骨髓與脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞治療眼病的研究進(jìn)展

于晨雨，梁榮斌，邵 毅

?KEYWORDS:mesenchymal stem cells; dry eye disease; retinopathy; cornea injury

0引言

針對不同眼疾的現(xiàn)代治療方法的開發(fā)和引入是醫(yī)學(xué)上的一大挑戰(zhàn)。近年來，眼科專家已經(jīng)在干細(xì)胞研究上投入了大量的關(guān)注，因?yàn)槌扇梭w內(nèi)任何組織的更新和再生都依賴于成體干細(xì)胞，眼組織也不例外[1]。干細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖能力，是一種可以分化為不同細(xì)胞類型的自我維持細(xì)胞群。成年人的干細(xì)胞分為造血干細(xì)胞、多能間充質(zhì)干細(xì)胞和組織特異性祖細(xì)胞三大類別。其中，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)有極強(qiáng)的自我更新和多向分化潛能，還具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)性[2]，是最具有潛力的研究對象。MSCs除臍帶來源外，可根據(jù)組織來源分為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow MSC，BMSCs)和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)。兩種MSCs都具有顯著的組織再生潛能——可以分泌信號分子。例如神經(jīng)營養(yǎng)因子、生長因子和細(xì)胞因子，通過旁分泌作用發(fā)揮組織再生與損傷保護(hù)作用[3]。BMSCs可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞以及脂肪細(xì)胞[4]，且在向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化過程中維持動態(tài)平衡。近年來，臨床上大量引入BMSCs和ADSCs進(jìn)行細(xì)胞水平的治療，其在眼病治療及臨床試驗(yàn)上具有無限的價(jià)值與潛力。

1 MSCs的收集和給藥方法

1.1增加MSCs數(shù)量研究和尋找出可替代的且易獲得足夠數(shù)量的干細(xì)胞，對于干細(xì)胞治療，尤其是以細(xì)胞永久性喪失為特征的眼疾有重大的意義。BMSCs在骨髓中含量極低，僅有0.001%～0.01%，并且來源有限，需要進(jìn)行有創(chuàng)方法才能獲取骨髓組織，無疑加重了患者的承受負(fù)擔(dān)。因此，有效提高BMSCs在生物工程中的利用率十分必要。脂肪是近年來研究較為熱門的干細(xì)胞來源，與骨髓相比，脂肪組織能夠通過較小創(chuàng)傷的方法分離并獲得數(shù)目更多的ADSCs[5]。

近年來，用于增加和收集MSCs的方法都有了顯著的進(jìn)步。一項(xiàng)針對小鼠和人的研究表明，運(yùn)動能增加造血干細(xì)胞(HSC)和極小的胚胎樣干細(xì)胞的動員[6]，同時(shí)，這與人們對急性心肌梗死、腦卒中以及其他疾病患者的觀察結(jié)果相似[7]。將干細(xì)胞動員的增加與干細(xì)胞的應(yīng)用聯(lián)系起來，理解這些過程背后的級聯(lián)和機(jī)制并應(yīng)用輔助療法，可能會為將來包括眼科在內(nèi)的所有領(lǐng)域提供改善MSCs治療的方法。目前已經(jīng)提出了改善MSCs治療的其他機(jī)制，包括使用常規(guī)的干細(xì)胞治療評估接近治療部位的輸送，并通過使用宿主細(xì)胞克服免疫排斥，從而克服傳統(tǒng)的移植并發(fā)癥[8]。

1.2 MSCs的給藥BMSCs與ADSCs的治療性給藥可通過多種方式應(yīng)用于眼部，包括局部給藥、結(jié)膜下給藥、腹腔給藥和靜脈給藥。最近一篇關(guān)于小鼠角膜損傷后給藥的論文表明，相比于局部和腹腔給藥，結(jié)膜下和靜脈給藥在上皮完整性、加速組織修復(fù)、減少纖維化、角膜混濁和炎癥等方面顯示出更佳的治療效果[9]。因此，雖然角膜局部給藥更容易獲得，但與其他方法相比，它并不是療效最好的給藥方法。細(xì)胞的活力和功能會在受影響區(qū)域?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞保留然后提供細(xì)胞基質(zhì)，還可能會影響療效。此外，大鼠的纖維蛋白膠內(nèi)給藥、具有MSCs修飾的生物活性3D基質(zhì)增加犬體內(nèi)VEGF165和FGF2的產(chǎn)生等技術(shù)實(shí)驗(yàn)，提供了提高療效的方法[10]。目前大多數(shù)在進(jìn)行的均是動物臨床試驗(yàn)，少有的人體臨床試驗(yàn)還仍處于早期階段，因此，包括不良反應(yīng)在內(nèi)的全部臨床結(jié)果仍尚未確定。MSCs的部分作用可能與一些藥物治療存在著相似性：具有降低炎性因子腫瘤壞死因子-α含量的藥物；改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能,逆轉(zhuǎn)高血糖、高血脂引起的內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷的藥物；抗血小板聚集類藥物；改善微循環(huán)類藥物等,MSCs的突出優(yōu)點(diǎn)是能同時(shí)避免藥物性不良反應(yīng)和副作用[11]。目前普遍認(rèn)為，MSCs治療時(shí)要克服的主要障礙是供體異質(zhì)性、體外擴(kuò)增、免疫原性和冷凍保存幾個(gè)方面的問題[12]。

2 BMSCs與ADSCs對眼部疾病和損傷的治療

2.1治療干眼干眼(dry eye disease，DED)是眼科門診最常見的疾病，其主要特征是淚膜不穩(wěn)定和高滲透的惡性循環(huán)所導(dǎo)致的眼表炎癥、損傷以及眼部異物感。中至重度的DED會伴有明顯的疼痛，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降，甚至產(chǎn)生抑郁等心理問題[13]。DED發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病因繁多，目前認(rèn)為眼局部的炎癥免疫反應(yīng)是引起干眼病理損害的重要機(jī)制，相應(yīng)的抗炎治療是研究的熱點(diǎn)。

當(dāng)炎癥在發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用時(shí)，BMSCs可用于治療包括DED在內(nèi)的許多眼表疾病。在眶內(nèi)注射刀豆蛋白a的干眼綜合征小鼠模型中探究了BMSCs的治療潛力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，眶周注射BMSCs可減少CD4+細(xì)胞浸潤，降低眼眶內(nèi)腺體和眼表面炎性細(xì)胞因子水平。此外，BMSCs刺激了淚液的形成，顯著增加了結(jié)膜杯狀細(xì)胞的數(shù)量。該研究證實(shí)了注射BMSCs的角膜上皮細(xì)胞具有完整性。雖然沒有不良反應(yīng)的報(bào)道，但是作者強(qiáng)調(diào)了BMSCs的一些免疫調(diào)節(jié)作用是有物種特異性的，也就是說，在不同物種中進(jìn)行試驗(yàn)是相當(dāng)有必要的[14]。在蔡麗萍等[15]的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，與小鼠模型組相比，BMSCs眼眶注射組可有效降低眼表炎癥指數(shù)、延長BUT、減少FLS、修復(fù)角膜上皮；同時(shí)，BMSCs眼眶注射組與陽性對照組、BMSCs滴眼組相比，結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)量及淚液分泌量明顯增多。因?yàn)檠装Y微環(huán)境對干細(xì)胞的歸巢生存至關(guān)重要，不同的干眼造模方法，可能導(dǎo)致眼表微環(huán)境不同，這將影響B(tài)MSCs在眼表的存活、遷移以及增殖能力從而影響其在眼表的定植。所以具體關(guān)于BMSCs的應(yīng)用方法和途徑還有待研究。

除此之外，在淚腺周圍植入同種異體ADSCs可顯著改善干眼的臨床癥狀，且在實(shí)驗(yàn)期間效果穩(wěn)定，對角膜沒有負(fù)面影響，也沒有退化或惡化的跡象。這些動物對細(xì)胞給藥耐受性也提示良好，在研究期間沒有任何全身或局部并發(fā)癥[16]。

2.2治療角膜疾病目前角膜病是引起視力喪失的第二位主要病因。角膜是一種保護(hù)性屏障，由具有不同起源的三層組織構(gòu)成：上皮起源于淺表外胚層，基質(zhì)和內(nèi)皮起源于神經(jīng)嵴細(xì)胞(間充質(zhì)組織)。角膜上皮干細(xì)胞歷經(jīng)干細(xì)胞、短暫擴(kuò)增細(xì)胞(transient amplifying cells,TACs)和終末分化細(xì)胞(terminally differentiated cells,TDCs)3個(gè)分化階段而構(gòu)成不斷更新的角膜上皮組織[17]。

臨床上通常將各種原因?qū)е碌难郾砑膊〉慕K末階段統(tǒng)稱為角膜緣干細(xì)胞功能障礙(limbal stem cell deficiency,LSCD)，會發(fā)生角膜上皮反復(fù)剝脫、角膜上皮結(jié)膜化、角膜新生血管、角膜混濁等臨床改變,嚴(yán)重威脅著患者的健康,最終導(dǎo)致視力喪失。LSCD的治療一直是臨床上的一大難題，近年來BMSCs羊膜移植手術(shù)的開展明顯提高了手術(shù)成功率。邵毅等[18]建立兔角膜緣干細(xì)胞缺損模型以探討無縫線BMSCs羊膜移植在兔角膜緣干細(xì)胞缺損模型的應(yīng)用效果。隨機(jī)分為三組：實(shí)驗(yàn)組(A組)行無縫線BMSCs羊膜移植術(shù),陽性對照組(B組)行單純羊膜移植術(shù)，陰性對照組(C組)不做手術(shù)處理。A、B兩組兔術(shù)后28d,淚液分泌、角膜新生血管和角膜透明度組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，角膜上皮數(shù)差異、炎癥細(xì)胞數(shù)差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明無縫線BMSCs羊膜移植術(shù)能有效預(yù)防兔角膜緣干細(xì)胞缺乏，且炎癥反應(yīng)小,角膜透明度高。普遍認(rèn)為LSCD的發(fā)病機(jī)制是角膜緣上皮基底層的干細(xì)胞缺失或受損所引起。但是，近年來有研究認(rèn)為角膜上皮干細(xì)胞并非只存在于角膜緣部位，整個(gè)角膜上皮基底層均存在寡能干細(xì)胞(oligopotent stem cells,OSCs)，它們可能也是角膜上皮更新的重要細(xì)胞來源[19]，這為治療LSCD又提供了新的思路。將MSCs移植于角膜上皮基底層，使它們擁有可以獨(dú)立再生和維持上皮植片的能力，從而更新修復(fù)角膜上皮，重建角膜生理穩(wěn)態(tài)。

同種異體ADSCs的結(jié)膜下植入可改善貓嗜酸性角膜炎的臨床表現(xiàn)。貓科動物的嗜酸性角膜炎是一種慢性角膜疾病，由免疫反應(yīng)引起對未知抗原的刺激。在11mo的隨訪中，5只受移植貓沒有出現(xiàn)全身或局部并發(fā)癥，角膜和結(jié)膜狀態(tài)改善，無任何退行或惡化跡象[19]。在使用同種異體的ADSCs治療犬干燥性角膜結(jié)膜炎的研究中表明，在輕、中度病例中眼睛可恢復(fù)到健康狀態(tài)[20]。

2.3治療視網(wǎng)膜和視神經(jīng)疾病近幾年有人提出MSCs治療可作為治療視網(wǎng)膜和視神經(jīng)變性的有效方法。已經(jīng)探知MSCs對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞具有保護(hù)作用，并通過分泌旁分泌因子刺激視神經(jīng)軸突的再生。其作用機(jī)制大致如下：MSCs通過直接分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，或刺激可在激活后提供額外旁分泌供應(yīng)并能起細(xì)胞替代作用的內(nèi)源性細(xì)胞，為視網(wǎng)膜受損細(xì)胞軸突神經(jīng)的保護(hù)和再生提供營養(yǎng)供應(yīng)[21]。有實(shí)驗(yàn)研究表明ADSCs對視神經(jīng)損傷后的纖維再生也有促進(jìn)作用，有利于視神經(jīng)軸突的再生、改善軸突運(yùn)輸功能[22]。

MSCs給藥如今已成為治療糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)的方法之一。MSCs治療DR的可能機(jī)制有：向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化、抑制視網(wǎng)膜新生血管形成、分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、分化成胰島素分泌細(xì)胞以降低血糖、抑制炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)作用等[23]。一項(xiàng)臨床初步試點(diǎn)研究顯示，在這種病理機(jī)制中，靜脈注射BMSCs是安全有效的[24]。在觀察視網(wǎng)膜下間隙移植自體BMSCs治療增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR)的研究中，通過4例系列病例追蹤觀察，結(jié)果顯示，所有患者在成功接受移植手術(shù)后均未出現(xiàn)任何全身及眼部不適。表明視網(wǎng)膜下間隙移植自體BMSCs治療PDR是相對安全的,移植的干細(xì)胞發(fā)揮了局部抗炎的作用,未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增生反應(yīng)及循環(huán)改善效果[25]。在DR小鼠模型中研究，植入玻璃體腔的ADSCs在與視網(wǎng)膜血管聯(lián)系和維持時(shí)主要分化為周細(xì)胞，這表明ADSCs在DR治療中起到了獨(dú)特功效[26]。但是目前，應(yīng)用MSCs治療DR的策略尚未被廣大患者接受，因?yàn)樽罴呀o藥方式仍存在分歧，且其有效性及安全性仍需要更多的臨床應(yīng)用進(jìn)行進(jìn)一步的評估。

年齡相關(guān)性黃斑變性(ARMD)是老年人群中最常見的致盲原因。ARMD分為干性ARMD和濕性ARMD 2種類型,目前臨床上對于ARMD的治療主要針對濕性ARMD伴發(fā)的脈絡(luò)膜新生血管(CNV),而對于干性ARMD尚無有效的治療方法。在ARMD的演變過程中,RPE細(xì)胞首先受到損害,進(jìn)而使光感受器細(xì)胞(視錐、視桿細(xì)胞)等發(fā)生退行性改變[27]。洪玉等[28]研究表明,用含成纖維細(xì)胞生長因子、表皮細(xì)胞生長因子及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的條件培養(yǎng)基與RPE細(xì)胞培養(yǎng)液體外共培養(yǎng)后,BMSCs能夠誘導(dǎo)分化成光感受器樣細(xì)胞。在人體視網(wǎng)膜退行性病變的臨床模型中顯示，BMSCs對感光細(xì)胞具有保護(hù)作用。雖然BMSCs只要一注入視網(wǎng)膜下區(qū)域后就可以分化為感光蛋白表達(dá)細(xì)胞，但無法確定它們是否能分化為具有效能的視網(wǎng)膜細(xì)胞。其作用被認(rèn)為主要與神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTF)釋放而引起的旁分泌效應(yīng)有關(guān)，NTF可參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元和其他細(xì)胞的生長、功能與存活。因此，目前認(rèn)為BMSCs治療ARMD是通過分泌細(xì)胞因子(CK)和NTF而對受體細(xì)胞產(chǎn)生積極影響，并由免疫調(diào)節(jié)活性改變神經(jīng)退行性變過程[29]。8例干型ARMD和黃斑營養(yǎng)不良的患者接受ADSCs植入治療第2階段結(jié)果顯示，所有患者沒有眼部或全身并發(fā)癥，且視力均得到了提高[30]。

2.4治療眼外傷眼堿燒傷是眼外傷中最嚴(yán)重的化學(xué)性損傷，由于各種手術(shù)本身均有一定的局限性，傳統(tǒng)的羊膜移植在臨床應(yīng)用中受到一定的限制。目前，BMSCs移植治療眼表損傷模型已取得較好的效果，其療效優(yōu)于傳統(tǒng)羊膜移植。在角膜化學(xué)性燒傷模型中，MSCs以旁分泌作用發(fā)揮其抗炎和抗血管生成的功效。研究表明將自體BMSCs在結(jié)膜下給角膜化學(xué)燒傷的大鼠注射，可促進(jìn)角膜上皮再生、減少炎癥和新生血管，并增加抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)[31]。在異體BMSCs給貓外傷性角膜潰瘍的結(jié)膜下注射的實(shí)驗(yàn)中，也證明了類似的積極作用[32]。同時(shí)，與未進(jìn)行細(xì)胞移植的對照組相比，對角膜化學(xué)燒傷的小鼠靜脈注射BMSCs也刺激了損傷部位的再生過程[33]。

有研究將分離培養(yǎng)并成功誘導(dǎo)的ADSCs貼附于羊膜上，再采用羊膜移植手術(shù)治療角膜堿燒傷后發(fā)現(xiàn)，角膜混濁程度及新生血管消退效果均明顯優(yōu)于未誘導(dǎo)ADSCs+羊膜移植組及單純羊膜移植組。推測移植的ADSCs可分化為具有角膜上皮特征的細(xì)胞，重建眼表正常結(jié)構(gòu)，同時(shí)也可減輕炎癥反應(yīng)，抑制新生血管形成，并通過一些可溶性因子的分泌，調(diào)節(jié)局部免疫反應(yīng)，改善眼表角膜上皮細(xì)胞生存的微環(huán)境，從而實(shí)現(xiàn)促進(jìn)角膜修復(fù)的效果[34]。因此，誘導(dǎo)ADSCs+羊膜移植方法有望為嚴(yán)重眼表損傷的治療提供一種極具臨床應(yīng)用前景的手段。

2.5其他BMSCs還可用于治療其他急慢性眼部疾病。例如，在嚙齒動物模型的前房注射BMSCs可以有效降低實(shí)驗(yàn)性開角型青光眼的眼壓。有研究人員認(rèn)為，這種深遠(yuǎn)的影響是由于BMSCs的旁分泌因子。此外，BMSCs及其分泌的因子可誘導(dǎo)睫狀體中一個(gè)祖細(xì)胞池的活化，促進(jìn)細(xì)胞增殖，在外傾角內(nèi)可觀察到至少達(dá)1mo之久的增殖細(xì)胞[35]。

3展望

目前很多治療眼病(如DR、眼外傷等)的傳統(tǒng)方法有一定的自限性，在臨床應(yīng)用中易受限，且難以徹底改善局部微環(huán)境，預(yù)后不佳。近幾年來,BMSCs和ADSCs已經(jīng)在臨床上用于治療多種疾病,包括退行性病變、神經(jīng)損傷、自身免疫性疾病、器官移植等,并已取得較為肯定的療效[36]。分離、培養(yǎng)和管理MSCs方法的多樣性促進(jìn)了在細(xì)胞水平研究技術(shù)的發(fā)展，可由此根據(jù)病理學(xué)來治療多種眼部疾病。相對來說，BMSCs取材較困難且患者依從性差，而ADSCs作為成體干細(xì)胞的重要組成，不存在倫理學(xué)問題，易于獲取，且體外增生迅速，免疫原性低。近10a的研究表明，使用BMSCs和ADSCs治療某些眼部疾病是有科學(xué)證明且循證的，這將為常規(guī)臨床實(shí)踐提供快速有效的理論基礎(chǔ)。隨著研究技術(shù)的深入，需要不斷地提高關(guān)于BMSCs和ADSCs治療眼病的安全性和有效性，并確保技術(shù)的簡單性和可重復(fù)性。例如，通過移植自體BMSCs治療DR的安全性、倫理性已經(jīng)得到基本肯定；在已進(jìn)行的相關(guān)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，雖然極少出現(xiàn)BMSCs和ADSCs移植的不良反應(yīng)，但是它們的一些免疫調(diào)節(jié)作用是有物種特異性的[37]。因此，在不同物種中進(jìn)行平行重復(fù)試驗(yàn)是相當(dāng)有必要的。

總的來說，大量科學(xué)研究已將BMSCs和ADSCs引入了眼科臨床實(shí)踐并不斷深化，為細(xì)胞水平的治療提供了巨大的機(jī)會，突出了MSCs在眼科學(xué)乃至整個(gè)生物學(xué)進(jìn)化中的重要研究價(jià)值。在此基礎(chǔ)上，未來必然將探索出更多關(guān)于BMSCs和ADSCs更安全、高效的獲取途徑和給藥方法，其在細(xì)胞水平的臨床治療擁有無限的潛力和價(jià)值。