斑馬魚在心血管病治療藥物篩選研究中的應(yīng)用

胡楊兮 油紅敏 任昌振 張艷達(dá) 梁春

1 概述

斑馬魚(zebrafish)又名藍(lán)條魚、花條魚、印度魚，屬輻鰭魚綱鯉形目鯉科，多生活于中亞和南亞的熱帶地區(qū)。斑馬魚成魚身體呈紡錘形，長度為3～5 cm，頭尖吻短，因體表有銀白或金黃與藍(lán)色相間排列的花紋，形似斑馬而命名。斑馬魚作為一種新型的模式動(dòng)物，廣泛應(yīng)用于組織發(fā)育[1]、心血管系統(tǒng)疾病[2]以及腫瘤[3]等領(lǐng)域的研究。相比其他經(jīng)典的模型動(dòng)物，斑馬魚有獨(dú)特優(yōu)勢：(1)性成熟周期短，產(chǎn)卵量大。斑馬魚性成熟約3個(gè)月，母魚每周產(chǎn)卵達(dá)200枚。(2)可視性好。斑馬魚胚胎及幼魚通體透明，便于活體觀察心臟、血管的實(shí)時(shí)狀態(tài)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。(3)轉(zhuǎn)基因魚系豐富?？蒲腥藛T通過基因編輯技術(shù)構(gòu)建了多種心血管系統(tǒng)組織特異性的熒光魚系，如Tg(fli1∶EGFP) 轉(zhuǎn)基因魚系用綠色熒光標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞、Tg(myl7∶EGFP)魚系用綠色熒光標(biāo)記心肌細(xì)胞、Tg(gata1∶mcherry)魚系用紅色熒光標(biāo)記紅細(xì)胞等，極大提高了斑馬魚在心血管系統(tǒng)發(fā)育和疾病研究中的地位。心血管病治療藥物的研發(fā)需要進(jìn)行短周期、高通量的篩選。許多藥物需要在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為有效的活性形式才能發(fā)揮作用，經(jīng)典的小鼠等動(dòng)物模型和細(xì)胞模型不能滿足篩選研究的需要。2008年Yu等[4]利用斑馬魚模型篩選出激活素受體樣激酶(Alk)的第一個(gè)小分子拮抗劑多索嗎啡(Dorsomorphin),其可以作用于血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)受體，從而阻斷血管生成[5]。轉(zhuǎn)基因斑馬魚體量小、繁殖快及可視性等特點(diǎn)，使其成為在體藥物篩選研究的優(yōu)選[6]。

2 斑馬魚與心血管病治療藥物篩選研究

2.1 血管新生調(diào)節(jié)藥物的篩選

斑馬魚模型在血管新生調(diào)節(jié)藥物的篩選研究中廣泛應(yīng)用，在篩選有效藥物的同時(shí)也發(fā)現(xiàn)眾多精準(zhǔn)調(diào)控斑馬魚血管發(fā)生的小分子及其相應(yīng)受體介導(dǎo)的信號通路。較常用的是以熒光蛋白標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因魚系Tg(fli1∶EGFP)和Tg(fli1∶nEGFP)等。有研究者利用藥物干擾斑馬魚血管新生過程，再對促進(jìn)血管損傷修復(fù)的藥物進(jìn)行篩選，如利用酪氨酸酶抑制劑誘導(dǎo)幼魚血管損傷后，用黃芪多糖處理可以顯著修復(fù)損傷[7]。利用Tg(fli1∶EGFP)、Tg(fli1∶nEGFP)魚系對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮[8]和降香提取物[9]通過上調(diào)VEGF受體表達(dá)，促進(jìn)幼魚血管新生和節(jié)間血管損傷修復(fù)。Liu等[10]對用地黃提取物處理Tg(fli1∶EGFP)胚胎的腸下血管(SIV)新生長度和出芽數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)地黃提取物中的二氯甲烷、咖啡酸等物質(zhì)也具有促進(jìn)血管新生的作用。知母皂苷BⅡ具有促血管新生和修復(fù)受損血管的作用，其機(jī)制可能是使VEGF受體和促炎性細(xì)胞因子(如白細(xì)胞介素-6)的表達(dá)上調(diào)[11]。

利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚可以對成分復(fù)雜的中藥方劑進(jìn)行快速篩選研究。Tse等[12]發(fā)現(xiàn)地黃與黃芪配伍可通過上調(diào)VEGF-A及類激酶插入?yún)^(qū)受體(Kdrl)的表達(dá)，促進(jìn)幼魚節(jié)間血管過度生長。麝香保心丸有效成份之一的肉桂醛可部分改善由VEGF受體抑制劑瓦他拉尼二鹽酸鹽誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚節(jié)間血管的缺失[13]。

2.2 調(diào)脂藥物的篩選

斑馬魚的脂質(zhì)代謝過程與哺乳動(dòng)物相似，高膽固醇飲食可誘導(dǎo)斑馬魚的脂蛋白氧化、血管內(nèi)脂質(zhì)堆積、免疫細(xì)胞遷移等早期動(dòng)脈粥樣硬化征象。利用斑馬魚構(gòu)建脂代謝紊亂的疾病模型可用于高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病等的機(jī)制研究和藥物篩選。Han等[14]報(bào)道小檗胺可以顯著降低高膽固醇飲食斑馬魚的血漿脂肪含量，伊折麥布則可顯著改善脂質(zhì)在斑馬魚血管內(nèi)的堆積[15]。Littleton等[16]利用脂代謝紊亂斑馬魚幼魚模型發(fā)現(xiàn)山楂葉和山楂花可明顯降低斑馬魚血漿低密度脂蛋白水平，抑制膽固醇的吸收，提高心輸出量。用枇杷葉提取物處理脂代謝紊亂斑馬魚模型后發(fā)現(xiàn)斑馬魚血漿中總膽固醇和三酰甘油水平降低，提示枇杷葉有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃和月桂的水提取物也可抑制斑馬魚膽固醇酯和低密度脂蛋白活性[18]，進(jìn)而抑制動(dòng)脈粥樣硬化和糖尿病的進(jìn)展。除了檢測血脂，還可以通過其他方法探究藥物對斑馬魚脂代謝的影響。如制首烏及大黃素還可顯著降低斑馬魚的體質(zhì)量、體長，并減輕肝臟中的脂質(zhì)沉積，其機(jī)制可能是通過上調(diào)磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、絲氨酸/蘇氨酸激酶2(AKT2)、一磷酸腺苷激活的蛋白激酶α(AMPKα)、過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1a(CPT-1a)和?；o酶A氧化酶1(ACOX1)的表達(dá)，從而減少肝臟脂質(zhì)合成[19]。白藜蘆醇雖然未明顯改變斑馬魚血漿中脂質(zhì)含量和體質(zhì)量、體長，但能明顯改善肝臟脂肪浸潤，提示其可能存在長效調(diào)脂作用[20]。

2.3 抗炎藥物的篩選

許多心血管病與炎性反應(yīng)密切相關(guān)，如動(dòng)脈粥樣硬化、血管炎以及結(jié)締組織病的心血管系統(tǒng)病變等。目前已構(gòu)建大量特異熒光標(biāo)記炎性細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因魚系模型[21]，如用綠色熒光標(biāo)記中性粒細(xì)胞的Tg(lyz∶EGFP) 轉(zhuǎn)基因魚系、用紅色熒光標(biāo)記巨噬細(xì)胞的Tg(coro1a∶mCherry)魚系等，可實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)觀察在心肌細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷后發(fā)生炎性反應(yīng)，或使用抗炎藥物后對特定炎性細(xì)胞的分化、分布等方面的影響。Luo等[22]對熒光標(biāo)記中性粒細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的Tg(lyz∶EGFP;flk1∶mCherry)轉(zhuǎn)基因魚系喂養(yǎng)高膽固醇飲食，證實(shí)高膽固醇飲食誘導(dǎo)斑馬魚的血管內(nèi)皮炎性反應(yīng)早于血管內(nèi)中性粒細(xì)胞的募集和脂質(zhì)沉積，且在動(dòng)脈粥樣硬化的初始階段中性粒細(xì)胞募集早于脂質(zhì)沉積。另外，用脂多糖處理斑馬魚胚胎可構(gòu)建急性炎性反應(yīng)斑馬魚模型。Fan等[23]利用綠色熒光標(biāo)記中性粒細(xì)胞、紅色熒光標(biāo)記巨噬細(xì)胞的Tg(coro1a∶mCherry;lyz∶dsRed) 轉(zhuǎn)基因魚系構(gòu)建急性炎性反應(yīng)模型，并對斑馬魚尾鰭進(jìn)行部分切除，發(fā)現(xiàn)毛竹黃酮處理的斑馬魚模型的切口處中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的募集顯著減少。研究發(fā)現(xiàn)，利用特異熒光標(biāo)記淋巴中性粒細(xì)胞和心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因魚系，在反復(fù)發(fā)生冷凍損傷后心肌恢復(fù)能力降低，這與中性粒細(xì)胞的募集增強(qiáng)和再生心肌細(xì)胞早期增殖和去分化減少有關(guān)[24]。組胺在多種炎性反應(yīng)中大量釋放，有研究發(fā)現(xiàn)用組胺H1受體拮抗劑處理用特異熒光標(biāo)記心肌細(xì)胞的Tg(cmlc2∶mCherry)轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎，可引起胚胎心臟早期發(fā)育異常[25]。還有研究發(fā)現(xiàn)干巴菌主要成分之一的菌絲體鋅多糖-2(MZPS-2)可清除斑馬魚模型的自由基，減少由炎性反應(yīng)引起的活性氧的生成，并抑制中性粒細(xì)胞向損傷部位的聚集。

2.4 抗心肌損傷藥物的篩選

Li等[26]將用特異熒光標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞的Tg(kdrl∶mCherry)和用特異熒光標(biāo)記心肌細(xì)胞的Tg(myl7∶GFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚暴露于擬除蟲菊酯殺蟲劑溴氰菊酯，聯(lián)用褪黑素和丹參酮ⅡA磺酸鈉可以顯著減輕溴氰菊酯引起的心血管毒性和睡眠喚醒，同時(shí)相關(guān)基因的表達(dá)恢復(fù)到正常水平。酒精可引起斑馬魚胚胎體長縮短和心臟水腫，而白藜蘆醇對酒精引起的斑馬魚胚胎心臟有保護(hù)作用[27]。阿霉素對斑馬魚心臟收縮力和心率有明顯的負(fù)性作用，可導(dǎo)致斑馬魚胚胎心臟出血，心搏減弱甚至停跳；丹參的天然產(chǎn)物二氫丹參酮可減輕阿霉素對斑馬魚幼魚的心臟毒性，提高心臟收縮功能、促進(jìn)尾靜脈血流[28]。

2.5 其他心血管病治療藥物的篩選

在抗血栓藥物篩選方面，利用花生四烯酸可在綠色熒光標(biāo)記血紅蛋白的Tg(LCR∶EGFP)斑馬魚上建立血栓模型。Qi等[29]發(fā)現(xiàn)丹紅注射液的主要成分(丹參、紅花、迷迭香酸和對香豆酸等)均有抗血栓形成作用。Sheng等[30]利用苯肼在綠色熒光標(biāo)記成熟血小板的Tg(CD41∶EGFP)和Tg(LCR∶EGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚上建立血栓模型，發(fā)現(xiàn)通脈的主要化學(xué)成分——隱丹參酮具有顯著的抗血栓作用。Zuo等[31]利用苯肼誘導(dǎo)的斑馬魚血栓模型，發(fā)現(xiàn)丹參可直接與凝血途徑調(diào)控靶點(diǎn)中的凝血酶、凝血因子Ⅹa和環(huán)氧合酶-1發(fā)生反應(yīng)，而川芎可以特定的比例與丹參配伍，發(fā)揮協(xié)同抗血栓作用。在抗心律失常藥物篩選方面，Liu等[32]利用特非那定在Tg(cmlc2∶GFP)斑馬魚胚胎上建立心律失常模型，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)心顆粒中提取的人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、三七皂苷R1、黨參炔苷和黨參提取物L(fēng)obetyolinin等化合物具有抗心律失常作用。

多種藥物可通過誘導(dǎo)心肌損傷構(gòu)建心力衰竭斑馬魚模型。異丙腎上腺素誘導(dǎo)的慢性心力衰竭模型中斑馬魚出現(xiàn)心率降低，心室腔面積增大，射血分?jǐn)?shù)降低和心包水腫[33]。利用特定濃度的阿奇霉素處理斑馬魚胚胎3 d后，胚胎可出現(xiàn)心率降低和心輸出量減少[34]，而雷公藤紅素處理的斑馬魚胚胎會(huì)發(fā)生心臟畸形及出血[35]。Huang等[36]發(fā)現(xiàn)馬兜鈴酸可使幼魚心臟肌節(jié)聚集、肌纖維破壞和內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量減少，從而使幼魚出現(xiàn)心率減低、循環(huán)減慢或停止、血管淤血水腫等。

3 小結(jié)

斑馬魚模型極大地推動(dòng)了心血管病藥物的高通量篩選研究。利用斑馬魚模型進(jìn)行藥物篩選研究的規(guī)模大，效率高，成本低，有巨大的應(yīng)用潛力。目前基于斑馬魚模型建立的心血管病治療藥物篩選平臺的應(yīng)用多集中于血管新生、脂代謝、心臟毒性等方面，而心律失常、心肌代謝病、高血壓等疾病的斑馬魚模型和治療藥物篩選平臺還有待完善。另外，現(xiàn)階段利用斑馬魚模型進(jìn)行藥物篩選時(shí)一般是將藥物溶于培養(yǎng)水，無法精確定量個(gè)體攝入量和血藥濃度，可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏倚。