壬基酚在SD大鼠內(nèi)分泌腺、胃、心臟、肝臟、腎臟和血清的分布與消除

張鈺婕，顏婷，楊警，俞捷，楊雪峰，張建玲，蔣智鋼,#，許潔,*

1. 遵義醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，遵義 563000 2. 貴州省畢節(jié)市織金縣疾病預(yù)防控制中心，畢節(jié) 551700 3. 遵義醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院胃腸外科，遵義 563000

壬基酚(nonylphenol, NP)是壬基酚乙氧基酸的降解物，經(jīng)口暴露是NP的主要暴露途徑[1]，進(jìn)入人體后能模擬天然雌激素的作用，干擾正常的內(nèi)分泌功能，還有致癌、致畸和致突變的作用。NP具有脂溶性，能夠在脂肪組織中蓄積。它被廣泛用于制造奶瓶、罐頭盒子及食品包裝袋等的內(nèi)壁涂層和塑料制品，這些化合物具有較高的親脂性，極易通過食品尤其是脂肪含量高的食品進(jìn)行遷移，直接影響人體健康[2]。因此研究NP經(jīng)消化道攝入后的分布與清除具有重要意義。目前已有關(guān)于NP清除與分布的研究，Geens等[3]研究發(fā)現(xiàn)，NP在人肝臟中濃度最高，其次是腦和脂肪組織。有文獻(xiàn)表明，NP在大西洋鮭魚體內(nèi)主要排泄途徑是膽汁[4]。曹向可等[5]的結(jié)果顯示，雌性大鼠經(jīng)消化道攝入NP后，在各組織中NP含量為卵巢>子宮>肝>腎>血清。Green等[6]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)口攝入的NP高達(dá)80%被迅速吸收，經(jīng)肝臟代謝，大多數(shù)排泄物在膽汁，24 h排泄基本完成。還有研究發(fā)現(xiàn)，SD大鼠經(jīng)消化道攝入NP后，NP主要分布于實(shí)質(zhì)性器官中，經(jīng)肝臟清除，食物可以減緩NP的代謝[7]。但是這些研究普遍存在灌胃劑量低、觀察時(shí)間短的問題。經(jīng)查閱文獻(xiàn)和體表面積計(jì)算得到NP對(duì)大鼠灌胃的半數(shù)致死劑量(LD50)約為1 445 mg·kg-1[8]，本課題組前期對(duì)大鼠體內(nèi)NP的研究表明，NP染毒劑量相對(duì)較低時(shí)也具有生物蓄積性[9]。在上述研究的基礎(chǔ)上綜合考慮，本研究加大NP染毒劑量，約取LD50的3/10 (400 mg·kg-1)作為此次實(shí)驗(yàn)的染毒劑量，并延長(zhǎng)觀察時(shí)間至120 h，希望能更加全面準(zhǔn)確地了解NP在機(jī)體內(nèi)的代謝特征，為進(jìn)一步研究NP對(duì)機(jī)體造成的影響以及如何降低NP對(duì)機(jī)體的影響提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

液相色譜儀(Agilent公司，Agilent 1100)，色譜柱EclipseXD8-C18(150 mm×460 mm，5 μm)，電子天平(上海精科天平儀器廠，F(xiàn)A2204C)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(天津泰斯特，DK-98-Ⅱ)，離心機(jī)(上海安亭，TDL-S)，旋渦混合器(海門其林貝爾，QL-901)，手持式勻漿機(jī)(杭州雷琪實(shí)驗(yàn)器材有限公司，F(xiàn)LUKO，F(xiàn)10)，制冰機(jī)(雪科，IMS-30)，正己烷和乙醚(分析純，天津科密歐)，乙腈(色譜純，Dikma Technologies公司)，冰乙酸(色譜純，天津科密歐)，NP標(biāo)準(zhǔn)品(Fluka)，純凈水(怡寶)，NP灌胃試劑(西亞)，玉米油(金龍魚)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)成年雄性SD大鼠39只，體質(zhì)量180～240 g，飼養(yǎng)條件為室溫22 ℃，隨機(jī)分為13組，每組3只，自由飲水進(jìn)食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，只給予飲水。

1.3 色譜條件

流動(dòng)相為乙腈與0.1%冰乙酸(V(乙腈)∶V(0.1%冰乙酸)=85∶15)，進(jìn)樣量10 μL，柱溫40 ℃，流速1.0 mL·min-1，F(xiàn)LD檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)275 nm，發(fā)射波長(zhǎng)312 nm。

1.4 方法與步驟

將39只大鼠隨機(jī)分為13個(gè)組，每組3只。除1組作為空白對(duì)照組外，其余各組進(jìn)行一次性400 mg·kg-1NP灌胃(NP溶于玉米油，灌胃體積5 mL·kg-1)，空白對(duì)照組按照同等灌胃體積對(duì)大鼠進(jìn)行玉米油灌胃。灌胃后0.25、0.5、1、2、4、8、12、24、48、72、92和120 h分別腹腔注射麻醉處死大鼠并摘取其內(nèi)分泌腺(甲狀腺、胸腺和腎上腺)、胃、肝臟、腎臟和心臟組織及血清保存于-20 ℃冰箱待用。

精確稱取NP標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解稀釋成9、45、90、450、900、1 800、3 600和12 000 ng·mL-1，分別進(jìn)樣10 μL，用液相色譜儀測(cè)定峰面積，以峰面積(Y)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)濃度(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程。

NP的提?。?1)分別取大鼠的內(nèi)分泌腺(甲狀腺、胸腺和腎上腺)、胃、肝臟、腎臟和心臟各0.5 g和血清0.5 mL。(2)將取好的組織0.5 g置于玻璃離心管內(nèi)，加入正己烷-乙醚提取劑(V(正己烷)∶V(乙醚)=7∶3)4 mL，用手持式勻漿機(jī)20 000 r·min-1勻漿10 s，4 000 r·min-1離心8 min，取上清液于50 ℃水浴蒸干，加0.5 mL乙腈溶解后移至進(jìn)樣瓶上機(jī)檢測(cè)。(3)將取好的血清0.5 mL，置于玻璃離心管內(nèi)，加入正己烷-乙醚提取劑(V(正己烷)∶V(乙醚)=7∶3)4 mL，置旋渦混合器混勻30 s，靜置15 min，取上清液于50 ℃水浴蒸干，加0.5 mL乙腈溶解后移至進(jìn)樣瓶上機(jī)檢測(cè)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用藥代動(dòng)力學(xué)計(jì)算軟件DAS 3.0進(jìn)行處理。

2 結(jié)果(Results)

2.1 NP在胸腺、甲狀腺和腎上腺中的濃度

以峰面積(Y)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)濃度(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出Y=16.38X-55.936，R2=0.9999，標(biāo)準(zhǔn)曲線用于后續(xù)NP在各組織的濃度測(cè)定。如圖1所示，NP在胸腺中0 h的濃度高于其他腺體，c0=2.006 mg·L-1。攝入后2～4 h吸收速率增大，在第4小時(shí)達(dá)到峰濃度，cmax=4.927 mg·L-1，是初始濃度的2倍多。最低濃度為1.412 mg·L-1，120 h時(shí)濃度為1.803 mg·L-1與初始濃度相差不大。甲狀腺中NP濃度在2 h達(dá)到峰值，較胸腺達(dá)峰時(shí)間早，cmax=3.580 mg·L-1，甲狀腺中NP吸收速度較胸腺快。在0 h腎上腺中NP濃度最低，c0=0.183 mg·L-1。在8 h達(dá)到峰濃度，cmax=3.451 mg·L-1，達(dá)峰后濃度極速下降變?yōu)?.662 mg·L-1(12 h)。

2.2 NP在胃、心臟、肝臟和腎臟中的濃度

如圖2所示，NP在胃內(nèi)的初始濃度為0.35 mg·L-1，在2 h達(dá)到峰濃度且峰濃度很大，cmax=41.4 mg·L-1。在24 h濃度降為2.88 mg·L-1，在120 h濃度降為0.53 mg·L-1。呈現(xiàn)吸收較快，達(dá)峰時(shí)間短的趨

圖1 壬基酚(NP)暴露后SD大鼠胸腺、腎上腺和 甲狀腺中NP含量-時(shí)間關(guān)系圖Fig. 1 The content-time relationship diagram for nonylphenol (NP) in SD rat thymus, adrenal gland and thyroid after NP exposure

勢(shì)。心臟、肝臟和腎臟中的NP濃度一直都較低，均在4 h達(dá)到峰濃度。cmax(心)=2.45 mg·L-1，cmax(肝)=1.41 mg·L-1，cmax(腎)=2.18 mg·L-1。在120 h胃、心臟、肝臟和腎臟內(nèi)NP濃度趨近于0。

2.3 NP在血清中的濃度

如圖3所示，血清中NP的初始濃度較低，c0=0.263 mg·L-1，在2 h達(dá)到峰濃度，cmax=1.931 mg·L-1。2～4 h內(nèi)濃度直線下降，到4 h濃度下降為1.061 mg·L-1，之后濃度變化為平緩曲線。在120 h時(shí)濃度變?yōu)?.263 mg·L-1與初始濃度相等。

2.4 NP的代謝動(dòng)力學(xué)

采用藥代動(dòng)力學(xué)軟件DAS3.0處理數(shù)據(jù)，得出NP在內(nèi)分泌腺、胃、心臟、肝臟和腎臟中的代謝動(dòng)力

圖2 NP暴露后SD大鼠胃、心、肝和腎臟中 NP含量-時(shí)間關(guān)系圖Fig. 2 The content-time relationship diagram for NP in SD rat stomach, heart, liver, kidney after NP exposure

圖3 NP暴露后SD大鼠血清中NP含量-時(shí)間關(guān)系圖Fig. 3 The content-time relationship diagram for NP in SD rat serum after NP exposure

學(xué)參數(shù)。NP在各器官中的代謝模型除肝臟符合一室模型外，其余均符合二室模型。NP在大鼠除肝臟外的各組織內(nèi)消除相半衰期(t1/2β)均為分布相半衰期(t1/2α)的10倍以上。除心臟外，自中央室向外周室轉(zhuǎn)運(yùn)速率常數(shù)(K12)均大于自外周室向中央室轉(zhuǎn)運(yùn)速率常數(shù)(K21)(表1和表2)。

2.4.1 NP在內(nèi)分泌腺及血清中代謝動(dòng)力學(xué)

NP在腎上腺組織中t1/2β=1 306 826.882 h，達(dá)峰時(shí)間(tmax)=8 h；在胸腺內(nèi)的曲線下面積(AUC0～t)=251.534 mg·L-1·h最大、平均駐留時(shí)間(MRT0～t)=53.901 h最長(zhǎng)、中央室總體清除率(CL/F)=0.522 L·kg-1·h-1最?。辉诩谞钕賰?nèi)的中央室表觀分布容積(V/F)=66.867 L·kg-1最小、達(dá)峰時(shí)間為2 h、K12=0.275 h-1、K21=0.165 h-1、MRT0～t=50.705 h；與內(nèi)分泌腺相比，血清中吸收相半衰期(t1/2Ka)=0.684 h、t1/2α=0.83 h、t1/2β=54.062 h、AUC0～t=68.646 mg·L-1·h、MRT0～t=41.148 h，均最小(表1)。

2.4.2 NP在實(shí)質(zhì)性器官中代謝動(dòng)力學(xué)

NP在胃內(nèi)的AUC0～∞=364.319 mg·L-1·h最大，MRT0～t=24.822 h卻是最小的；在心臟中，NP的t1/2Ka=2.013 h最長(zhǎng)，中央室總體清除率(CL/F)=7.228 L·kg-1·h-1最高，這可能與心臟血流豐富、蓄積的NP較多以及心臟是泵血器官易將物質(zhì)向外周擴(kuò)散有關(guān)。在肝臟內(nèi)，NP自中央室消除速率常數(shù)(K10)=0.21 h-1較大，K10越大消除越快，即NP在肝臟中消除快。NP在腎臟中的各項(xiàng)代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)數(shù)值均接近于肝臟。與實(shí)質(zhì)性器官相比，血清中MRT0～t=41.148 h是最長(zhǎng)的(表2)。

3 討論(Discussion)

NP是一種類似于雌激素的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，污染嚴(yán)重且使用廣泛。研究NP在各組織中的代謝特征，有助于發(fā)現(xiàn)NP含量與各組織相關(guān)疾病的關(guān)系。有文獻(xiàn)稱，血清NP濃度在結(jié)直腸癌組顯著高于對(duì)照組[9]。據(jù)報(bào)導(dǎo)，與健康女童樣本相比，性早熟女童樣本血清中的雙酚A(BPA)和4-NP含量明顯偏高[10]。還有研究發(fā)現(xiàn)，肝臟、腎臟、脾臟、心臟和腦部疾病風(fēng)險(xiǎn)增加與NP暴露有關(guān)[11]。

本研究表明，除心臟外K12均大于K21，說明NP易于從中央室向外周室分布。趙猛等[12]研究得出K21>K12，NP主要分布在血流豐富的組織、器官，這與本研究的結(jié)論相反，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。NP在各組織中的消除相半衰期均較長(zhǎng)，認(rèn)為NP是一種難被清除的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物。曲線下面積在胃和胸腺內(nèi)較大，說明NP在胃和胸腺吸收量較大。然而NP在胃內(nèi)的平均駐留時(shí)間最短，表明NP與胃的親和力較低。NP在腎上腺中的消除相半衰期很長(zhǎng)，即消除速度較慢。這可能提示該物質(zhì)與組織的親和度很高，可以長(zhǎng)期甚至終身駐留于體內(nèi)，而難于在機(jī)體正常代謝情況下排出體外。肝臟和腎臟中NP的各項(xiàng)代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)數(shù)值相近且NP消除較快，推測(cè)肝臟和腎臟是NP的代謝器官。有研究稱，NP在肝臟內(nèi)的代謝是以葡萄糖醛酸化合物的形式完成[13]。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，NP在肝臟和腎臟內(nèi)含量，常常是腎臟大于肝臟[14]或肝臟大于腎臟[5]。而在本次實(shí)驗(yàn)中含量相近，這可能與一次性灌胃的劑量有關(guān)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，血清中的各項(xiàng)代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)數(shù)值在所測(cè)組織中既不是最高也不是最低，這可能NP與血清親和程度中等有關(guān)?？傊琋P在胃內(nèi)分布量大，駐留時(shí)間短；在內(nèi)分泌腺內(nèi)分布量大，駐留時(shí)間長(zhǎng)。

本研究通過對(duì)39只大鼠一次性灌胃400 mg·kg-1的NP，得到NP在大鼠體內(nèi)分布與清除的相關(guān)數(shù)據(jù)并總結(jié)其代謝特征。但本研究只選用了1個(gè)濃度的NP進(jìn)行一次性灌胃，今后可進(jìn)行不同濃度梯度的NP一次性灌胃或長(zhǎng)期灌胃，并研究它們的分布與清除，以期更加了解NP的代謝規(guī)律。

表1 SD大鼠胸腺、腎上腺、甲狀腺及血清中NP代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Metabolic kinetic parameters of NP in SD rat thymus, adrenal gland, thyroid and serum

表2 SD大鼠胃、心臟、肝臟、腎臟及血清中NP代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Metabolic kinetic parameters of NP in SD rat stomach, heart, liver, kidney and serum