神經(jīng)干細胞移植用于腦梗死的神經(jīng)保護和再生治療的研究進展

沈友進 戚曉昆 周宗華 何建文

1.廣東省肇慶市德慶縣人民醫(yī)院神經(jīng)內科，廣東肇慶 526600；2.中國人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學中心神經(jīng)內科，北京 100048

腦卒中是一種古老的人類疾病，它嚴重影響了人們的生活[1]。腦卒中是導致人類長期殘疾的主要原因，也是全球第二大死亡原因[2]。腦梗死是腦卒中的最主要類型。目前被循證醫(yī)學證實有效的腦梗死急性期治療方法只有靜脈溶栓和機械取栓。然而，這兩種方法只能用于急性期少數(shù)患者的治療，且有時間窗限制。為了增加時間窗、減少副作用及提高預后，迫切需要尋找新的治療腦梗死的方法。由于其具有神經(jīng)保護、分泌生長因子及替代受損的神經(jīng)細胞等多重治療功能，神經(jīng)干細胞移植治療引起了人們極大的興趣[2]。神經(jīng)干細胞是神經(jīng)系統(tǒng)中最原始未分化的細胞，可以產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中特異性的細胞。在一定的條件下，神經(jīng)干細胞可以分化為神經(jīng)元、星形膠質細胞和少突膠質細胞等，它具有自我更新能力。與傳統(tǒng)藥物治療不同，神經(jīng)干細胞可以對環(huán)境變化作出持續(xù)反應，分泌適當數(shù)量和類型的信號分子，故可以對不同的腦損傷作出相應的反應[3]。大量的動物實驗及臨床前試驗均顯示神經(jīng)干細胞在腦梗死的治療中具有巨大的潛力。因此，本文從神經(jīng)干細胞來源、治療腦梗死的機制、目前存在的問題等新進展方面進行綜述。

1 神經(jīng)干細胞來源

目前神經(jīng)干細胞主要來源于胎兒腦組織、胚胎干細胞和誘導多能干細胞。自從Thomson 于1998 年從人類囊胚中建立了胚胎干細胞系以來，很多機構也陸續(xù)從人類、鼠類和其他靈長類的胚胎中成功分離、培養(yǎng)并建立了胚胎來源的可長期繁殖的神經(jīng)干細胞系[2]。胚胎干細胞來源于囊胚的內部細胞群，可以產(chǎn)生能分化為任何體細胞類型的前體細胞。理論上，胚胎干細胞可以無限增殖，因而人們可以獲得大量的神經(jīng)干細胞來滿足臨床干細胞移植治療的需要，這是比胎兒來源的神經(jīng)干細胞更有優(yōu)勢的地方。但是，需要大量的操作才能使胚胎干細胞完全分化為神經(jīng)干細胞。

胎兒來源的神經(jīng)干細胞是進行神經(jīng)干細胞移植治療腦梗死的一種重要來源。胚胎來源的神經(jīng)干細胞從受孕后7 至21 d 胎兒的腦皮質、中腦、脊髓組織中分離產(chǎn)生[4]。這些神經(jīng)干細胞可以通過在含有堿性成纖維生長因子和表皮生長因子的無血清培養(yǎng)基中生長傳代[5]。

最近發(fā)現(xiàn)，通過轉錄因子的過表達，成年體細胞能夠被重新編程逆分化為多能干細胞[6]。同胚胎干細胞類似，這些逆分化的多能干細胞具有可塑性和神經(jīng)分化潛能[7]，被稱作誘導多能干細胞。而相應的神經(jīng)干細胞被稱為誘導多能干細胞來源的神經(jīng)干細胞。許多體細胞類型（包括容易從活組織檢查中獲得的成纖維細胞）都已經(jīng)被重編程為誘導多能干細胞。因而，由于能夠直接從患者自身的體細胞中獲得，避免同種異體移植相關的免疫排斥風險，誘導多能干細胞來源的神經(jīng)干細胞具有治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的巨大潛力。

2 神經(jīng)干細胞的作用機制

神經(jīng)干細胞移植可以通過多種機制治療腦梗死。神經(jīng)干細胞能夠保護受損的神經(jīng)細胞，促進內源性神經(jīng)干細胞增殖與遷移，促進突觸重塑，刺激新生血管形成，以及整合到主神經(jīng)回路（同提高認知和感覺運動功能有關），從而恢復受損的神經(jīng)功能，達到治療腦梗死的目的[8]。然而，究竟是哪一種機制在有效恢復神經(jīng)功能中起主要作用尚需進一步研究。

2.1 免疫調節(jié)

腦卒中后腦損傷是通過激活小神經(jīng)膠質細胞產(chǎn)生強烈的免疫和炎癥反應來傳播的。激活的小神經(jīng)膠質細胞釋放細胞因子，上調內皮細胞上的單核細胞趨化蛋白-1 及細胞因子配體-1 等細胞因子的表達，通過血腦屏障促進外周單核細胞及巨噬細胞的浸潤，從而加劇炎癥損傷[9]。腦梗死患者進行神經(jīng)干細胞移植，可以抑制炎癥級聯(lián)反應，提高患者的治療效果[10]。新近研究表明，促炎因子S100A9 有助于克服急性炎癥反應，提高神經(jīng)干細胞移植治療的效果[11]。

2.2 神經(jīng)可塑性與神經(jīng)重構

多年以來，人們認為成年腦細胞無再生潛能，腦損傷或患病后損傷的神經(jīng)元不能再生。然而，近年來人們在成年哺乳動物腦內室管膜下區(qū)和海馬齒狀回發(fā)現(xiàn)有內源性神經(jīng)干細胞存在[12]。腦卒中后室管膜下區(qū)和海馬齒狀回的神經(jīng)發(fā)生明顯增加，但這些再生的神經(jīng)細胞仍然較少，不足以恢復損傷的神經(jīng)組織功能。雖然有證據(jù)表明這些新生的神經(jīng)細胞可以整合進內源神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮功能，但是大約80%的新生神經(jīng)母細胞和神經(jīng)元在形成后2 周內死亡[13]。因而，增強內源性神經(jīng)發(fā)生以代替丟失的神經(jīng)細胞一直是腦卒中治療的一個令人興奮的治療靶點[14]。

腦卒中后1 個月內患者表現(xiàn)出肢體功能、語言和認知功能方面不同程度的自發(fā)恢復。這種現(xiàn)象在很大程度上歸因于神經(jīng)回路的重新建立，在遠離腦梗死區(qū)的其他腦區(qū)運動和感覺回路的活動得到增強。這種神經(jīng)重構通過改變軸突、樹突和突觸的結構以及增強內源性神經(jīng)干細胞的活性來調節(jié)。一些臨床前動物模型已經(jīng)證明，腦卒中后神經(jīng)干細胞移植可以增強突觸重構[15]。一項研究中，小鼠神經(jīng)干細胞系移植到腦實質后，腦卒中患者腦中的突觸發(fā)生標志物突觸素和突觸生長錐蛋白GAP-43 表達增加，其中部分是由移植細胞本身所表達的[16]。

神經(jīng)干細胞移植促進血管生成，幫助腦卒中患者恢復功能。腦卒中后，局部內皮細胞和內源性神經(jīng)干細胞之間的神經(jīng)營養(yǎng)及再生因子進行交換，刺激血管生成。神經(jīng)和血管部分進行交互反應，促進臨床前期腦卒中模型和人類卒中患者的血管生成，改善腦卒中患者的神經(jīng)功能[17]。總之，神經(jīng)干細胞移植治療腦梗死引起新血管形成，這是腦梗死后神經(jīng)干細胞移植介導神經(jīng)組織和功能恢復的一個主要機制。

2.3 神經(jīng)細胞替代

通過腦梗死后神經(jīng)干細胞移植，以健康個體腦中的神經(jīng)細胞代替損傷壞死的神經(jīng)細胞，是一個非常有吸引力的治療方法。干細胞移植后，健康的神經(jīng)干細胞植入受損區(qū)，分化成神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質細胞，重新建立突觸聯(lián)系[18]。研究證明，腦梗死損傷后腦中移植的神經(jīng)干細胞最終分化為神經(jīng)元，這些神經(jīng)元表達NeuN、HuD、MAP-2 及β3 微管蛋白等神經(jīng)元標志物[19-21]。然而，神經(jīng)干細胞植入受損神經(jīng)組織后，整合進內源性神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細胞少、壽命短，需要反復多次移植，都是目前需要解決的問題。

3 存在的問題

目前，在神經(jīng)干細胞移植被廣泛應用于臨床腦卒中治療之前，仍有許多問題需要解決。在腦卒中環(huán)境中，血腦屏障受到損害，其通透性發(fā)生動態(tài)變化，導致全身免疫細胞的浸潤。這就提出了腦卒中異體神經(jīng)干細胞移植的免疫系統(tǒng)反應的問題。為克服免疫反應，同種誘導多能干細胞來源的神經(jīng)干細胞更具有潛在優(yōu)勢。然而，如果需要大量的神經(jīng)干細胞進行移植治療，使用目前的技術生產(chǎn)誘導多能干細胞來源的神經(jīng)干細胞，并進行安全測試，需要大量的時間。而這很可能超過了疾病治療最佳效果的時間窗。目前還不清楚其他因素如卒中類型、卒中部位及嚴重性對神經(jīng)干細胞移植成功的影響程度。另外，腦卒中患者常見的共患?。ū热缣悄虿『透哐獕翰〉龋⒛挲g及性別因素對神經(jīng)干細胞移植治療腦卒中的影響尚沒有或僅有有限的評估[22-23]。

盡管許多腦卒中神經(jīng)干細胞移植治療的臨床前期研究取得了良好的效果，一些安全問題也必須得到妥善處理。一項研究中，研究者在小鼠大腦中動脈閉塞后24 h 將誘導多能干細胞移植到同側紋狀體，發(fā)現(xiàn)了移植細胞的腫瘤發(fā)生[24]。

為了使臨床前期神經(jīng)干細胞移植治療腦卒中的成功進一步轉化為臨床試驗，必需對移植途徑、移植劑量和治療時間窗等臨床因素進行評價。

3.1 移植途徑

神經(jīng)干細胞移植治療腦梗死有多種移植方式，如立體定向直接移植到腦實質、經(jīng)穿刺移植到腦室或椎管中、經(jīng)鼻腔途徑，以及經(jīng)靜脈或動脈途徑輸入等。目前以立體定向經(jīng)腦實質移植和經(jīng)靜脈途徑移植最常見。在臨床前期腦卒中動物模型中，立體定向經(jīng)腦實質多點注射是最常用的移植方式。它有很多優(yōu)點，如注射位點特異、直接移植的神經(jīng)干細胞不通過血腦屏障，可以保證大量的神經(jīng)干細胞到達損傷部位，限制治療目標外的潛在影響（例如阻塞非靶器官的微血管導致缺血事件）。其最大障礙是需要高度侵襲性的顱骨切除術，這可能導致已經(jīng)嚴重損傷的腦卒中患者出現(xiàn)額外的并發(fā)癥。然而，另外兩個臨床試驗測試了神經(jīng)干細胞和成人干細胞經(jīng)腦實質移植的安全性及有效性。結果表明，這種移植方式不良反應少，一般是安全的，患者耐受性好，值得進一步臨床研究[3,25]。

另一種常用移植方式是經(jīng)靜脈途徑輸入。這種方式一般侵襲性小，不需較高的技術要求。在腦卒中急性期，患者病情尚不穩(wěn)定而不能進行經(jīng)腦實質神經(jīng)干細胞移植治療，這時經(jīng)靜脈輸入神經(jīng)干細胞治療就成為可能。因此，醫(yī)務人員可以在急救車去醫(yī)院的路上給予神經(jīng)干細胞靜脈輸入治療。在一些神經(jīng)外科技術欠發(fā)達的偏遠農(nóng)村地區(qū)也可以采用這種方式治療。然而，經(jīng)靜脈輸入移植由于細胞在非靶器官（如肺部和肝臟等）中聚集的傾向，導致腦中的移植細胞非常少[26]。靜脈輸入神經(jīng)干細胞可以起到神經(jīng)保護作用，提高神經(jīng)功能，但沒有腦卒中患者腦中移植細胞存活的依據(jù)。這表明抗炎和再生營養(yǎng)因子的釋放是經(jīng)靜脈輸入干細胞移植治療策略的主要機制[27]。

經(jīng)鼻腔移植是另外一種極具潛力的神經(jīng)干細胞移植治療腦卒中的方法[28]。經(jīng)鼻腔移植操作相對簡單，對患者損傷較小，神經(jīng)干細胞可以繞過血腦屏障，極大地提高了進入腦內的神經(jīng)干細胞數(shù)量。

神經(jīng)干細胞移植的其他方式，如經(jīng)穿刺移植到腦室或椎管中、經(jīng)動脈途徑輸入等，目前使用相對較少，有些還處在探索階段?？傊?，發(fā)展有效的、可應用于臨床的腦卒中后神經(jīng)干細胞治療方式必須考慮到安全問題和臨床療效等問題。

3.2 治療時間窗和劑量

在嚙齒類動物模型中，人們對廣泛的神經(jīng)干細胞治療時間窗進行了評估，時間窗范圍從再灌注后立即移植至腦卒中后4 周。在這些臨床前期研究中，治療時間窗通常由預期的治療作用模式?jīng)Q定。如果主要目的是最大化移植的神經(jīng)干細胞的神經(jīng)保護和免疫調節(jié)作用，移植常常選擇在腦卒中急性期進行，這時腦梗死尚未完全形成，組織尚可以被挽救[29]。一項在慢性腦卒中患者中進行成人干細胞移植的臨床試驗中，這些慢性腦卒中患者在移植前神經(jīng)功能評分穩(wěn)定，移植后，通過成人干細胞介導的神經(jīng)保護和再生機制，其平均評分顯著改善[25]。這表明，腦卒中幾個月后，神經(jīng)組織重構仍可能處于活躍狀態(tài)，干細胞治療可以通過營養(yǎng)因子信號加強組織重構。相反，為達到細胞替代的目的，把細胞毒性較弱的亞急性期至慢性期作為時間點或許對干細胞移植更有利，可以提高移植細胞的長期存活率[30]。另一個值得臨床進一步研究的技術考慮是最佳的神經(jīng)干細胞移植劑量。在嚙齒類動物研究中，腦實質移植的細胞劑量范圍是1.0×105個至4.5×105個細胞，移植1 至3 個位點；靜脈輸入移植的細胞劑量范圍是3.0×106個至4.0×106個細胞，一次性輸入。沒有證據(jù)表明移植方案之間存在結果差異。同時研究表明，移植更多的神經(jīng)干細胞不會導致腦中出現(xiàn)更多的移植細胞，也不會增加神經(jīng)細胞分化[30]。

3.3 局部微環(huán)境的影響

局部微環(huán)境在干細胞移植治療腦梗死中起著非常關鍵的作用。為了研究腦梗死亞急性及慢性期干細胞移植后的微環(huán)境變化，研究人員將誘導多能干細胞及神經(jīng)干細胞通過介入方式從大腦中動脈移植到腦梗死部位。干細胞移植后糖代謝明顯升高，且神經(jīng)功能評分明顯提高。蛋白組學分析顯示，共有39 個在亞急性和慢性期差異表達的蛋白質。這些蛋白質參與了包括神經(jīng)元存活、軸突重塑、抗氧化應激和線粒體功能恢復等各種缺血性卒中相關的生物學過程[31]。一項研究中，研究人員通過局部低溫的方式提供一種微環(huán)境來研究對干細胞的影響。結果表明，治療性低溫上調了Micro 1 蛋白的表達，增強了缺血性卒中干細胞移植后的神經(jīng)保護作用[32]。近年來，人們發(fā)現(xiàn)輸注干細胞分泌的胞外囊泡（也叫外泌體）是一種很有希望治療腦卒中的方法。胞外囊泡通過細胞通訊、調節(jié)微環(huán)境等方式促進腦神經(jīng)的恢復[33]。雖然人們對腦梗死干細胞移植時局部微環(huán)境的研究較多，但最佳的局部微環(huán)境尚未知。

4 小結

神經(jīng)干細胞移植為腦梗死提供了一種很有前景的治療方法。通過抗炎、促進內源性神經(jīng)形成、促進血管新生、促進突觸重構、細胞替代等作用機制，腦梗死后神經(jīng)干細胞移植發(fā)揮神經(jīng)保護作用，減少繼發(fā)性損傷，繼而促進神經(jīng)組織及功能的恢復。雖然腦梗死后神經(jīng)干細胞移植治療在臨床前期動物實驗中取得了可喜的效果，但仍存在很多問題有待解決。未來我們應從增強腦梗死后神經(jīng)干細胞移植治療的效果、提高治療安全性、減少不良反應、尋找最佳治療時間窗等方面進行進一步研究。