高效液相色譜-分段檢測法同時(shí)測定煙草中14種多酚類化合物

歐陽璐斯，賴燕華，王 予，陶 紅，黃翼飛

(廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，廣東 廣州 510385)

多酚是煙草中一類重要的化合物，含量高達(dá)5%[1]。多酚類物質(zhì)在煙草中以糖苷和酯的形式存在，主要分為單寧類(綠原酸)、香豆素類(莨菪靈、莨菪亭、七葉亭)和黃酮類(蕓香苷)等，其中綠原酸、蕓香苷和莨菪亭是煙草中最主要的酚類物質(zhì)，綠原酸占總多酚的75%～95%[2]，其為煙草特征香味物質(zhì)的前體物[3-4]。其他含量低的多酚類化合物在煙草品質(zhì)鑒定與改善方面也有輔助影響。另一方面，卷煙煙氣中含有的簡單酚(如兒茶酚、對苯二酚等二羥基苯化合物)[5]也屬于多酚，對卷煙煙氣有害成分釋放量有顯著影響。多酚化合物含量受煙葉的種類、成熟度和加工方法等因素的影響[6]。因此，多酚化合物對煙草的生長發(fā)育、調(diào)制特性、煙葉色澤、煙氣香吃味和煙氣生理強(qiáng)度等起著重要作用[7-12]。煙草多酚類物質(zhì)的準(zhǔn)確測定，對評價(jià)煙草品質(zhì)、指導(dǎo)卷煙配方設(shè)計(jì)具有重要意義。

煙草中有些多酚的分子量較大且不易揮發(fā)，常采用高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行測定，檢測器多選擇紫外檢測器(UV)、二極管陣列檢測器(DAD)或三重四極桿質(zhì)譜儀(MS/MS)[13-16]。其中，UV檢測器的靈敏度較好，但無法靈活地實(shí)現(xiàn)多個(gè)化合物在不同波段下的檢測；HPLC-MS/MS法的靈敏度高，但需使用同位素內(nèi)標(biāo)，提高了實(shí)驗(yàn)成本；HPLC-DAD法的實(shí)驗(yàn)成本較低，且便于在各化合物的較大吸收處進(jìn)行檢測，獲得較佳的檢測靈敏度。

國內(nèi)外應(yīng)用HPLC檢測煙草中多酚類物質(zhì)已多有報(bào)道，檢測指標(biāo)以綠原酸、蕓香苷和莨菪亭等含量高的多酚化合物為主[17-18]。近幾年報(bào)道的方法逐步將新綠原酸、隱綠原酸、七葉亭、咖啡酸、山奈酚-3-蕓香糖等作為分析指標(biāo)，但仍有一些質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低的多酚類物質(zhì)被忽略。由于煙草中某些多酚化合物含量低，易受其他物質(zhì)干擾，因此選擇各目標(biāo)物的最大吸收波長作為檢測波長。DAD檢測器可實(shí)現(xiàn)多個(gè)化合物在不同波段下的檢測，而且可以更直觀地呈現(xiàn)各目標(biāo)物在最佳檢測波長下的色譜峰，大大提高工作效率。本研究采用HPLC-DAD分段式檢測建立了煙草中14種多酚類物質(zhì)的同時(shí)測定方法，為同時(shí)檢測煙葉中多種多酚類化合物提供方法參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀、Agilent SB-C18柱(3.0 mm×150 mm×1.8 μm，美國Agilent公司)；BT25S電子天平(感量：0.01 mg，最大量程：21 g，德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

新綠原酸(純度99.2%)、隱綠原酸(純度99.5%)(德國Phytolab公司)；綠原酸(純度≥95.0%)、咖啡酸(純度98.0%)、七葉亭(純度98.0%)、對香豆酸(純度≥98.0%)、莨菪亭(純度≥99.0%)、槲皮苷(純度96.0%)、山奈酚-3-O-蕓香糖苷(純度≥98.0%)(美國Sigma-Aldrich公司)；東莨菪苷(純度99.8%，美國International Laboratory公司)；阿魏酸(純度98.0%，加拿大TRC公司)、7-羥基香豆素(純度99.5%，美國ChemService公司)、蘆丁(三水合物，純度96.6%，德國Dr.Ehrenstorfer公司)、槲皮素(二水合物，純度97.0%，德國HWI Analytik GMBH公司)；甲醇(純度99.9%，色譜純，德國Merck KGaA公司)；磷酸二氫鉀(美國Aladdin 試劑公司)；Milli-Q超純水(由Millipore超純水機(jī)制備) 。

1.2 溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱量約120 mg新綠原酸、800 mg綠原酸、180 mg隱綠原酸、100 mg東莨菪苷、20 mg咖啡酸、33 mg莨菪亭、450 mg蘆丁、20 mg山奈酚-3-O-蕓香糖苷以及10 mg的七葉亭、對香豆酸、阿魏酸、槲皮苷、7-羥基香豆素和槲皮素，置于50 mL棕色容量瓶中，加入50%甲醇溶解并定容至刻度，作為混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別準(zhǔn)確移取50、100、200、400、800 μL混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至100 mL棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度，作為系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品處理

準(zhǔn)確稱取0.02 g 煙末(精確至0.000 1 g)，置于10 mL具塞玻璃管中，加入5 mL 50%甲醇，超聲萃取30 min，取上清液過0.22 μm水相濾膜，轉(zhuǎn)移至色譜瓶，進(jìn)樣分析。

1.4 色譜條件

Agilent SB-C18柱(3.0 mm×150 mm，1.8 μm)；柱溫：16 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相：0.05 mol/L磷酸二氫鉀水溶液(A)和甲醇(B)；流速：0.16 mL/min。梯度洗脫程序?yàn)椋?～10 min，3%～38%B;10～25 min,38%～47%B;25～28 min,47%～47.8%B;28～47 min,47.8%～80%B;47～50 min,80%～3%B;50～66 min，3%B。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

由于多酚類物質(zhì)中的酚羥基易氧化和電離，以甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)的分離效果差[19]。以甲醇-水為流動(dòng)相，考察了不添加以及分別以乙酸或KH2PO4為添加劑時(shí)的效果。通過實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸在流動(dòng)相不加添加劑的情況下色譜峰拖尾嚴(yán)重;以乙酸為添加劑，分別采用93%水-4.5%甲醇-2.5%乙酸和10%水-88%甲醇-2%乙酸為流動(dòng)相體系時(shí)，可實(shí)現(xiàn)綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸和東莨菪苷4種成分的最佳分離；以KH2PO4為添加劑時(shí)，采用0.05 mol/L KH2PO4和甲醇為流動(dòng)相體系，可實(shí)現(xiàn)14種多酚類化合物的基線分離。因此，實(shí)驗(yàn)選擇以0.05 mol/L KH2PO4和甲醇為流動(dòng)相。

周作人對《對話集》的深度關(guān)注，一個(gè)顯在的理由是，《路吉阿諾斯對話集》所表現(xiàn)出的“非圣無法”的“疾虛妄”的精神。這一點(diǎn)周作人已在《關(guān)于路吉阿諾斯》中略有說明，他指出這二十篇譯作的主題主要包括諷刺權(quán)力、宗教、迷信，以及哲學(xué)、財(cái)富等“人類欲望的空虛”等，一言以概之便是“疾虛妄”。作為一部譯作，《路吉阿諾斯對話集》不僅僅具有文化價(jià)值或文學(xué)價(jià)值，應(yīng)該說周作人更為看重的是它別具一格的思想價(jià)值?！堵芳⒅Z斯對話集》的思想駁雜，兼具健全的物理與深厚的人情之思想，和周作人的思想多所契合，構(gòu)成周作人的思想核心的許多關(guān)鍵詞在這里均可以找到，其中最關(guān)鍵的即是“疾虛妄”。

2.2 柱溫的選擇

考察了柱溫(10～45 ℃)對14種多酚化合物分離效果的影響。結(jié)果表明，當(dāng)柱溫為20～35 ℃時(shí)，阿魏酸與莨菪亭、7-羥基香豆素與蘆丁的分離效果不理想；當(dāng)柱溫升至45 ℃時(shí)，阿魏酸與莨菪亭、7-羥基香豆素與蘆丁實(shí)現(xiàn)了基線分離，但綠原酸出峰位置有1個(gè)分裂峰，可能是由于溫度太高導(dǎo)致綠原酸發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生其他物質(zhì)所致。柱溫高于20 ℃時(shí)，分離效果不好；但溫度過低時(shí)，易析出晶體堵塞柱子造成漏液。經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，最終確定柱溫為16 ℃，14種多酚化合物可獲得良好分離。

2.3 檢測波長的選擇

采用二極管陣列檢測器在190～550 nm波長范圍內(nèi)掃描14種多酚單標(biāo)的光譜圖。結(jié)果顯示，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、東莨菪苷、咖啡酸、七葉亭、對香豆酸、阿魏酸、莨菪亭、7-羥基香豆素、蘆丁、槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷和槲皮素的最大吸收波長分別為324、326、326、340、316、348、290、314、344、324、356、348、350、372 nm。若選擇文獻(xiàn)報(bào)道的328 nm[12]、340 nm[11]等單一檢測波長，有些目標(biāo)物無響應(yīng)或響應(yīng)很弱，導(dǎo)致檢測靈敏度降低。為此，本研究根據(jù)各目標(biāo)物的保留時(shí)間和最大吸收波長，采用分段檢測法進(jìn)行測定(見表1)。

表1 分段檢測時(shí)間表

圖1 多酚化合物混合標(biāo)準(zhǔn)品在不同檢測波長下的色譜圖

圖1給出了14種多酚化合物混合標(biāo)準(zhǔn)品在上述分段式檢測條件下的色譜圖。與328 nm[12]檢測波長相比，7號峰(對香豆酸)、14號峰(槲皮素)的信號增強(qiáng)最明顯，這是由于對香豆酸(最大吸收波長290 nm)和槲皮素(最大吸收波長372 nm)在328 nm的吸收較弱所致。4號峰(東莨菪苷)、5號峰(咖啡酸)、6號峰(七葉亭)、8號峰(阿魏酸)、9號峰(莨菪亭)、11號峰(蘆丁)、12號峰(槲皮苷)、13號峰(山奈酚-3-O-蕓香糖苷)的信號均不同程度增強(qiáng)。與340 nm[11]檢測波長相比，除4號峰(東莨菪苷)外，其他目標(biāo)物的信號均明顯增強(qiáng)。因此，選擇分段式檢測，可實(shí)現(xiàn)14種多酚類化合物的良好分離和測定。

2.4 提取溶劑與提取時(shí)間的選擇

多酚類物質(zhì)在極性有機(jī)溶劑中具有較大的溶解度，因此本實(shí)驗(yàn)考察了不同比例(30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%)甲醇/水為提取劑時(shí)對煙草中含量較高的多酚化合物(新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、東莨菪苷、咖啡酸、莨菪亭、蘆丁和山奈酚-3-O-蕓香糖苷)提取效果的影響。結(jié)果表明，甲醇比例從30%增至40%時(shí)，上述化合物的提取效率顯著提高；當(dāng)甲醇比例增至50%～60%時(shí)，提取效果最佳；甲醇比例增至70%后，提取效率逐漸下降。為減少有機(jī)溶劑用量，最終選擇50%甲醇為提取劑。

實(shí)驗(yàn)還對提取時(shí)間(10、20、30、40、50 min)進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲時(shí)間大于30 min后，多酚的提取量均趨于穩(wěn)定。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇提取時(shí)間為30 min。

圖2 煙草樣品的色譜圖

在上述實(shí)驗(yàn)條件下，得到煙草樣品的色譜圖如圖2所示，14種多酚化合物分離良好。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

采用本方法對同一煙草樣品連續(xù)進(jìn)樣分析5 d，每天測定5次，所有樣品測定結(jié)果的日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)和日間RSD均不大于6.4%。對同一個(gè)煙草樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，分別向4組樣品加入終濃度為0、5、15、30 μg/mL的14種多酚類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每組重復(fù)測定3次，計(jì)算得平均回收率為95.2%～109%。方法滿足檢測要求，可用于煙草樣品中多酚類物質(zhì)的測定。

表2 多酚化合物的線性關(guān)系、檢出限、定量下限、回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

(續(xù)表2)

2.6 實(shí)際樣品測定

應(yīng)用本方法對6個(gè)市售卷煙樣品進(jìn)行分析，每個(gè)樣品平行測定2次(見表3)。結(jié)果顯示，6個(gè)樣品中14種多酚化合物的含量差異較大，根據(jù)含量數(shù)量級可分為3類：

(1)mg/g級：綠原酸的含量最高，為3.828 3～9.251 6 mg/g；其次為蘆丁，含量為2.825 9～6.412 6 mg/g；新綠原酸、隱綠原酸的含量分別為0.794 8～1.628 9 mg/g和1.215 7～2.505 2 mg/g；

(2)102μg/g級：東莨菪苷(524.1～994.0 μg/g)、山奈酚-3-O-蕓香糖苷(295.3～525.7 μg/g)、莨菪亭(233.8～358.4 μg/g)、咖啡酸(103.3～248.6 μg/g)；

(3)101μg/g級：槲皮素(31.5～96.5 μg/g)、七葉亭(10.2～32.0 μg/g)、對香豆酸(0～38.2 μg/g)、阿魏酸(0～45.1 μg/g)、7-羥基香豆素(0～42.6 μg/g)、槲皮苷(0～37.9 μg/g)。

以上結(jié)果表明，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、東莨菪苷、咖啡酸、莨菪亭、蘆丁和山奈酚-3-O-蕓香糖苷是煙草中含量較高的8種多酚化合物；其余6種多酚化合物在部分卷煙樣品中含量極低或無法檢出。

表3 煙草樣品中多酚類物質(zhì)的平均含量(μg/g)

3 結(jié) 論

本文建立了HPLC-DAD分段檢測法同時(shí)測定卷煙中14種多酚類化合物含量的分析方法。該方法樣品和試劑用量少，前處理簡單，與傳統(tǒng)的單一檢測波長相比，分段檢測具有數(shù)據(jù)圖譜直觀、專屬性強(qiáng)、工作效率高等優(yōu)點(diǎn)，方法學(xué)指標(biāo)較好，適合于煙草樣品中多種多酚化合物的同時(shí)測定。若要探明多酚化合物與感官風(fēng)格品質(zhì)的關(guān)系，則需在本方法基礎(chǔ)上進(jìn)行大量的樣品測試和數(shù)據(jù)分析。