hataichanoke等人認(rèn)為至少有一種蛋白質(zhì)代謝的底物和響應(yīng)外界毒素的P450s會(huì)通過調(diào)控級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使宿主適應(yīng)呋喃香豆素的存在[11]．所以昆蟲體內(nèi)的ADH可能參與P450s的代謝通路，但這仍然需要進(jìn)一步的研究．前期的凝膠阻滯和酵母單雜交的轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)表明，HaADH5與CYP6B6響應(yīng)2-TD的核心片段HE1結(jié)合，而棉鈴蟲中另一個(gè)已發(fā)表的ADH（GenBank登錄號(hào)：AKD01727.1）卻不能與HE1結(jié)合[2,17]．因此說明本文中的HaADH5可能參與CYP6B6的調(diào)控表達(dá)，但是具體的代謝通路和信號(hào)途徑尚不明確．

為進(jìn)一步深入探討HaADH5的功能，本文對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究．ADH5是一個(gè)含鋅的二聚體酶，需要一種隨底物而異的輔酶（NAD+），主要代謝長(zhǎng)鏈醇類[17,18]．在動(dòng)物體內(nèi)ADH5參與亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的代謝，并能在此過程中使醛類減少[19]．在人體內(nèi)ADH5可以消除甲醛，對(duì)人的免疫調(diào)控、神經(jīng)元發(fā)育和癌癥的發(fā)生都有影響[18]．在棉鈴蟲體內(nèi)ADH5參與棉鈴蟲的蛻皮和變態(tài)發(fā)育過程[16]．本實(shí)驗(yàn)以甲醛、短鏈醇類和異戊醇（3-甲基丁醇）為底物，發(fā)現(xiàn)His-HaADH5對(duì)異戊醇的親和力高于甲醛和短鏈醇類，說明His-HaADH5主要功能不是代謝甲醛和短鏈醇類．有文獻(xiàn)報(bào)道，重組菌表達(dá)的ADH最適溫度是25℃或者35℃，當(dāng)p H=10時(shí)，ADH5活性可以達(dá)到500至700 U/mg[13,14]．我們以異戊醇為底物，發(fā)現(xiàn)His-HaADH5在p H=10，溫度為35℃時(shí)其活性最高，可達(dá)到1 333 U/mg．鱗翅目昆蟲的幼蟲特性之一就是中腸偏堿性[20]，His-HaADH5的最適pH=10，這能更好解釋棉鈴蟲的中腸和脂肪體中存在HaADH5．實(shí)驗(yàn)表明，His-HaADH5具有廣泛的底物特異性，可以催化包括異戊醇在內(nèi)的五種底物的氧化，此外，His-HaADH5對(duì)異戊醇表現(xiàn)出明顯的活性，異戊醇相對(duì)于其他四種底物而言屬于長(zhǎng)鏈醇．據(jù)報(bào)道，ADH5普遍存在于各組織中，可以使多種底物氧化，ADH5的主要底物是長(zhǎng)鏈醇[21,22]．因此本實(shí)驗(yàn)為ADH5的研究提供了一個(gè)新的參考依據(jù)，同時(shí)也為棉鈴蟲中HaADH5的功能研究奠定了基礎(chǔ)．

制備抗體是研究基因功能的方法之一，昆蟲乙醇脫氫酶的研究不常見，所以利用昆蟲乙醇脫氫酶制備抗體的研究很少．本研究在原核表達(dá)體系中表達(dá)HaADH5，利用6×His純化獲得了單一的融合蛋白，免疫小鼠．繼而用蛋白免疫法制備了HaADH5的抗血清，酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)該抗體的效價(jià)為1∶409 600，該抗血清的滴度達(dá)到預(yù)期要求，可應(yīng)用于基于抗體識(shí)別的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，例如超凝膠阻滯（Super-EMSA）、免疫組化、染色質(zhì)免疫共沉淀（CHIP）等．Western blot結(jié)果表明制備的HaADH5抗血清既能與融合蛋白His-HaADH5結(jié)合，也能與棉鈴蟲體內(nèi)的天然蛋白HaADH5結(jié)合，與黃粉蟲（Tenebrio molitor）體內(nèi)的天然蛋白沒有結(jié)合作用，說明制備的HaADH5抗血清有較好的免疫特異性．HaADH5抗血清在棉鈴蟲體壁、脂肪體和中腸的Western blot結(jié)果顯示，HaADH5主要在脂肪體和中腸中存在，而在體壁中少量存在．而脂肪體被認(rèn)為是昆蟲的代謝組織，橘小實(shí)蠅（Bactrocera dorsalis）在溴氰菊酯的脅迫下，其脂肪體中的解毒代謝酶系的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組[23]．以上結(jié)果表明在脂肪體和中腸中，HaADH5可能會(huì)參與棉鈴蟲的解毒過程．本文為HaADH5在蛋白水平上的功能研究奠定基礎(chǔ)，為后期對(duì)HaADH5蛋白水平的鑒定提供了重要的檢測(cè)工具．

在本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)HaADH5進(jìn)行原核表達(dá)、純化，分析了在不同底物、不同p H、不同溫度下的酶活，并成功制備了HaADH5的抗血清，Western blot不僅驗(yàn)證了抗原HaADH5的免疫活性，也證明了HaADH5主要在棉鈴蟲脂肪體中存在．以上結(jié)果為今后深入研究2-十三烷酮脅迫下棉鈴蟲HaADH5對(duì)細(xì)胞色素P450 CYP6B6的調(diào)控表達(dá)奠定基礎(chǔ)．