HBV pgRNA定量指導(dǎo)安全停用核苷(酸)類似物的研究進展

劉 月 鄒志強

慢性乙型肝炎(CHB)及其引起的肝纖維化、肝硬化和肝細胞癌是嚴重威脅中國人群健康的疾病[1]。目前國際公認的抗乙型肝炎病毒(HBV)藥物包括(聚乙二醇)干擾素和核苷(酸)類似物(NA)兩類，后者因給藥方便、有效率高等特點而廣泛應(yīng)用于CHB患者的抗HBV治療中[2-4]。CHB是由HBV感染引起的，并且有針對病因的治療，因此理論上CHB患者的抗HBV治療是有望實現(xiàn)有限療程的。美國肝臟研究學(xué)會(AASLD)、歐洲肝臟研究協(xié)會(EASL)、亞太肝臟研究協(xié)會(APASL)、中國的CHB防治指南中都明確指出了無肝硬化患者的停藥標準，然而在臨床實踐中，一旦停藥，有一部分患者會出現(xiàn)HBV DNA的突破。目前已知共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)的完全衰退提示HBV的消除，是一種接近CHB治愈的狀態(tài)[5]。雖然NA可有效抑制HBV復(fù)制，但不能直接作用于cccDNA，很難實現(xiàn)CHB的臨床治愈[6-7]。因此，大多數(shù)CHB患者需要長期治療。本文就HBV pgRNA定量用于指導(dǎo)安全停用NA的研究進展作一綜述。

1 HBV DNA及HBsAg用于指導(dǎo)NA安全停用的局限性

為了避免HBV DNA反彈，在停止NA治療前確定肝內(nèi)cccDNA沉默或消除是必要的。但在臨床實踐中，由于檢測cccDNA需應(yīng)用侵入性檢查，因此定期檢測肝內(nèi)cccDNA水平并不可行[8-9]。既往研究表明，血清HBV DNA和HBsAg水平均與肝內(nèi)cccDNA活性呈正相關(guān)，HBV DNA被廣泛用于判斷患者病毒學(xué)應(yīng)答、療效觀察及鞏固治療后停藥的重要指標[10]。然而，在NA治療過程中，血清HBV DNA消失可能并不代表肝內(nèi)cccDNA被清除或處于轉(zhuǎn)錄沉默狀態(tài)[11]。當(dāng)將持續(xù)消失的血清HBV DNA作為NA停藥的前提條件時，與經(jīng)常出現(xiàn)的治療外HBV DNA反彈和疾病復(fù)發(fā)不同，對于已達到HBsAg消失的患者，無論有無抗HBs血清轉(zhuǎn)換，復(fù)發(fā)都是相當(dāng)罕見的[12]。因此，血清HBsAg的消失已被認定為抗HBV治療的理想終點[2]。近年來HBsAg定量檢測方法已經(jīng)商業(yè)化，并且被廣泛用于抗HBV有效性的預(yù)測和對HBV感染的初治患者的管理[13]。但有研究顯示，HBsAg消失10年后，約14%的患者肝臟中仍可檢測出cccDNA[2]。許多因素可能是將血清HBsAg作為經(jīng)NA長期治療患者肝內(nèi)cccDNA轉(zhuǎn)錄活動的替代指標的障礙，如HBV DNA整合組，以及NA長期治療相關(guān)的HBsAg滯留等問題。盡管目前抗HBV藥物層出不窮，但血清HBsAg消失仍很難實現(xiàn)[13]。如將血清HBsAg持續(xù)消失作為功能性治愈或臨床治愈的判定標準，可能會使一些患者繼續(xù)接受不必要的抗病毒治療[11]。因此，臨床上亟需能夠提示安全停用NA的指標。

2 血清HBV RNA的存在形式及來源

1990年代初的一些研究顯示，HBV感染患者外周血單核細胞中可測得HBV RNA[14-17]，然而直到1996年，K?ck等[18]才首次在HBV感染患者的血清中發(fā)現(xiàn)血清HBV RNA。Wang等[19]和Jansen等[20]發(fā)現(xiàn)HBV感染患者血清中的HBV RNA實質(zhì)上是核衣殼內(nèi)未經(jīng)轉(zhuǎn)錄的HBV前基因組RNA(pgRNA)，來自感染肝細胞內(nèi)cccDNA的轉(zhuǎn)錄。這些含有未經(jīng)轉(zhuǎn)錄pgRNA的核衣殼也可獲得病毒外膜，并可以病毒樣顆粒形式釋放。

3 HBV pgRNA與 cccDNA的關(guān)系

HBV屬嗜肝DNA病毒科(hepadnabitidae)，是一種雙鏈環(huán)狀DNA。HBV通過將肝細胞膜上的鈉離子/?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運蛋白(NTCP)作為受體進入肝細胞[2]。HBV進入肝細胞后，首先脫去外膜，HBV DNA雙鏈形成松弛環(huán)狀DNA(rcDNA)，rcDNA進入細胞核，在細胞核中轉(zhuǎn)化為cccDNA，cccDNA作為微型染色體持續(xù)存在，并且為5種病毒mRNA的轉(zhuǎn)錄提供模板，其中3.5 kb的pgRNA也為HBV DNA負鏈的逆轉(zhuǎn)錄提供模板。HBV DNA聚合酶與pgRNA的結(jié)合提供了包裝信號，隨后使用核心蛋白組裝病毒衣殼。其后衣殼化的pgRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生病毒DNA的負鏈，并且正鏈DNA不完全由負鏈DNA合成。新合成的rcDNA被病毒表面蛋白包圍，并被釋放成Dane顆粒，或者重新進入細胞核以補充cccDNA池[12]。cccDNA半衰期較長，難以從體內(nèi)徹底清除，對慢性HBV感染起著重要作用[2]，由于cccDNA定量需要侵入性檢查，因此探索能反映cccDNA活性的替代檢測指標很重要。HBV通過pgRNA逆轉(zhuǎn)錄形成cccDNA，pgRNA也可由cccDNA轉(zhuǎn)錄生成，與HBsAg不同，HBV pgRNA僅來自于肝內(nèi)cccDNA，并且其數(shù)量不受病毒抗原或抗體復(fù)雜性的影響。因此，血清pgRNA水平能反映cccDNA的狀態(tài)，包括cccDNA的水平及其轉(zhuǎn)錄活性[13,20-21]。

4 HBV pgRNA可預(yù)測HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換

長期的病毒抑制表現(xiàn)為HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，可誘導(dǎo)一部分患者的病毒免疫抑制[22-23]。有研究表明NA治療可幫助超過60%的患者在治療后1年實現(xiàn)HBV DNA不可測得，少數(shù)患者能實現(xiàn)血清學(xué)應(yīng)答(HBeAg和HBsAg消失，有或無相應(yīng)抗體)[24]。即使HBV DNA維持在不可測得水平，也很難預(yù)測是否患者有血清學(xué)應(yīng)答。有研究通過比較發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換組與未發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換組的血清HBV RNA水平，發(fā)現(xiàn)后者的血清HBV RNA水平升高,同時發(fā)現(xiàn)治療前血清HBV RNA水平低于4.12log10copies/mL的CHB患者更易實現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換[25]。另有研究也發(fā)現(xiàn)在NA治療期間，與其他患者相比，HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的患者的HBV RNA顯著下降[21]。血清HBV pgRNA陽性患者不能實現(xiàn)HBeAg清除的風(fēng)險更高(HR=6.69，95%CI：1.88～23.84)[26]。上述結(jié)果提示血清HBV pgRNA是一個可在NA治療中預(yù)測HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的獨立指標。

5 HBV pgRNA有潛力作為NA安全停用的預(yù)測指標

pgRNA是cccDNA的直接產(chǎn)物，其能反映肝內(nèi)cccDNA的活性，并且阻斷逆轉(zhuǎn)錄不影響HBV pgRNA的合成。有研究發(fā)現(xiàn)，在NA治療期間，因NA干擾逆轉(zhuǎn)錄，會導(dǎo)致HBV RNA顆粒過度累積在肝細胞中，并且導(dǎo)致沒有逆轉(zhuǎn)錄顆粒的釋放；此外，還發(fā)現(xiàn)HBV RNA顆粒的存在與耐藥有關(guān)，認為血清HBV RNA顆粒的存在可能與HBV復(fù)制活動有關(guān)，并且有高復(fù)制活動的病毒產(chǎn)生大量HBV RNA，更易導(dǎo)致耐藥突變株的產(chǎn)生，因此推測血清HBV RNA水平可能與HBV復(fù)制活動有關(guān)[27]。有研究顯示，治療12周時血清HBV pgRNA是最初病毒學(xué)應(yīng)答的一項新的預(yù)測指標，并且是除HBV DNA水平外唯一獨立的最初病毒學(xué)應(yīng)答治療預(yù)測指標，同時證明了在治療中(12周)血清HBV DNA和pgRNA水平可能可以預(yù)測HBV的重新激活[28]。另有研究評估了恩替卡韋治療前后的患者血清HBV RNA，結(jié)果顯示治療期間實現(xiàn)病毒學(xué)應(yīng)答的患者的血清HBV RNA水平明顯降低，這表明血清HBV pgRNA水平可預(yù)測病毒學(xué)應(yīng)答[26]。作為直接反映肝內(nèi)cccDNA水平的替代指標，血清HBV pgRNA水平是評估抗病毒治療有效性的指標之一，其也可用于預(yù)測停藥后的耐藥和復(fù)發(fā)[19-21,27,29]。研究表明，在終止NA治療的患者中有超過70%出現(xiàn)肝炎重新活動；多種邏輯回歸分析顯示，NA治療3個月后血清HBV DNA+RNA水平與HBV DNA反彈有關(guān)，還發(fā)現(xiàn)NA治療3個月后，與HBV DNA非反彈組相比，HBV DNA反彈組的血清HBV DNA+RNA水平較高, HBV DNA反彈組在NA治療期間維持著高HBV復(fù)制活動，與HBV RNA基因組相關(guān)的非成熟HBV顆粒不斷產(chǎn)生并在肝細胞中累積，治療終止后，這些非成熟HBV顆?？赡艹墒觳⑨尫?，因此血清HBV DNA水平反彈在NA治療后迅速發(fā)生[27]。有研究顯示目前可檢測到的血清中HBV RNA為pgRNA[19]。上述研究結(jié)果表明，血清中HBV pgRNA水平可能與HBV DNA反彈有關(guān)。由此推測，如在NA停藥前檢測血清中的HBV pgRNA水平對患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險進行預(yù)判，將有助于甄別出那些已達到病毒學(xué)應(yīng)答并在停藥后能維持病毒學(xué)應(yīng)答的“部分治愈”患者，從而實現(xiàn)安全停藥[11]。血清HBV pgRNA水平在停藥原則和耐藥及病毒復(fù)發(fā)的預(yù)測上具有重要意義。但因不同研究團隊采用的檢測方法不完全相同，因此目前將血清HBV pgRNA作為安全停用NA的預(yù)測指標尚需更多大樣本的研究來證明。

6 小結(jié)

HBsAg既來自于cccDNA，也來自于整合基因組，HBsAg和HBV DNA不能完整代表cccDNA的轉(zhuǎn)錄活動。HBV RNA已知為pgRNA，僅來自cccDNA，可以反映cccDNA活性，結(jié)合對HBV pgRNA的全面了解，血清HBV pgRNA可能可以作為CHB患者安全終止NA治療的指標。今后還需大樣本臨床研究來證明HBV pgRNA指導(dǎo)NA安全停藥的可行性。