豬流行性腹瀉病毒感染對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞I型干擾素產(chǎn)生通路的影響

丁芳藝　宋海鑫　梁榮　苗晉鋒　費(fèi)榮梅　劉永杰　余祖功　張金秋

摘要： 豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus， PEDV）是嚴(yán)重危害仔豬腸道健康的病原之一。用病毒感染復(fù)數(shù)（MOI）=1.0的PEDV感染豬小腸上皮細(xì)胞，通過(guò)間接免疫熒光試驗(yàn)，證實(shí)PEDV能在豬小腸上皮細(xì)胞中增殖。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Toll 樣受體3（TLR3）編碼基因、視黃醇誘導(dǎo)基因 I/黑色素瘤分化相關(guān)基因5（RIG-I/MDA5）的mRNA表達(dá)水平分別從感染后2 h、4 h開(kāi)始顯著升高（P<0.05），分別在感染后12 h、24 h達(dá)到最高值;線粒體抗病毒信號(hào)蛋白（MAVS）編碼基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量從感染后6 h開(kāi)始顯著升高（P<0.05），隨后基本保持不變。下游接頭蛋白質(zhì)β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白質(zhì)（TRIF）、腫瘤壞死因子相關(guān)因子3（TRAF3）、IκB 激酶ε（IKK-ε）和TANK結(jié)合激酶1（TBK1）編碼基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量在感染后4 h出現(xiàn)顯著上升（P<0.05），隨后IKK-ε編碼基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量在感染后8 h達(dá)到最高值，TRIF、TRAF3和TBK1編碼基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量均在感染后12 h達(dá)到最高值。干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）編碼基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量在感染早期無(wú)顯著變化，在感染后24 h達(dá)到最高值（P<0.05）。與對(duì)照組相比，PEDV感染無(wú)法誘導(dǎo)豬小腸上皮細(xì)胞（IPEC-J2）IFN-β編碼基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高，但能有效抑制Poly（I：C）（聚肌胞苷酸）誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生。結(jié)果表明，PEDV能夠在感染早期激活TLRs、RLRs介導(dǎo)的I型IFN產(chǎn)生通路中相關(guān)受體及接頭蛋白質(zhì)的基因表達(dá)，但最終能抑制干擾素產(chǎn)生，并能在豬小腸上皮細(xì)胞中有效增殖。

關(guān)鍵詞： 天然免疫;豬流行性腹瀉病毒;豬小腸上皮細(xì)胞;I型干擾素

中圖分類(lèi)號(hào)： S828.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-4440（2021）01-0099-07

Effects of porcine epidemic diarrhea virus infection on IFN-β production pathway in porcine intestinal epithelial cells

DING Fang-yi 1，2，3， SONG Hai-xin 1，2，3， LIANG Rong1，2，3， MIAO Jin-feng2， FEI Rong-mei2， LIU Yong-jie2， YU Zu-gong2， ZHANG Jin-qiu 1，3，4，5

（1.Institute of Veterinary Immunology and Engineering， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China;2.College of Veterinary Medicine， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China;3.Jiangsu Key Laboratory for Food Quality and Safety——State Key Laboratory Cultivation Base， Nanjing 210014， China;4.Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses， Yangzhou 225009， China;5.College of Pharmacy， Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China）

Abstract： Porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） is one of the pathogens that seriously endanger the intestinal health of piglets. Porcine intestinal epithelial cells （IPEC-J2） were infected with PEDV at a multiplicity of infection MOI of 1.0. Virus proliferation in IPEC-J2 was observed by indirect immunofluorescence assay （IFA）. Through real-time fluorescent quantitative PCR （RT-PCR） detection， it was found that the mRNA levels of TLR3 encoding gene and RIG-I/MDA5 significantly increased from 2 hours post infection （hpi） and 4 hpi， respectively （P<0.05）， and peaked at 12 hpi and 24 hpi. The relative mRNA expression of mitochondrial antiviral signaling protein （MAVS） coding gene significantly increased at 6 hpi （P<0.05）， and then remained unchanged. The mRNA levels of TRIF， TRAF3， IKK-ε and TBK1 coding genes significantly increased from 4 hpi （P<0.05）， and then the relative mRNA expression of IKK-ε encoding genes reached the highest level at 8 hpi while TRIF， TRAF3 and TBK1 encoding genes at 24 hpi. The relative mRNA expression of interferon regulatory factor 3 （IRF3） encoding gene showed no significant change at the early stage after infection， and reached the highest level at 12 hpi. Compared with control group， there was no significant difference of IFN mRNA expression in IPEC-J2 infected with PEDV. However， PEDV infection could inhibit the production of IFN-β induced by Poly（I：C）. The results suggested that PEDV could activate TLRs and RLRs signaling pathway in the early stage after infection， and effectively proliferate in IPEC-J2 by inhibiting IFN-β.

Key words： innate immunity;porcine epidemic diarrhea virus;porcine intestinal epithelial cells;type I interferon

豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus， PEDV）是具有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于冠狀病毒科、α冠狀病毒屬，是近年來(lái)導(dǎo)致新生仔豬急性腸炎及水樣腹瀉致死的主要病原之一，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大威脅[1]。尤其是2010年以來(lái)，隨著PEDV新變異株的出現(xiàn)，美洲、歐洲及亞洲的多個(gè)國(guó)家再次暴發(fā)豬流行性腹瀉，使養(yǎng)豬業(yè)遭受了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

PEDV基因組全長(zhǎng)約為28 kb，含有5′端帽子結(jié)構(gòu)和3′端Poly（A）尾巴，從5′端開(kāi)始，依次為5′端非翻譯區(qū)（Untranslated region，UTR）、7個(gè)開(kāi)放閱讀框（Open reading frame， ORF）（包括ORF1a、ORF1b、ORF2～ORF6）和3′端UTR[3]。病毒感染細(xì)胞后，病毒基因組RNA及其在復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生的單鏈RNA（ssRNA）、雙鏈RNA（dsRNA）能夠被胞質(zhì)中的（RIG-I）樣受體家族（RIG-I-like receptors，RLRs）或內(nèi)體中Toll 樣受體家族（Toll-like receptors，TLRs）識(shí)別，通過(guò)視黃醇誘導(dǎo)基因（RIG-I）/黑色素瘤分化相關(guān)基因5（MDA5）/線粒體抗病毒信號(hào)蛋白質(zhì)（Mitochondrial antiviral-signaling protein，MAVS）或/和TLR3/β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白質(zhì)（TIR domain-containing adaptor inducing IFN-β，TRIF）等通路進(jìn)行信號(hào)傳遞，促進(jìn)I型IFN及相關(guān)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，發(fā)揮細(xì)胞的抗病毒功能，這是宿主細(xì)胞抵御病毒入侵的第一道防線[2]。

近年來(lái)的大量研究發(fā)現(xiàn)，PEDV能夠通過(guò)不同方式抑制I型IFN的產(chǎn)生[4-5]，但是具體的分子機(jī)制尚未完全明確。本研究以PEDV經(jīng)典毒株CV777作為模式株，用其感染豬小腸上皮細(xì)胞，檢測(cè)宿主細(xì)胞相關(guān)受體TLR3、RIG-I以及MDA5和重要接頭蛋白質(zhì)TRIF、MAVS、腫瘤壞死因子相關(guān)因子3（TNF receptor-associated factor 3，TRAF3）、TANK結(jié)合激酶1（TBK1）、IκB 激酶ε（IKK-ε）、干擾素調(diào)節(jié)因子3（Interferon regulatory factor 3， IRF3）、效應(yīng)分子IFN-β表達(dá)水平的變化，以期深入了解宿主細(xì)胞抵御PEDV感染及機(jī)體整體天然免疫變化的規(guī)律，為進(jìn)一步理解宿主清除PEDV的免疫機(jī)制及PEDV的拮抗機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料

PEDV CV777株、豬小腸上皮細(xì)胞（IPEC-J2），由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存;PEDV-N蛋白單克隆抗體，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室制備;羊抗鼠熒光二抗，購(gòu)自北京Solarbio科技有限公司;RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑，購(gòu)自TaKaRa公司;轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000 Reagent Protocol，購(gòu)自Invitrogen公司;Poly（I：C）（聚肌胞苷酸）購(gòu)自Sigma Aldrich公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與病毒增殖 將凍存的IPEC-J2細(xì)胞從液氮罐中取出，在37 ℃水浴中快速融化后于1 000 r/min離心10 min。棄去凍存液，加入完全培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清的DMEM）重懸細(xì)胞后，將重懸細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞鋪滿至單層后，將細(xì)胞傳代，接種至6孔板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到90%左右時(shí)，按病毒感染復(fù)數(shù)（MOI）=1.0接種PEDV病毒，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 間接免疫熒光 將IPEC-J2細(xì)胞接種于24孔板中，分別按MOI=0.1、MOI=1.0接種PEDV，設(shè)置未接毒的陰性對(duì)照。培養(yǎng)24 h后棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗3遍，隨后加入固定液，用PBS清洗3遍，加入0.2% TritonX-100于室溫孵育后，用PBS清洗3遍，再用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉1 h，然后用PBS清洗3遍，加入PEDV N蛋白抗體于37 ℃孵育1 h，用PBS清洗3遍，加入熒光二抗，于37 ℃避光孵育1 h，用PBS清洗3遍后在倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將IPEC-J2細(xì)胞接種至6孔板中，待細(xì)胞匯合度約為90%時(shí)，用不含有血清的Opti-MEM培養(yǎng)基（125 μl）稀釋Lipofectamine 3000（5 μl）試劑，充分混勻。隨后用不含血清的Opti-MEM培養(yǎng)基（125 μl）稀釋Poly（I：C）（Sigma），再添加10 μl P3000試劑制備Poly（I：C）預(yù)混液，充分混勻后在室溫下孵育15 min。將混合后的復(fù)合物加入6孔板中，培養(yǎng)6 h后更換培養(yǎng)液，于37 ℃孵育，24 h后收集樣品，提取細(xì)胞總RNA。

1.2.4 細(xì)胞總RNA的提取及cDNA的合成 用RNA提取試劑盒（TaKaRa）提取細(xì)胞樣品的RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，反應(yīng)體系如下： 2 μl 5×PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time），500 ng總RNA，用RNase Free dH2O補(bǔ)足總體積至10 μl。將上述溶液混勻后，設(shè)置如下反應(yīng)程序：37 ℃ 15 min，85℃ 5 s，4 ℃終止反應(yīng)。將得到的cDNA儲(chǔ)存于-20 ℃，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量RT-qPCR 以方法1.2.4中合成的cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）。20 μl反應(yīng)體系如下： 10 μl 2×TB Green Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus），0.8 μl PCR Forward Primer（10 μmol/L），0.8 μl PCR Reverse Primer（10 μmol/L），2 μl DNA模板，6.4 μl RNase Free dH2O。PCR反應(yīng)條件： 95 ℃ 30 s預(yù)變性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，用2-△△Ct法計(jì)算結(jié)果。擴(kuò)增引物序列見(jiàn)表1。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析 用GraphPad Prism 6軟件作圖并分析數(shù)據(jù)，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEDV感染IPEC的間接免疫熒光檢測(cè)

分別按MOI=0.1、MOI=1.0對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞接種PEDV，24 h后收集樣品，固定、封閉后加入PEDV N蛋白抗體和熒光二抗，通過(guò)熒光顯微鏡觀察病毒的增殖情況。由圖1可以看出，感染后24 h在豬小腸上皮細(xì)胞中能有效地檢測(cè)到PEDV N蛋白的表達(dá)，且N蛋白表達(dá)量與病毒感染劑量呈正相關(guān)。

2.2 TLRs及RLRs信號(hào)通路中不同受體在mRNA相對(duì)表達(dá)量上的變化

豬小腸上皮細(xì)胞按MOI=1感染PEDV后，分別于感染后0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h收集細(xì)胞。提取各時(shí)間點(diǎn)樣品的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，觀察TLRs、RLRs信號(hào)通路中相關(guān)受體編碼基因在病毒感染后24 h內(nèi)mRNA表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化。由圖2可以看出，與對(duì)照組相比，TLR3編碼基因以及RIG-I、MDA5的mRNA相對(duì)表達(dá)量均在感染后出現(xiàn)顯著變化，其中TLR3編碼基因、RIG-I的mRNA相對(duì)表達(dá)量從感染后2 h開(kāi)始顯著升高（P<0.05），MDA5的mRNA相對(duì)表達(dá)量從感染后4 h開(kāi)始顯著升高（P<0.05），TLR3編碼基因和RIG-I、MDA5的mRNA相對(duì)表達(dá)量在感染后12 h或24 h達(dá)到最高值。

2.3 TLRs及RLRs信號(hào)通路中關(guān)鍵接頭蛋白質(zhì)在mRNA相對(duì)表達(dá)量上的變化

用MOI=1.0的PEDV感染IPEC-J2，分別于感染后0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h收集樣品，通過(guò)RT-qPCR方法觀察TLRs和RLRs通路中不同蛋白質(zhì)在mRNA表達(dá)水平的變化。由圖3可以看出，TRIF、TRAF3編碼基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量在感染后4 h出現(xiàn)顯著上升（P<0.05），之后稍微下降，又于感染后24 h達(dá)到最高值。MAVS編碼基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量在感染后6 h開(kāi)始顯著上升（P<0.05），在感染后8 h、12 h、24 h之間無(wú)顯著差異。IKK-ε、TBK1編碼基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量均于感染后4 h出現(xiàn)顯著上升（P<0.05），隨后IKK-ε編碼基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量在感染后8 h達(dá)到最高值，而TBK1編碼基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量在感染6 h后先稍有下降后又上升，至感染后24 h時(shí)達(dá)到最高值（P<0.05）。IRF3編碼基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量在感染早期（感染后0～8 h）無(wú)顯著變化，在感染后12 h達(dá)到最高值（P<0.05）。

2.4 TLRs及RLRs信號(hào)通路效應(yīng)分子IFN-β在mRNA表達(dá)水平上的變化

用MOI=1.0的PEDV感染IPEC-J2細(xì)胞，并向其中1組轉(zhuǎn)染1 μg Poly（I：C），同時(shí)設(shè)置不接種病毒的陰性對(duì)照和只轉(zhuǎn)染Poly（I：C）的陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示，PEDV感染后對(duì)IPEC-J2細(xì)胞中的IFN-β在mRNA表達(dá)水平上無(wú)顯著影響，但是能夠有效抑制Poly（I：C）誘導(dǎo)IFN-β，詳見(jiàn)圖4。

3 討論

PEDV的體外培養(yǎng)一直是業(yè)內(nèi)的難題，Hofmann等[6]最早于1988年首次在添加了胰酶的Vero（非洲綠猴腎細(xì)胞）中成功擴(kuò)增出PEDV。目前，PEDV的體外復(fù)制和增殖主要是在Vero細(xì)胞上進(jìn)行的，并缺失I型IFN基因簇，進(jìn)而導(dǎo)致I型IFN表達(dá)缺陷，因此不適合用于研究病毒對(duì)宿主細(xì)胞天然免疫的影響。另外，MARC-145（非洲綠猴胚胎腎細(xì)胞）、LLC-PK1（豬腎細(xì)胞）和ST（豬睪丸細(xì)胞）等細(xì)胞系也曾被用于PEDV的體外研究，但是這些細(xì)胞并非PEDV等腸道冠狀病毒感染的靶細(xì)胞，因此可能無(wú)法真實(shí)反映病毒拮抗宿主天然免疫反應(yīng)的變化規(guī)律。近年來(lái)，豬小腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2在研究PEDV的致病機(jī)制過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。作為PEDV感染的主要靶細(xì)胞，IPEC-J2可能更適于研究病毒對(duì)宿主天然免疫的影響及調(diào)節(jié)作用。因此，本研究選擇IPEC-J2進(jìn)行試驗(yàn)。

本研究首先觀察了PEDV在IPEC-J2細(xì)胞中的增殖情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：用不同MOI的PEDV感染IPEC-J2細(xì)胞后，24 h內(nèi)均能檢測(cè)到PEDV N蛋白的表達(dá)，且N蛋白表達(dá)量與病毒感染復(fù)數(shù)呈正相關(guān)，表明PEDV能夠有效感染IPEC-J2細(xì)胞，并能在細(xì)胞內(nèi)有效增殖，這為下一步研究PEDV感染對(duì)IPEC-J2細(xì)胞中I型IFN產(chǎn)生通路中的相關(guān)受體、接頭蛋白質(zhì)及效應(yīng)蛋白質(zhì)的影響奠定了基礎(chǔ)。

天然免疫在限制病毒的感染和早期擴(kuò)散方面發(fā)揮著重要作用。宿主細(xì)胞可通過(guò)不同模式識(shí)別受體以感知病毒的入侵，主要包括TLRs、RLRs、C型凝集素受體家族（CLRs）及核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族（NLRs）等[7]。其中與RNA病毒感染密切相關(guān)的是由RLRs、TLRs介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。RNA病毒感染細(xì)胞后，病毒基因組RNA及復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生的ssRNA、dsRNA被胞質(zhì)中的RIG-I/黑色素瘤分化相關(guān)基因5識(shí)別，隨后通過(guò)MAVS傳遞信號(hào)，招募TRAF3/6，進(jìn)一步激活TBK1/IKK激酶復(fù)合體并使其發(fā)生磷酸化，最終使NF-κB、IRFs等核轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，形成同二聚體或異二聚體，然后進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng) Ⅰ 型干擾素轉(zhuǎn)錄。本研究發(fā)現(xiàn)，PEDV感染IPEC-J2細(xì)胞后，RIG-I、MDA5等受體及TRAF3、TBK1等接頭蛋白質(zhì)編碼基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別從感染后2 h或4 h開(kāi)始顯著升高（P<0.05），在感染后12 h或24 h達(dá)到最高值，表明病毒RNA或復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生的大量ssRNA或dsRNA能夠被胞漿中相應(yīng)的模式識(shí)別受體RIG-I、MDA5等感知并識(shí)別，相關(guān)受體及接頭分子均被快速激活，進(jìn)而啟動(dòng)下游信號(hào)傳遞。另外，關(guān)鍵接頭蛋白質(zhì)MAVS編碼基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量在感染后6 h開(kāi)始顯著上升（P<0.05），隨后基本保持不變，提示MAVS發(fā)揮其信號(hào)傳遞作用可能與其mRNA表達(dá)水平的關(guān)系不密切，這與筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期針對(duì)流感病毒的研究結(jié)果一致[8]。目前的研究結(jié)果表明，MAVS的活化及下游信號(hào)傳遞與N端的CARD樣結(jié)構(gòu)域和C端的TM結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，兩者共同介導(dǎo)MAVS復(fù)合體的構(gòu)象改變、泛素化降解及下游的信號(hào)傳遞。在此過(guò)程中，MAVS在蛋白質(zhì)水平的降解對(duì)其介導(dǎo)的I型IFN的產(chǎn)生是必不可少的[9-10]。

進(jìn)入內(nèi)體中的病毒RNA能夠被胞內(nèi)受體如TLR3、TLR7或TLR8識(shí)別，進(jìn)而招募其下游接頭蛋白質(zhì)，如MyD88、TRIF、TRAF3/6等，并將信號(hào)傳遞給NF-κB、IRFs等核轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素及促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生。本試驗(yàn)結(jié)果表明，TLR3編碼基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量從感染后2 h開(kāi)始顯著升高（P<0.05），在感染后12 h即達(dá)到最高值;TRIF、TRAF3編碼基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量從感染后4 h開(kāi)始顯著升高（P<0.05），在感染后24 h達(dá)到最高值，表明病毒復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生的部分dsRNA能夠被內(nèi)體中TLR3受體快速識(shí)別并激活下游的信號(hào)傳遞過(guò)程。由此可見(jiàn)，PEDV感染豬小腸上皮細(xì)胞可以激活TLR3等受體途徑，進(jìn)而引起NF-κB活化，這與Cao等[11]的研究結(jié)果一致。

Poly（I：C）是dsRNA類(lèi)似物，進(jìn)入細(xì)胞后可以激活TLRs和RLRs信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生干擾素[12]。本試驗(yàn)以Poly（I：C）作為陽(yáng)性對(duì)照，發(fā)現(xiàn)按MOI=1.0對(duì)IPEC-J2細(xì)胞接種PEDV 24 h后，細(xì)胞中的IFN-β編碼基因在mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著變化，并且發(fā)現(xiàn)PEDV能夠有效抑制Poly（I：C）誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生，這與孫敏[13]的研究結(jié)果一致。但李亮[14]研究發(fā)現(xiàn)，用MOI=5.0的PEDV-JMS毒株感染回腸類(lèi)器官細(xì)胞后，IFN-α編碼基因的mRNA表達(dá)水平在感染24 h內(nèi)升高了2倍，推測(cè)可能與毒株特性、細(xì)胞模型及病毒的感染劑量有關(guān)，具體有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，PEDV能夠激活TLRs/RLRs及下游關(guān)鍵接頭蛋白質(zhì)的表達(dá)，但是最終能夠抑制Ⅰ型IFN的產(chǎn)生，從而在豬小腸上皮細(xì)胞中有效增殖，推測(cè)PEDV對(duì)該天然免疫信號(hào)通路仍存在負(fù)調(diào)控機(jī)制。如Cao等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，PEDV可以抑制RIG-I、MAVS介導(dǎo)的IFN-β啟動(dòng)子活性，但不能下調(diào)TBK1/IKK-ε介導(dǎo)的IFN-β啟動(dòng)子活性，因此推測(cè)PEDV阻斷IFN-β信號(hào)傳遞的作用位點(diǎn)在TBK1/IKK-ε上游。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，PEDV編碼的N蛋白、木瓜樣蛋白酶（PLP），Nsp1、Nsp5編碼的3CLpro及Nsp7可能參與調(diào)控宿主細(xì)胞的I型IFN應(yīng)答[16-20]。由此可見(jiàn)，關(guān)于PEDV編碼蛋白質(zhì)參與調(diào)控宿主I型IFN應(yīng)答的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探索，這也是今后研究的重點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1] CAVANAGH D. Nidovirales： a new order comprising Coronaviridae and Arteriviridae[J]. Archives of Virology， 1997， 142（3）： 629-633.

[2] SUN R Q， CAI R J， CHEN Y Q， et al. Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets， China[J]. Emerging Infectious Diseases， 2012， 18（1）： 161-163.

[3] KOCHERHANS R， BRIDGEN A， ACKERMANN M， et al. Completion of the porcine epidemic diarrhoea coronavirus （PEDV） genome sequence[J]. Virus Genes， 2001， 23（2）： 137-144.

[4] XING Y L， CHEN J F， TU J， et al. The papain-like protease of porcine epidemic diarrhea virus negatively regulates type I interferon pathway by acting as a viral deubiquitinase[J]. The Journal of General Virology， 2013， 94（7）： 1554-1567.

[5] DING Z， FANG L R， JING H Y， et al. Porcine epidemic diarrhea virus nucleocapsid protein antagonizes beta interferon production by sequestering the interaction between IRF3 and TBK1[J]. Journal of Virology， 2014， 88（16）： 8936-8945.

[6] HOFMANN M， WYLER R. Propagation of the virus of porcine epidemic diarrhea in cell culture[J]. Journal of Clinical Microbiology， 1988， 26（11）：2235-2239.

[7] THOMPSON M R， KAMINSKI J J， KURT-JONES E A， et al. Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection[J]. Viruses， 2011， 3（6）： 920-940.

[8] ZHANG J Q， MIAO J F， HOU J B， et al. The effects of H3N2 swine influenza virus infection on TLRs and RLRs signaling pathways in porcine alveolar macrophages[J]. Virol Journal， 2015， 12： 61.

[9] KAWAI T， TAKAHASHI K， SATO S， et al. IPS-1， an adaptor triggering RIG-I- and Mda5-mediated type I interferon induction[J]. Nature Immunology， 2005， 6（10）： 981-988.

[10]XU L G， WANG Y Y， HAN K J， et al. VISA is an adapter protein required for virus-triggered IFN-β signaling[J]. Molecular Cell， 2005， 19（6）： 727-740.

[11]CAO L Y， GE X Y， GAO Y， et al. Porcine epidemic diarrhea virus infection induces NF-κB activation through the TLR2， TLR3 and TLR9 pathways in porcine intestinal epithelial cells[J]. Journal of General Virology， 2015， 96（7）： 1757-1767.

[12]MIAN M F， AHMED A N， RAD M， et al. Length of dsRNA （poly I：C） drives distinct innate immune responses， depending on the cell type[J]. Journal of Leukocyte Biology， 2013， 94（5）： 1025-1036.

[13]孫 敏. 豬流行性腹瀉病毒遺傳變異規(guī)律與Ⅰ型干擾素逃避機(jī)制[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2017.

[14]李 亮. 豬腸類(lèi)器官模型的建立及干擾素λ在腸道黏膜免疫中抗豬流行性腹瀉病毒（PEDV）作用機(jī)制的研究[D]. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2019.

[15]CAO L Y， GE X Y， GAO Y， et al. Porcine epidemic diarrhea virus inhibits dsRNA-induced interferon-β production in porcine intestinal epithelial cells by blockade of the RIG-I-mediated pathway[J]. Virology Journal， 2015， 12： 127.

[16]DING Z， FANG L， JING H， et al. Porcine epidemic diarrhea virus nucleocapsid protein antagonizes beta interferon production by sequestering the interaction between IRF3 and TBK1[J]. Journal of Virology， 2014， 88（16）： 8936-8945.

[17]XING Y L， CHEN J F， TU J， et al. The papain-like protease of porcine epidemic diarrhea virus negatively regulates type Ⅰ interferon pathway by acting as a viral deubiquitinase[J]. Journal of General Virology， 2013， 94（7）： 1554-1567.

[18]ZHANG Q Z， SHI K C， YOO D W. Suppression of type Ⅰ interferon production by porcine epidemic diarrhea virus and degradation of CREB-binding protein by nsp1[J]. Virology， 2016， 489： 252-268.

[19]ZHU X Y， FANG L R， WANG D， et al. Porcine deltacoronavirus nsp5 inhibits interferon-β production through the cleavage of NEMO[J]. Virology， 2017， 502： 33-38.

[20]李紅杰，王曉雪，高冬生，等. 豬流行性腹瀉病毒Nsp7的亞細(xì)胞定位和對(duì)Ⅰ型干擾素應(yīng)答的影響[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2017， 48（3）： 501-507.

（責(zé)任編輯：徐 艷）

收稿日期：2020-09-15

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31772701）;江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目[CX（17）3027]

作者簡(jiǎn)介：丁芳藝（1995-），男，江西上饒人，碩士，主要從事畜禽疫病防控方向的研究。（E-mail）dingfy0526@163.com。宋海鑫為共同第一作者。

通訊作者：張金秋，（E-mail）jqzh03@126.com