創(chuàng)傷生肌水凝膠對動物皮膚創(chuàng)傷的愈合作用

梁 衛(wèi)，董國剛，劉 梅，顧 萌，季 敏，吳艮艮，梁 濤

0 引 言

創(chuàng)面愈合是指由于致傷因子的作用造成組織缺失后，局部組織通過再生、修復(fù)、重建，進(jìn)行修補(bǔ)的一系列病理生理過程?？梢愿爬?個階段：①炎癥反應(yīng)，溶解、清除壞死組織和滲出物；②結(jié)締組織細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞游動、增殖，形成肉芽組織；③新生結(jié)締組織基質(zhì)沉積和新生組織改建[1]。在新形勢下創(chuàng)傷貼劑的研究為戰(zhàn)時的后勤準(zhǔn)備提供需要和支撐，提高野戰(zhàn)醫(yī)療救護(hù)隊(duì)處理戰(zhàn)創(chuàng)傷出血的應(yīng)急能力，最大限度地降低傷殘率和死亡率[2-3]。皮膚創(chuàng)傷常用藥物有抗生素、固醇類、促成纖維細(xì)胞生長類等外用制劑，容易刺激皮膚和引起過敏等不良反應(yīng)，且價格昂貴。創(chuàng)傷生肌水凝膠是新型自擬外用中藥復(fù)方凝膠制劑，由灸黃芪、黨參、當(dāng)歸、白芍、茯苓、白術(shù)、乳香、沒藥、黃連組成，具有益氣養(yǎng)血、祛瘀生肌、清熱化濕作用。中藥多為天然成分，具有不良反應(yīng)小，疤痕形成輕，便于取材、生產(chǎn)成本低等優(yōu)勢。本研究實(shí)驗(yàn)觀察創(chuàng)傷生肌水凝膠外用對機(jī)械性皮膚創(chuàng)傷、創(chuàng)傷性潰瘍的治療效果及作用機(jī)制，為今后研發(fā)治療皮膚創(chuàng)傷的外用制劑提供可能。

1 材料與方法

1.1 材料SPF級昆明小鼠50只,雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g；SPF級SD大鼠50只，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半，飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)中心動物房(SPF級)，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲食飲水，模擬自然光照，光照時間(7:00-19:00)，溫度20～25 ℃，相對濕度50%～70%。購自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動物有限公司[實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK(滬)2013-0006]。創(chuàng)傷生肌水凝膠水提液配制：處方為炙黃芩30 g，黨參30 g，當(dāng)歸20，炒白芍30 g，炒白術(shù)30g，茯苓30 g，制乳香15 g，制沒藥15 g，等。將藥浸沒于水中30 min后加入藥物2倍量水煎制1 h，濾過，藥渣再煎制30 min，2次藥液混合加熱濃縮到所需濃度。創(chuàng)傷生肌水凝膠凝膠配制：卡波姆∶水提液質(zhì)量比為1∶13，先卡波姆加入純水中溶解，按比例加入上述熬制好的創(chuàng)傷生肌水凝膠水提液，然后加入適量三乙醇胺調(diào)pH=7使之成凝膠狀，最后加入輔料0.2 mL丙三醇、0.1 g尼泊金乙酯、0.2 mL甘油得到1 g/mL的創(chuàng)傷生肌水凝膠凝膠劑。錦虹創(chuàng)面修復(fù)誘導(dǎo)凝膠購自山西康頤健科技有限公司，卡波姆940購自北京索爾比奧科技有限公司，大鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司，核因子κB(NF-κB)、Smad2、Smad3一抗購自Abcam公司；低溫高速離心機(jī)(德國 Eppendorf)，酶標(biāo)儀(上海科華實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司)，電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠化學(xué)性創(chuàng)傷性潰瘍模型制備與給藥取小鼠50只，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，用電推子背部脫毛，脫毛的面積1 cm×1 cm,小鼠背部皮下注射稀鹽酸(0.05 mol/mL)0.4 mL/只，單點(diǎn)注射， 3 d后小鼠背部皮膚潰瘍形成[4]。將造模小鼠隨機(jī)分為5組,隨機(jī)分組方法見文獻(xiàn)[5]，每組10只。模型組:給予等量的體積(同其他給藥組)等滲鹽水；基質(zhì)組：給予卡波姆凝膠基質(zhì)0.5%；凝膠低劑量組：1 g/mL；凝膠高劑量組：3.5 g/mL；陽性組：錦虹創(chuàng)面修復(fù)誘導(dǎo)凝膠，3 g/支。自造模成功次日分別給各組小鼠局部外敷，在潰瘍局部均勻敷2～3 mm厚，約0.5 mL/cm2，每天保持潰瘍局部與相應(yīng)藥物接觸時間6 h，每只小鼠單籠飼養(yǎng)，以免相互添蹭，6 h后以溫等滲鹽水清洗用藥局部；每天敷藥1次，連續(xù)敷藥10 d。

1.2.2 大鼠機(jī)械性創(chuàng)傷模型制備與給藥SD大鼠50只，用1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，剔除其背部毛發(fā),以無菌手術(shù)剪在背部脊柱左右對稱地剪開，每只大鼠背部開5個直徑為0.7 cm的圓形全層皮膚缺損創(chuàng)面，深至皮下[6]。每個圓形創(chuàng)面設(shè)置一個劑量組，分為5組，分組同1.2.1。大鼠造模后，以外敷形式將藥物涂布在傷口表面約2～3 mm厚，約0.5 mL/cm2。

1.2.3 觀察給藥后小鼠化學(xué)性損傷皮膚潰瘍創(chuàng)面愈合率給藥第5天處死小鼠，剪下小鼠潰瘍創(chuàng)面皮膚，用透明薄膜描記創(chuàng)面面積，與原創(chuàng)面面積比較，計(jì)算各組小鼠創(chuàng)面愈合率。

創(chuàng)面愈合率(%)=(原創(chuàng)面面積-現(xiàn)創(chuàng)面面積)/原創(chuàng)面面積×100%

1.2.4 觀察給藥后大鼠各組皮膚創(chuàng)面愈合率在給藥后第1天、第3天、第6天、第9天分別處死大鼠，用透明薄膜描記創(chuàng)面面積，與原創(chuàng)面面積比較，計(jì)算各組大鼠創(chuàng)面愈合率。

1.2.5 大鼠皮膚常規(guī)病理組織學(xué)切片染色在給藥后第9天處死各組大鼠，取皮膚創(chuàng)緣及周圍0.5 cm左右寬的組織，深達(dá)皮下組織，將組織塊甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后。常規(guī)脫水，包埋，切片后作HE染色，光鏡觀察皮膚及肉芽組織結(jié)構(gòu)改變。

1.2.6 ELISA法檢測大鼠皮膚組織細(xì)胞因子表達(dá)給藥第9天，取大鼠傷口部位皮膚組織，用勻漿機(jī)制成10%勻漿。ELISA法檢測TGF-β1、IL-2、TNF-α的變化。

1.2.7 Western blot法檢測NF-κB、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)給藥第9天，取大鼠皮膚組織，勻漿制備，采用Western印跡的方法，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠電泳。麗春紅染色顯示凝膠中的蛋白條帶后，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上進(jìn)行NF-κB65、Smad2、Smad3蛋白的檢測。一抗(1∶200)和β-actin(1∶1500)，二抗(1∶5000)稀釋。采用賽默飛化學(xué)發(fā)光底物(ECL)化學(xué)發(fā)光試劑盒，顯影定影水洗晾干后，對膠片感光條帶進(jìn)行灰度掃描。應(yīng)用BIO-RAD圖像分析軟件對Western 印跡雜交條帶進(jìn)行密度掃描,檢測NF-κB、Smad2、Smad3的蛋白表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 創(chuàng)傷生肌水凝膠對于小鼠化學(xué)性創(chuàng)傷性潰瘍愈合率的影響給藥第5天后，與基質(zhì)組[(1.50±0.25)%]比較，凝膠高劑量組和低劑量組愈合率[(1.22±0.18)%、(1.30±0.12)%]差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；陽性組愈合率[(23.5±0.48)%]顯著提高(P<0.05)，表明陽性組用藥可促進(jìn)化學(xué)性潰瘍傷口愈合。而創(chuàng)傷生肌水凝膠對化學(xué)性損傷潰瘍無明顯治療作用。

2.2 創(chuàng)傷生肌水凝膠對于大鼠機(jī)械性創(chuàng)面愈合率的影響給藥第1、3、6、9天，與模型組比較，基質(zhì)組的愈合率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；給藥第6天后，與基質(zhì)組比較，凝膠低劑量組、高劑量組、陽性組創(chuàng)面愈合率均明顯提高(P<0.01)；給藥第9天后，凝膠低劑量組、高劑量組、陽性組創(chuàng)面愈合率顯著提高(P<0.01)；見表1。給藥第6和9天，創(chuàng)傷生肌水凝膠各組和陽性組較基質(zhì)組皮膚創(chuàng)傷修復(fù)明顯，表明創(chuàng)傷生肌水凝膠能夠促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合。

表1 各組大鼠不同時間機(jī)械性創(chuàng)面愈合率比較

2.3 創(chuàng)傷生肌水凝膠對大鼠機(jī)械性創(chuàng)面皮膚病理組織學(xué)影響給藥第9天，模型組皮膚各層組織表皮層增厚，但未完全愈合并伴有組織輕度壞死；基質(zhì)組表皮結(jié)構(gòu)消失，可見滲出，真皮內(nèi)見增生性反應(yīng)，局部有充血；凝膠低劑量組皮膚各層組織結(jié)構(gòu)清晰，結(jié)締組織明顯，可見肉芽組織；高劑量組真皮層結(jié)構(gòu)尚清晰，可見肉芽組織形成；陽性組皮膚各層組織結(jié)構(gòu)完整清晰，傷口基本愈合接近正常皮膚。見圖1。

圖1 各組大鼠機(jī)械性創(chuàng)面皮膚病理結(jié)果(HE ×400)

2.4 ELISA法檢測大鼠皮膚組織細(xì)胞因子TGF-β1、IL-2、TNF-α表達(dá)與模型組比較，基質(zhì)組TGF-β1、IL-2、TNF-α含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與基質(zhì)組比較，凝膠高劑量組、陽性組TGF-β1含量有顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 創(chuàng)傷生肌水凝膠對各組大鼠TGF-β1、IL-2、TNF-α含量的影響

2.5 免疫印跡法檢測NF-κB、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)給藥第9天，與基質(zhì)組比較，凝膠高劑量組、陽性組的NF-κB的表達(dá)明顯下降(P<0.05)，而Smad2、Smad3的蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

1：模型組；2：基質(zhì)組；3：凝膠低劑量組:4：凝膠高劑量組:5：陽性組與基質(zhì)組比較，*P<0.05圖2 創(chuàng)傷生肌水凝膠對各組大鼠NF-κB、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

創(chuàng)傷修復(fù)一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，而皮膚作為人體最大最外部的器官極易遭受創(chuàng)傷，皮膚創(chuàng)面愈合是一系列復(fù)雜的連續(xù)的生物化學(xué)和細(xì)胞活動過程。TGF-β在此過程中是調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞功能的主要細(xì)胞因子，TGF-β不僅通過促進(jìn)成纖維細(xì)胞趨化,產(chǎn)生膠原纖維和細(xì)胞外基質(zhì),還可減少膠原酶的合成,增加金屬蛋白酶抑制劑的產(chǎn)生,從而減少傷口中的酶解作用,促進(jìn)傷口愈合[7-8]。NF-κB是炎癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子,多種炎癥因子如IL-6等的啟動子區(qū)均含有NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)，創(chuàng)傷生肌水凝膠可能是通過抑制NF-κB信號傳導(dǎo)通路,抑制傷口愈合后期炎癥生成和組織纖維化，防止瘢痕和疤痕的形成。Smads蛋白可以調(diào)節(jié)創(chuàng)面愈合，對皮膚組織修復(fù)中有作用，目前認(rèn)為是“修復(fù)相關(guān)基因”[9-12]。

創(chuàng)傷生肌水凝膠是由炙黃芩、黨參、當(dāng)歸、白芍、茯苓、白術(shù)、乳香、沒藥、黃連組成的中藥復(fù)方凝膠制劑。方中炙黃芩具有清熱解毒生肌作用。黨參具有補(bǔ)氣固表、益氣生肌作用，當(dāng)歸、白芍具有補(bǔ)血活血生肌之功效，茯苓、白術(shù)具有健脾益氣化濕作用，乳香、沒藥具有活血祛瘀生肌之功效，黃連具有清熱解毒生肌作用。諸藥合用，全方具有益氣養(yǎng)血、活血祛瘀、清熱化濕生肌作用。有研究報道，黃芩多糖可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，并且其增殖作用隨時間的延長而增強(qiáng)[13]。單用當(dāng)歸可使瘢痕軟化縮小，明顯減少瘢痕組織中的成纖維細(xì)胞數(shù)量和膠原含量，減輕瘢痕纖維化程度。當(dāng)歸中的多糖通過對角質(zhì)形成細(xì)胞TGF-β的表達(dá)具有顯著的調(diào)節(jié)作用,從而促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖[14]。乳香和沒藥具有鎮(zhèn)痛作用[15]。

本研究采用皮下注射稀鹽酸建立小鼠皮膚潰瘍模型，創(chuàng)傷生肌水凝膠各劑量組對化學(xué)性潰瘍愈合率未見改善作用，說明創(chuàng)傷生肌水凝膠對化學(xué)性潰瘍造成的潰瘍效果不好。采用大鼠皮膚機(jī)械性損傷模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與基質(zhì)組比較，凝膠低劑量組、高劑量組于給藥第6、9天時皮膚創(chuàng)面愈合率較高，同時病理切片報告顯示：給藥第9天后，凝膠高、低劑量組皮膚各層組織結(jié)構(gòu)清晰，結(jié)締組織明顯，可見肉芽組織。ELISA檢測細(xì)胞因子結(jié)果顯示：凝膠高劑量組細(xì)胞因子TGF-β1含量有顯著升高；Western蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：創(chuàng)傷生肌水凝膠抑制NF-κB蛋白的表達(dá)，對Smads蛋白表達(dá)無影響，提示該藥對TGF-β1的作用可能不是通過Smads蛋白通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，創(chuàng)傷生肌水凝膠對化學(xué)性創(chuàng)傷潰瘍無作用，但能夠促進(jìn)機(jī)械性創(chuàng)傷愈合。創(chuàng)傷愈合還與調(diào)節(jié)免疫、神經(jīng)肽P物質(zhì)(SP)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)及血小板生長因子(FGF)等細(xì)胞因子有關(guān)[16-17]。本實(shí)驗(yàn)還有待深化，其創(chuàng)傷修復(fù)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究，以闡明創(chuàng)傷生肌水凝膠與創(chuàng)傷愈合之間的內(nèi)在機(jī)制。