基于網(wǎng)絡(luò)藥理學的苦參-蒼術(shù)藥對治療痔瘡作用機制研究

馬轉(zhuǎn)霞，顧志榮，孫嵐萍，張 銳，呂 鑫，許愛霞，葛 斌*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學 藥學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000)

痔瘡，是臨床上最常見的肛腸疾病，包括內(nèi)痔、外痔與混合痔。有關(guān)普查資料表明，肛門、直腸疾病的發(fā)病率為59.1%，痔占所有直腸疾病的87.25%，占所有肛腸疾病的52.19%[1]，主要臨床表現(xiàn)為便血、脫肛、肛門不適、潮濕瘙癢或異物感。任何年齡都可發(fā)病，其中20～40歲的中青年最為多見，并隨著年齡的增長病情逐漸加重，一般女性患痔瘡的比例大于男性[2]。中醫(yī)藥在治療痔瘡方面具有毒副作用小、安全可靠、療效確切，且在術(shù)后止痛方面具有較大的優(yōu)勢。

藥對又稱“對子”、“對藥”和“姐妹藥”，是方劑最小的組成單位，具備了方劑的基本功能主治[3]。早在春秋戰(zhàn)國時期《雷公藥對》就有記載，其指兩味中藥配伍，可起到增強療效降低毒性的作用。苦參性寒，味苦，可清熱燥濕止癢以治病之本，蒼術(shù)性溫，味辛苦，可祛風燥濕祛濁以治病之標。兩藥合用，以達標本同調(diào)、表里同治的目的。網(wǎng)絡(luò)藥理學是一種基于復雜網(wǎng)絡(luò)觀點從系統(tǒng)水平來闡述多成分、多靶點、多通路的潛在作用機制，為中藥系統(tǒng)的研究提供思路與方法[4]。本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法預測苦參-蒼術(shù)藥對治療痔瘡的作用靶點和信號通路，為其深入研究及臨床應用提供參考。

1 方法

1.1 苦參-蒼術(shù)藥對活性成分及其作用靶點的篩選

應用TCMSP分析平臺，以“苦參”、“蒼術(shù)”為關(guān)鍵詞進行檢索，設(shè)定閾值口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)≥15%；類藥性(Drug like，DL)≥0.15，篩選苦參、蒼術(shù)的活性成分。在Related targets模塊中整理相關(guān)活性成分作用靶點，借助UniProt(Universal protein resource，UniProt)數(shù)據(jù)庫中UniProtKB搜索功能查找所有作用靶點的基因名，將其校正為官方名稱(Official symbol)。

1.2 疾病-藥對-活性成分-關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過GeneCards、OMIM、Drugbank數(shù)據(jù)庫，以“Hemorrhoids”為關(guān)鍵詞進行檢索，收集整理痔瘡相關(guān)的基因靶點。運用Venny 2.1.0在線平臺將苦參、蒼術(shù)活性成分的基因靶點與痔瘡的基因靶點進行映射，交集部分即為苦參、蒼術(shù)治療痔瘡的關(guān)鍵靶點。采用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建疾病-藥對-活性成分-關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.3 關(guān)鍵靶點相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析

將關(guān)鍵靶點上傳至STRING數(shù)據(jù)庫的Multiple proteins中，限定物種為“人”，獲取蛋白相互作用信息，采用Cytoscape 3.7.1軟件繪制靶點相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖，并進行網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)分析，篩選出核心靶點。

1.4 關(guān)鍵靶點功能通路分析及靶點通路網(wǎng)絡(luò)圖的

構(gòu)建

將關(guān)鍵靶點上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫，進行GO富集分析與KEGG通路富集分析。GO富集分析項中選擇生物過程(Biological process，BP)、分子功能(Molecular function，MF)和細胞組成(Cellular component，CC)3個模塊。GO富集分析結(jié)果按Count值(降序)排序，采用Origin 2018軟件將排序前十的數(shù)據(jù)繪制成條形圖。采用Image GP在線作圖工具，選擇PValue值排序(升序)靠前的20條通路繪制氣泡圖，并采用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦參-蒼術(shù)藥對活性成分及其作用靶點的篩選

從TCMSP數(shù)據(jù)平臺中篩選出苦參、蒼術(shù)活性成分共44個(苦參31個，蒼術(shù)13個)，相關(guān)信息見表1。整理并校正后獲得苦參-蒼術(shù)44個活性成分作用靶點共665個，刪除重復項后得到233個靶點。

表1 苦參-蒼術(shù)藥對活性成分篩選結(jié)果

2.2 疾病關(guān)鍵靶點的篩選

在GeneCards、OMIM、Drugbank數(shù)據(jù)庫中收集與痔瘡相關(guān)靶點，篩去重復項得170個。將苦參-蒼術(shù)藥對活性成分的233個靶點與痔瘡相關(guān)170個靶點采用Venny 2.1.0繪制維恩圖(圖1)，得苦參-蒼術(shù)藥對治療痔瘡的關(guān)鍵靶點42個。

圖1 苦參-蒼術(shù)藥對靶點-痔瘡靶點維恩圖Fig. 1 Venn diagram of the target of S. flavescens- A. lancea herb pair and hemorrhoids

2.3 疾病-藥對-活性成分-關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)分析

運用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建疾病-藥對-活性成分-關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)(圖2)。該網(wǎng)絡(luò)中有75個節(jié)點(包括1個疾病，2個中藥，30個化學成分，42個靶點)，172條邊。節(jié)點度數(shù)(Degree)越大，則節(jié)點表示的物質(zhì)就越重要。其中槲皮素(MOL000098)、木犀草素(MOL000006)、芹菜素(MOL000008)、漢黃芩素(MOL000173)的Degree值排名靠前，說明上述成分是可能苦參-蒼術(shù)藥對治療痔瘡的重要活性成分。

2.4 關(guān)鍵靶點PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將苦參-蒼術(shù)藥對治療痔瘡的42個關(guān)鍵靶點上傳至STRING數(shù)據(jù)庫的Multiple proteins中，Organism選擇為Homo sapiens，相互評分最低設(shè)為0.900，隱藏網(wǎng)絡(luò)中離散的節(jié)點。將得到的數(shù)據(jù)以TSV格式導入Cytoscape 3.7.1軟件中，得蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)，并運用“Network analyzer”功能進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析。網(wǎng)絡(luò)中有41個節(jié)點(其中一個靶蛋白未發(fā)生蛋白相互作用)，339條邊。在網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點顏色越深，說明Degree值較大，在網(wǎng)絡(luò)中占有重要位置。Degree值較大的靶點有IL-6、TNF、VEGFA、TP53、CCL2、CXCL8，即說明上述靶點可能為苦參-蒼術(shù)藥對治療痔瘡的核心靶點。

圖2 疾病-藥對-活性成分-關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)Fig. 2 Network diagram of Disease-Herb pair-Active components-Key targets 注：圓形代表疾??；淺灰色六邊形代表中藥；深灰色六邊形代表化學成分；四邊形代表關(guān)鍵靶點

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 3 PPI Network diagram

2.5 關(guān)鍵靶點功能通路分析

將關(guān)鍵靶點上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫中進行GO富集分析和KEGG通路分析。GO富集分析包括生物過程、細胞組分和分子功能3個模塊，分別選擇Count值排序(降序)前10的項目，采用Origin 2018軟件繪制成條形圖(圖4)。其中苦參-蒼術(shù)藥對治療痔瘡的生物過程包括95種，主要涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、DNA模板轉(zhuǎn)錄、免疫反應、細胞凋亡負調(diào)控、炎癥反應等；細胞組分11種，主要涉及細胞外間隙、原生質(zhì)膜、細胞質(zhì)溶膠、細胞表面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等；分子功能13種，主要涉及細胞因子活性、序列特異性DNA結(jié)合、絲氨酸內(nèi)肽酶活性、金屬內(nèi)肽酶活性、蛋白質(zhì)同源二聚化活性等。KEGG富集結(jié)果涉及到65條通路，主要有Pathways in cancer、Proteoglycans in cancer、PI3K-Akt、Hepatitis B、Rheumatoid arthritis、Malaria等信號通路。選擇PValue值排名靠前的20條通路繪制氣泡圖(圖5)，圖中橫軸代表基因比率，縱軸為通路名稱，氣泡大小代表作用與該通路的基因數(shù)，顏色代表PValue值。

2.6 靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建與分析

采用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建靶點-通路網(wǎng)絡(luò)(圖6)，并進行拓撲參數(shù)分析。網(wǎng)絡(luò)中有69個節(jié)點，252條邊。由結(jié)果可知，苦參中的Quercetin、Luteolin、Apigenin與蒼術(shù)中的Wogonin涉及共有靶點的數(shù)目最多，表示苦參-蒼術(shù)配伍后主要是這四個活性成分來發(fā)揮藥效的。這些活性成分同時通過IL-6、TNF、TP53、CXCL8、TGFB1和NOS2等靶點，協(xié)同作用于Pathways in cancer、Proteoglycans in cancer和PI3K-Akt等信號通路發(fā)揮作用。

圖4 苦參-蒼術(shù)藥對治療痔瘡GO富集分析Fig. 4 GO enrichment analysis of S. flavescens-A. lancea herb pair in treating hemorrhoids

圖5 苦參-蒼術(shù)藥對治療痔瘡通路分析Fig. 5 Analysis of the pathways of S. flavescens-A. lancea herb pair in treating hemorrhoids

圖6 苦參-蒼術(shù)藥對靶點-通路網(wǎng)絡(luò)Fig. 6 Targets-pathways network of S. flavescens-A. lancea herb pair 注：圓形代表靶點；六邊形代表化學成分；四邊形代表通路

3 討論

中醫(yī)認為痔的發(fā)病為陰陽失調(diào)，臟腑氣血虛損，再加外邪(濕、熱、風、燥)、內(nèi)傷(情志內(nèi)傷、飲食不節(jié))等作用，致使氣血失調(diào)，絡(luò)脈阻滯，瘀血濁氣流注肛門，結(jié)聚成塊成痔[5]。其常見病癥以濕熱下注為主[6]，臨床多見局部感染、發(fā)炎、疼痛、發(fā)癢、滲血等癥狀?？鄥⒖嗪暂^強，既可清熱燥濕，使?jié)駸嶂巴獬?，又可殺蟲止癢，用于多種濕熱證；蒼術(shù)苦溫，燥濕以祛濕濁，多用于濕熱下注。研究顯示，苦參與蒼術(shù)均具有明顯的抗菌、抗炎、抗腫瘤等藥理作用[7]，此外，苦參還具有抗過敏與抑制免疫作用[8]。

疾病-藥對-化學成分-關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)圖顯示，苦參-蒼術(shù)藥對治療痔瘡的核心化合物包括Quercetin、Luteolin、Apigenin、Wogonin等。上述化合物均有抗炎、抗菌、抗病毒的作用，研究表明，Quercetin、Luteolin對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等多種細菌均有抑制作用[9-10]。Quercetin、Luteolin、Wogonin的抗炎作用主要是通過降低炎癥因子IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-β的表達，提高IL-10等抑炎因子的水平以及調(diào)控NF-κB、MAPK等信號通路來完成[11-12]，而Apigenin的抗炎活性與抑制LPS誘導的miR-155的表達[13]、抑制PMA誘導的A549細胞促炎癥細胞因子和AP-1因子有關(guān)[14]。此外Luteolin對柯薩奇B3病毒、豬傳染性胃腸炎病毒等都具有明顯的抑制作用[15]，還可抑制末梢神經(jīng)對疼痛刺激的敏感性而具有明顯的鎮(zhèn)痛作用[16]。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析及通路分析顯示，IL-6、TNF、VEGFA、TP53、CCL2、CXCL8核心靶點可能通過Pathways in cancer、Proteoglycans in cancer與PI3K-Akt等信號通路發(fā)揮作用。這些信號通路都與炎癥的發(fā)生發(fā)展乃至惡性癌變的過程高度相關(guān)[17]，血清中促炎因子IL-6、TNF高表達與痔瘡的嚴重程度呈正相關(guān)，分析原因可能是隨著痔瘡的加重，促炎因子刺激血管內(nèi)皮細胞，使其通透性增加，從而進一步加重痔瘡組織炎性水腫及促進炎性細胞浸潤[18]。TP53是一種腫瘤抑制因子，可抑制NF-κB、TLR-4和TRAF6的活化，負調(diào)控IL-6、TNF-α等炎癥因子的分泌。CCL2、CXCL8均為趨化因子，能夠趨化中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞等炎癥細胞向病變部位聚集，還可誘導IL-2、IL-6、細胞黏附分子等細胞因子合成，從而在炎癥性疾病、免疫性疾病、腫瘤等發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[19]。研究發(fā)現(xiàn)，激活PI3K-Akt信號通路，可抑制NF-κB的表達，減輕炎癥反應。此外PI3K-Akt信號通路還可通過促進Akt磷酸化激活PI3K，調(diào)控細胞生長、增殖、血管內(nèi)皮再生與物質(zhì)代謝[20]。痔是突出的靜脈團，是各種原因造成的血管病變，VEGFA作為血管生成因子家族的主要成員之一，既可促進血管內(nèi)皮細胞分裂、延長血管內(nèi)皮細胞壽命，同時增加毛細血管通透性，為血管內(nèi)皮的遷移及血管形成提供物質(zhì)基礎(chǔ)，又可活化基質(zhì)金屬蛋白酶，促進血管形成，改善病變血管[21]。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法進行探討，雖存在一定的局限性，但從整體層面分析了藥物與疾病的關(guān)系，預測了苦參-蒼術(shù)藥對治療痔瘡的核心靶點，探索其治療痔瘡的作用機制。結(jié)果顯示苦參-蒼術(shù)藥對多種活性成分通過多靶點、多通路發(fā)揮作用，這為苦參-蒼術(shù)藥對治療痔瘡的臨床及基礎(chǔ)研究提供理論參考。