氮營養(yǎng)鹽對極北海帶幼苗生長和生理生化特性的影響

袁艷敏，劉福利,2，梁洲瑞,2，王 瀟,3

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用重點(diǎn)開放試驗(yàn)室，青島 266071；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家試驗(yàn)室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能試驗(yàn)室，青島 266000；3.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

近年來，海水富營養(yǎng)化和重金屬污染問題日益嚴(yán)重，對海水養(yǎng)殖業(yè)和人類健康造成極大威脅。海藻是海洋生態(tài)系統(tǒng)的初級生產(chǎn)者，利用海藻的吸收、富集和降解作用可以去除污水中的營養(yǎng)物質(zhì)、重金屬和有機(jī)毒物，具有顯著的生態(tài)環(huán)境改善效果[1]。極北海帶(Laminariahyperborea)耐低光能力極強(qiáng)，其光補(bǔ)償點(diǎn)可低至4.6 μmol/(m2·s)[2]，適于在較深的水域生長。當(dāng)前我國正在積極推進(jìn)海洋牧場建設(shè)，海藻場是決定海洋牧場效益的關(guān)鍵組成因素。由于我國近海海水透明度普遍較低，投放的人工魚礁水層較深，因光照限制很難增殖起規(guī)?；摹昂Ｔ迳帧?，而極北海帶擁有“個(gè)體大、多年生、耐低光”三大特征，可作為我國構(gòu)建海藻場的優(yōu)良藻種。

氮、磷營養(yǎng)鹽在大型海藻生長和發(fā)育過程中扮演著重要角色。研究發(fā)現(xiàn)，水體中缺乏氮、磷營養(yǎng)鹽時(shí)可嚴(yán)重影響海帶(Saccharinajaponica)配子體的形成時(shí)間和雌雄分化，在添加氮、磷營養(yǎng)鹽的人工海水中胚孢子大部分能正常形成配子體，且氮、磷的配比對海帶的發(fā)育也有一定影響[3]。孫菊燕[4]研究發(fā)現(xiàn)，在過高和過低氮、磷劑量下細(xì)基江蘺(Gracilariatenuistipitata)藻體內(nèi)藻紅素、葉綠素a、蛋白質(zhì)含量降低，生長速率明顯減慢。硝態(tài)氮質(zhì)量濃度的增加可使龍須菜(Gracilariopsislemaneiformis)藻體的色素和可溶性蛋白含量及營養(yǎng)鹽吸收速率均顯著提高，即在海水富營養(yǎng)化條件下，龍須菜的生長、生化成分和營養(yǎng)鹽的吸收都會(huì)受到影響[5]。

海藻的分布、生長、發(fā)育和繁殖等生命過程均會(huì)受到溫度、光照、營養(yǎng)鹽等環(huán)境因子的影響，尤其是海藻幼苗對各種環(huán)境因子變化相對敏感，探究幼苗生長發(fā)育的最適環(huán)境條件，對開展海藻的栽培意義重大。極北海帶幼苗在早期對環(huán)境條件(溫度、光照、營養(yǎng)鹽)的需求和響應(yīng)的研究較少，目前尚未見硝態(tài)氮對極北海帶幼苗生長、生理生化影響的報(bào)道。筆者以配子體克隆培育的極北海帶幼苗為試驗(yàn)對象，通過分析氮營養(yǎng)鹽的不同水平對極北海帶生長和生化特性的影響，研究適宜幼苗生長的最優(yōu)營養(yǎng)鹽條件，以期為極北海帶苗種生產(chǎn)、人工養(yǎng)殖及海藻場建設(shè)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用極北海帶配子體來源于法國布列塔尼半島海區(qū)，其幼苗通過配子體克隆技術(shù)培育約2個(gè)月獲得。幼苗培養(yǎng)條件為：溫度13 ℃，光合有效輻射為40～50 μmol/(m2·s)，光周期12L∶12D，天然海水經(jīng)過濾、高壓滅菌冷卻后添加營養(yǎng)鹽(PO43--P：0.4 mg/L，NO3--N：4 mg/L)作為培養(yǎng)液。

1.2 試驗(yàn)方法

選取藻體長度為3～5 cm、無褶皺損傷、無病害的健康幼苗作為試驗(yàn)材料。NO3--N質(zhì)量濃度梯度為0、0.5、2、4、6、8、10 mg/L，PO43--P：0.4 mg/L。其他培養(yǎng)條件：溫度9 ℃，光合有效輻射40 μmol/(m2·s)，光周期12L∶12D。每個(gè)處理組至少3個(gè)平行。

1.2.1 不同氮營養(yǎng)鹽質(zhì)量濃度下極北海帶幼苗相對生長速率的測定

挑選健康的極北海帶幼苗，稱量藻體鮮質(zhì)量，各氮營養(yǎng)鹽質(zhì)量濃度處理組平均體長為(3.0±0.1)～(5.0±0.1) cm、平均鮮質(zhì)量為(1.0±0.05) g。每隔3 d換水一次，10 d后稱量鮮質(zhì)量，相對生長速率(RRG)按下式計(jì)算：

RRG=[ln (mt/m0)/t]×100%

式中，m0為初始藻體的鮮質(zhì)量(g)，mt為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)藻體的鮮質(zhì)量(g)，t為試驗(yàn)持續(xù)的時(shí)間(d)。

1.2.2 生化指標(biāo)的測定

極北海帶藻體鮮質(zhì)量測定結(jié)束后，立刻用液氮將不同處理組的極北海帶幼苗速凍并儲(chǔ)存在超低溫冰箱中。本試驗(yàn)測定的生化指標(biāo)包括：色素(葉綠素a和類胡蘿卜素)、可溶性蛋白質(zhì)、超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、丙二醛、超氧陰離子。

根據(jù)文獻(xiàn)[6-7]中的方法，測定葉綠素a和類胡蘿卜素的含量，其他指標(biāo)的測定均采用酶聯(lián)免疫吸附分析法。酶聯(lián)免疫分析檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行各個(gè)指標(biāo)的測定。超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶的活性單位以U/mg表示[8]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析、Duncan多重比較及Pearson相關(guān)性分析(P<0.05為差異顯著)，用Excel軟件繪制圖形。

2 結(jié) 果

2.1 不同氮質(zhì)量濃度下極北海帶幼苗的相對生長速率

氮營養(yǎng)鹽水平對極北海帶相對生長速率有顯著影響(圖1)。2～8 mg/L是極北海帶生長的適宜氮質(zhì)量濃度，相對生長速率顯著高于其他氮質(zhì)量濃度，分別為8.50%/d～9.48%/d，該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的相對生長速率無顯著差異。氮質(zhì)量濃度為0.5、10 mg/L時(shí)，極北海帶相對生長速率分別為5.87%/d、4.75%/d，顯著低于最適宜質(zhì)量濃度，但顯著高于氮質(zhì)量濃度0 mg/L(相對生長速率為3.54%/d)，說明過高或過低的氮質(zhì)量濃度均會(huì)限制極北海帶的相對生長速率。試驗(yàn)周期內(nèi)，在不同氮質(zhì)量濃度下極北海帶藻體顏色和形態(tài)無顯著變化。

圖1 不同氮質(zhì)量濃度下處理10 d后極北海帶幼苗的相對生長速率Fig.1 The relative growth rates of young kelp L.hyperborea seedlings exposed to different nitrate nitrogen concentration for 10 days柱狀圖上的不同字母表示在0.05水平具有顯著性差異(P<0.05)，下同.The means different letters on the histogram are significant difference at the level of 0.05 (P<0.05),et sequentia.

2.2 不同氮質(zhì)量濃度下極北海帶幼苗的丙二醛和超氧陰離子含量

方差分析結(jié)果表明，氮質(zhì)量濃度的變化對極北海帶幼苗的丙二醛含量有顯著影響。培養(yǎng)液中氮質(zhì)量濃度為0和0.5 mg/L時(shí)，極北海帶幼苗丙二醛含量較高，顯著高于氮質(zhì)量濃度2～10 mg/L。氮質(zhì)量濃度為8 mg/L時(shí)，丙二醛含量最低，其他各組間均無顯著差異(圖2)。Pearson相關(guān)性分析表明，丙二醛含量與相對生長速率呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

圖2 極北海帶幼苗在不同氮質(zhì)量濃度下的丙二醛含量Fig.2 MDA content of young kelp L.hyperborea seedlings exposed to different nitrate nitrogen concentrations

氮質(zhì)量濃度變化對極北海帶幼苗的超氧陰離子含量有顯著影響。氮質(zhì)量濃度在4～10 mg/L時(shí)，超氧陰離子含量無顯著性差異且含量較低，而在低氮質(zhì)量濃度(0～0.5 mg/L)下，超氧陰離子含量顯著升高(圖3)。Pearson相關(guān)性分析表明，超氧陰離子含量與丙二醛含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，說明超氧陰離子的積累，引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而導(dǎo)致丙二醛含量上升。

圖3 極北海帶幼苗在不同氮質(zhì)量濃度下的超氧陰離子含量Fig.3 Superoxide anion content of young kelp L.hyperborea seedlings exposed to different nitrate nitrogen concentration

2.3 不同氮質(zhì)量濃度下極北海帶幼苗的可溶性蛋白含量

極北海帶幼苗可溶性蛋白含量隨著氮質(zhì)量濃度的增加呈升高趨勢?？扇苄缘鞍缀孔罡咧滴挥诘|(zhì)量濃度為6、8 mg/L時(shí)，分別為14.63、14.57 mg/g，均高于氮質(zhì)量濃度為4、10 mg/L時(shí)的含量，但無顯著性差異。0～2 mg/L氮質(zhì)量濃度組的可溶性蛋白含量顯著低于氮質(zhì)量濃度為4～10 mg/L組，且可溶性蛋白含量隨著氮質(zhì)量濃度的增加顯著升高(圖4)。Pearson相關(guān)性分析表明，可溶性蛋白含量與相對生長速率呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。

圖4 極北海帶幼苗在不同氮質(zhì)量濃度下的可溶性蛋白含量Fig.4 Soluble protein content of young kelp L.hyperborea seedlings exposed to different nitrate nitrogen concentration

2.4 不同氮質(zhì)量濃度下極北海帶幼苗的抗氧化酶(超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶)活性

氮質(zhì)量濃度變化對極北海帶幼苗超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶活性均有顯著影響，即適宜的氮質(zhì)量濃度下活性低，高氮或低氮質(zhì)量濃度下活性高。氮質(zhì)量濃度為6 mg/L時(shí)極北海帶幼苗超氧化物歧化酶活性最低，顯著低于氮質(zhì)量濃度0、0.5、8、10 mg/L，與氮質(zhì)量濃度為2、4 mg/L時(shí)無顯著差異。氮質(zhì)量濃度為10 mg/L時(shí)超氧化物歧化酶活性顯著高于0.5、2、4 mg/L。氮質(zhì)量濃度為6 mg/L時(shí)極北海帶幼苗的過氧化物酶活性最低，顯著低于氮質(zhì)量濃度0、0.5、10 mg/L。氮質(zhì)量濃度為0 mg/L時(shí)過氧化物酶活性最高，顯著高于其他各組。氮質(zhì)量濃度為10 mg/L時(shí)過氧化物酶活性顯著高于0.5 mg/L，其他各組間過氧化物酶活性無顯著性差異。極北海帶幼苗的過氧化氫酶活性在氮質(zhì)量濃度為2、4、6、8 mg/L時(shí)均較低，其中，氮質(zhì)量濃度為4、6、8 mg/L時(shí)極北海帶幼苗過氧化氫酶活性顯著低于氮質(zhì)量濃度0、0.5、10 mg/L。氮質(zhì)量濃度為2 mg/L時(shí)顯著低于10 mg/L，其他各組間無顯著性差異(圖5)。Pearson相關(guān)性分析表明，過氧化物酶與超氧化物歧化酶、過氧化氫酶均呈顯著性正相關(guān)(P<0.05)，說明三者對氮質(zhì)量濃度的變化具有相似的響應(yīng)趨勢。

圖5 極北海帶幼苗在不同氮質(zhì)量濃度下的超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶活性Fig.5 Specific activities of SOD,POD and CAT of young kelp L.hyperborea seedlings exposed to different nitrate nitrogen concentrations柱狀圖上的字母下標(biāo)為相同數(shù)字的作為同一組，進(jìn)行多重比較，同一組的不同字母表示在P<0.05水平具有顯著性差異，下同.The letters with the same number subscript on the histogram indicate the same group,and the different letters in the same group show significant difference at the level of P<0.05,et sequentia.

2.5 不同氮質(zhì)量濃度下極北海帶幼苗的色素(葉綠素a和類胡蘿卜素)含量

氮質(zhì)量濃度對極北海帶幼苗葉綠素a和類胡蘿卜素含量有顯著的影響。極北海帶幼苗葉綠素a的含量隨氮質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢，氮質(zhì)量濃度為4、6 mg/L時(shí)極北海帶葉綠素a含量無顯著性差異，均顯著高于其他質(zhì)量濃度組。氮質(zhì)量濃度為10 mg/L時(shí)極北海帶葉綠素a含量最低，顯著低于2～8 mg/L質(zhì)量濃度組，其他各組間無顯著性差異。極北海帶幼苗類胡蘿卜素含量在氮質(zhì)量濃度為4 mg/L時(shí)最高，顯著高于0、10 mg/L組，極北海帶幼苗類胡蘿卜素含量在氮質(zhì)量濃度10 mg/L時(shí)最低，顯著低于除對照外的其他氮質(zhì)量濃度組，其他各組間無顯著性差異(圖6)。

圖6 極北海帶幼苗在不同氮質(zhì)量濃度下的葉綠素a和類胡蘿卜素含量Fig.6 Chlorophyll-a and carotenoid contents of young kelp L.hyperborea seedlings exposed to different nitrate nitrogen concentrations

3 討 論

極北海帶自然分布于大西洋東北部沿岸，其分布、生長、發(fā)育及繁殖等生命過程受到溫度、光照度、營養(yǎng)鹽含量等環(huán)境因子的影響，尤其是幼苗階段對各種環(huán)境因子變化相對敏感[9]。筆者主要討論氮營養(yǎng)鹽含量對極北海帶幼苗生長和生化成分的影響，為探究極北海帶的苗種繁育、人工養(yǎng)殖和對富營養(yǎng)化水域的調(diào)控能力提供參考。

3.1 氮營養(yǎng)鹽質(zhì)量濃度對極北海帶幼苗生長的影響

氮、磷營養(yǎng)鹽在大型海藻的生長發(fā)育過程中具有重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)，氮是藻類光合器官的重要組成成分，是藻體生長的營養(yǎng)基礎(chǔ)，氮營養(yǎng)鹽的增加能夠?yàn)橐缘獮榛驹氐母鞣N蛋白和化合物的合成提供原料，氮的加富必然促進(jìn)藻體內(nèi)氮代謝反應(yīng)，從而導(dǎo)致氮同化物的積累，在氮充足的條件下，酶類、氨基酸、葉綠素、藻膽蛋白可大量合成而作為藻體的氮庫[10-13]。硝態(tài)氮增加可促進(jìn)龍須菜的生長速率，提高色素和可溶性蛋白含量[7]。水體營養(yǎng)水平較高時(shí)，龍須菜色素、蛋白質(zhì)及總氮含量均較高，且生長速度快[14]。海水總無機(jī)氮含量過低、氮磷比過高以及氨氮在總無機(jī)氮中所占比例較低等條件下，均可導(dǎo)致芋根江蘺(G.blodgettii)藻體營養(yǎng)不良、生長緩慢[15]。海帶幼孢子體生長的適宜氮營養(yǎng)鹽質(zhì)量濃度為4～8 mg/L[16]。在本試驗(yàn)中，氮質(zhì)量濃度4～6 mg/L時(shí)極北海帶幼苗的葉綠素a含量顯著高于其他各質(zhì)量濃度，氮質(zhì)量濃度2～8 mg/L時(shí)幼苗的相對生長速率均較高，氮質(zhì)量濃度4～8 mg/L時(shí)可溶性蛋白含量顯著高于其他質(zhì)量濃度組且與相對生長速率呈極顯著正相關(guān)，因此，可以推斷極北海帶生長最適宜的氮質(zhì)量濃度為2～8 mg/L，這與Kain[9]報(bào)道的歐洲沿岸野生極北海帶適宜氮含量以及我國養(yǎng)殖海帶適宜的氮含量范圍基本相同。

3.2 氮營養(yǎng)鹽質(zhì)量濃度對極北海帶幼苗生化成分的影響

植物體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)大多是酶類，參與細(xì)胞的各種代謝活動(dòng)，其含量是反映植物體總代謝的一個(gè)重要指標(biāo)[17]。超氧陰離子是活性氧的一種，植物體內(nèi)活性氧的積累會(huì)導(dǎo)致氧化脅迫，對細(xì)胞的傷害之一是啟動(dòng)膜脂過氧化連鎖反應(yīng)，使維持細(xì)胞區(qū)域化的膜系統(tǒng)受損或瓦解[18]。膜脂過氧化即非脂性自由基如超氧陰離子對類脂中不飽和脂肪酸引起的一系列自由基反應(yīng)，一般被認(rèn)為是活性氧對細(xì)胞膜系統(tǒng)傷害的原初機(jī)理，丙二醛(MDA)是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物之一，常被作為判斷膜脂過氧化的一種主要指標(biāo)[18]。弱光、高光脅迫下極北海帶幼苗體內(nèi)超氧陰離子和丙二醛含量均高于適宜光照時(shí)的含量[19]。黃鶴忠等[20]發(fā)現(xiàn)，細(xì)基江蘺繁枝變型(G.tenuistipitatavar.liui)在低硝態(tài)氮和高硝態(tài)氮的營養(yǎng)鹽水平下丙二醛含量顯著高于中等硝態(tài)氮含量組，表明過高或過低的硝態(tài)氮含量均會(huì)對江蘺的生理生長產(chǎn)生不利影響。本試驗(yàn)中，在低氮營養(yǎng)鹽質(zhì)量濃度0、0.5 mg/L時(shí)極北海帶幼苗的超氧陰離子和丙二醛含量均高于其他質(zhì)量濃度組且與丙二醛含量呈極顯著正相關(guān)，丙二醛含量與相對生長速率呈顯著負(fù)相關(guān)。因此，低營養(yǎng)鹽含量時(shí)極北海帶可能處于非最佳生理狀態(tài)，導(dǎo)致體內(nèi)超氧陰離子積累，使細(xì)胞處于氧化脅迫狀態(tài)，膜脂過氧化對細(xì)胞膜造成了一定的傷害，進(jìn)而導(dǎo)致極北海帶的相對生長速率降低。

活性氧對細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷不可修復(fù)，植物體的抗氧化系統(tǒng)使活性氧含量處于不斷產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡中。植物本身的抗氧化系統(tǒng)主要包括酶促抗氧化系統(tǒng)(超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶等)和非酶促抗氧化系統(tǒng)(抗壞血酸與類胡蘿卜素以及一些含巰基的低分子化合物等)，遭受環(huán)境脅迫時(shí)，活性氧代謝平衡被破壞，酶促和非酶促抗氧化系統(tǒng)共同作用，清除積累的活性氧，減少對細(xì)胞的損害[21-22]。試驗(yàn)表明，不同氮、磷質(zhì)量濃度對海藻的超氧化物歧化酶和過氧化物酶等抗氧化酶活性、膜脂過氧化產(chǎn)物等均產(chǎn)生顯著影響。龍須菜藻體的超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶活性隨氮磷質(zhì)量濃度的降低而逐漸升高，高氮質(zhì)量濃度下長時(shí)間培養(yǎng)時(shí)酶活性降低，抗氧化系統(tǒng)作用降低，藻體可能會(huì)面臨死亡[23]。在最適宜的營養(yǎng)鹽條件下，芋根江蘺在生化組分(光合色素及可溶性蛋白)和抗氧化能力等方面都表現(xiàn)較好，過低或過高質(zhì)量濃度的無機(jī)氮均使得丙二醛、過氧化物酶活性升高，影響藻體生長[15]。逐漸增加水體中硝態(tài)氮含量，細(xì)基江蘺繁枝變型的硝酸還原酶、超氧化物歧化酶和過氧化物酶的活性均顯著呈現(xiàn)先增后降的趨勢，且與丙二醛呈相反的趨勢[20]。本試驗(yàn)中，在低氮質(zhì)量濃度(0～0.5 mg/L)時(shí)，極北海帶幼苗的超氧陰離子水平明顯升高，此時(shí)超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶的活性均升高，尤其是過氧化物酶活性，與氮質(zhì)量濃度為0 mg/L時(shí)相比升高較明顯，表明這3種抗氧化酶尤其是過氧化物酶在清除藻體內(nèi)自由基時(shí)起著關(guān)鍵作用。而在低氮處理組中，丙二醛有較明顯的積累，表明在低氮營養(yǎng)鹽水平下抗氧化酶的作用可能受到限制。在高氮環(huán)境(10 mg/L)時(shí)，極北海帶幼苗的超氧陰離子并未表現(xiàn)出較高的水平，同時(shí)丙二醛也無明顯的積累，這可能與3種抗氧化酶活性在高氮環(huán)境時(shí)均明顯升高有關(guān)。由此推測，幼苗雖然均處于非最佳生理狀態(tài)，但高氮環(huán)境和低氮環(huán)境對極北海帶幼苗的抗氧化酶系統(tǒng)的影響并不相同。

3.3 氮營養(yǎng)鹽質(zhì)量濃度對極北海帶幼苗色素含量的影響

類胡蘿卜素是非抗氧化系統(tǒng)重要的組成部分，在所有的單線態(tài)氧猝滅系統(tǒng)中，類胡蘿卜素具有最重要的生物學(xué)意義。類胡蘿卜素存在于葉綠體內(nèi)，一方面阻止激發(fā)態(tài)葉綠素分子的激發(fā)從反應(yīng)中心向外傳遞；另一方面，它也保護(hù)葉綠素分子免遭光氧化損傷[24]。本試驗(yàn)脅迫條件為高氮和低氮?jiǎng)┝繒r(shí)，類胡蘿卜素含量均無顯著升高，表明其對氮脅迫無顯著響應(yīng)。幼苗的葉綠素a含量在4～6 mg/L時(shí)顯著高于其他各劑量組，因此極北海帶生長最適宜的氮質(zhì)量濃度為4～6 mg/L。在非最適的氮環(huán)境(高氮和低氮)時(shí)，幼苗葉綠素a含量降低，對藻體的光合作用產(chǎn)生影響，從而使幼苗生長速率降低。