油菜秸稈生物炭對(duì)植煙紅壤養(yǎng)分及細(xì)菌群落多樣性的影響

況帥 段焰 劉芮 程昌新 胡志明 劉浩 何曉健 王松峰 宋文靜 叢萍

摘? 要：為了解不同用量油菜秸稈生物炭還田對(duì)土壤養(yǎng)分及細(xì)菌群落多樣性的影響，田間設(shè)置3個(gè)處理，CK：常規(guī)施肥（對(duì)照）;T1：CK+4.5 t/hm2油菜秸稈生物炭;T2：CK+9 t/hm2油菜秸稈生物炭，測(cè)定并比較了各處理的土壤pH、有機(jī)質(zhì)、速效養(yǎng)分以及細(xì)菌群落多樣性。結(jié)果表明：（1）與CK相比，T1、T2處理的020和2040 cm土壤有機(jī)質(zhì)、堿解氮、有效磷和速效鉀含量顯著提高，4060 cm土壤的顯著降低;（2）與CK相比，T1和T2土壤細(xì)菌組成更為相似，土壤OTU數(shù)目均較CK顯著增加，增幅分別為28.59%和33.82%，然而僅T2處理的細(xì)菌群落豐度和多樣性較CK增加;（3）在門水平上，土壤中相對(duì)豐度前3位的優(yōu)勢(shì)菌群與土壤有效磷和速效鉀含量呈顯著正相關(guān)。綜上所述，施用油菜秸稈生物炭可以顯著增加020、2040 cm土壤有機(jī)質(zhì)和速效氮、磷、鉀含量，增加土壤細(xì)菌群落多樣性，其中常規(guī)施肥結(jié)合施用9 t/hm2秸稈生物炭的效果更為理想。

關(guān)鍵詞：秸稈生物炭;土壤養(yǎng)分;細(xì)菌群落多樣性

Abstract： The short-term effects of different application rates of straw biochar on soil nutrients and the diversity of bacterial communities were studied in order to provide instruction for improvement of tobacco-planting soil and rational utilization of straw resources in Baoshan of Yunan province. The field experiment in 2019 was constituted of three treatments： 1） CK， conventional fertilization， 2） T1， CK+ straw biochar 4.5 t/ha， and 3） T2， CK +straw biochar 9 t/ha. The values of soil pH， organic matter， available nutrient contents and bacterial community diversity were measured and compared. The results were as follows. 1） Compared with CK， the contents of organic matter， alkeline-N， rapid available P and rapid available K were significantly increased in 0-20 cm layers but decreased in 40-60 cm layers in T1 and T2. 2） Compared with CK， the bacterial composition of T1 and T2 was more similar. The OTU numbers of both samples were significantly increased by 28.59% and 33.82%， respectively. However， the abundance and diversity of bacterial communities in T2 were higher than CK. 3）The top three dominant soil bacterial communities in relative abundance had significant positive correlation with available P and rapid available K of the soil. In a conclusion， the application amount of straw biochar can significantly improve soil fertility and diversity of bacterial communities of tobacco-planting soil， and the conventional fertilization with 9 t/ha straw biochar is better， but the interaction mechanism between soil nutrients and microorganisms after biochar application should be further studied.

Keywords： straw biochar; soil nutrient; diversity of bacterial community

生物炭是以農(nóng)作物秸稈、林業(yè)廢棄物以及禽畜糞便等有機(jī)廢棄物料為原料在高溫厭氧的條件下炭化而成，其含碳量高、容重小、孔隙度豐富、比表面積大[1]，具有較強(qiáng)的吸附性和抵抗土壤微生物分解的特性[2-3]，在改良土壤物理[4]、化學(xué)和生物學(xué)性狀[5]，提高土壤質(zhì)量、生產(chǎn)力[6]和作物產(chǎn)量，維持土壤和農(nóng)業(yè)可持續(xù)性[7-8]方面效果顯著。

近年來(lái)，我國(guó)在利用生物炭改良植煙土壤以及提高烤煙產(chǎn)質(zhì)量方面[9-10]開(kāi)展了大量研究，揭示了生物炭施入煙田后對(duì)土壤改良和烤煙產(chǎn)質(zhì)量提升的效果[11-12]。保山煙區(qū)屬于我國(guó)西南高原生態(tài)區(qū)-清甜香型煙葉產(chǎn)區(qū)[13]，2019年煙葉種植面積約2.8萬(wàn)hm2，年產(chǎn)煙葉約5725萬(wàn)kg。保山煙區(qū)植煙土壤多為酸性黏質(zhì)[14-15]，而生物炭在調(diào)控其土壤結(jié)構(gòu)方面具有顯著優(yōu)勢(shì)[16-18]，但當(dāng)前生物炭對(duì)植煙土壤有機(jī)質(zhì)、速效養(yǎng)分和微生物群落的影響研究較少。鑒于此，針對(duì)保山地區(qū)植煙土壤的酸性特點(diǎn)以及養(yǎng)分相對(duì)缺乏的狀況，本研究在煙區(qū)常規(guī)施肥的基礎(chǔ)上增施油菜秸稈生物炭，分析其對(duì)土壤養(yǎng)分和細(xì)菌微生物群落多樣性的影響，旨在為保山煙區(qū)植煙土壤改良和秸稈生物炭的合理利用提供參考依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)于2019年5—10月在云南省保山市隆陽(yáng)區(qū)西邑鎮(zhèn)（24°56′11.861″ N，99°18′38.793″E，海拔1602 m）進(jìn)行。該地屬西南季風(fēng)區(qū)亞熱帶高原氣候，年均氣溫15.1 ℃，降水量1 258.5 mm，日照時(shí)數(shù)2200 h，無(wú)霜期290 d。生物炭用當(dāng)?shù)赜筒私斩挒樵现瞥?，熱解溫度?00 ℃。供試土壤為酸性黏質(zhì)紅壤，試驗(yàn)前0 20 cm土壤和供試生物炭的理化性狀如表1所示。

1.2? 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)處理：對(duì)照CK，當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)施肥;T1，CK+ 4.5 t/hm2秸稈生物炭;T2，CK+ 9 t/hm2秸稈生物炭。煙田施肥量為硝酸鈣678 kg/hm2，鈣鎂磷肥874.5 kg/hm2，硫酸鉀630 kg/hm2，供試烤煙為云煙87，小區(qū)面積為10 m×4.8 m=48 m2，株行距為0.5 m×1.2 m，每小區(qū)4行，每行20株。移栽時(shí)間為2019年5月5日，田間管理參照當(dāng)?shù)卦耘嘁?guī)范進(jìn)行。每個(gè)小區(qū)于2019年8月29日烤煙成熟期，采用五點(diǎn)取樣法，采集020、2040和4060 cm土壤，充分混勻后，020 cm部分新鮮土樣用于土壤細(xì)菌群落測(cè)定，剩余部分與其他各層土樣經(jīng)自然風(fēng)干、去雜、研磨過(guò)不同孔徑篩后用于土壤pH、有機(jī)質(zhì)和速效養(yǎng)分的測(cè)定。

1.3? 測(cè)定方法

1.3.1? 土壤養(yǎng)分的測(cè)定? pH采用pH計(jì)法（FE38-FiveEasyPlus?，Mettler-Toledo，瑞士）以水：土=2.5：1的質(zhì)量比進(jìn)行測(cè)定，有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀容量法，堿解氮采用堿解擴(kuò)散法，有效磷采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法，速效鉀采用乙酸胺浸提-火焰光度計(jì)法[19]。

1.3.2? 土壤微生物基因組DNA的提取? 采用E.Z.N.A.TM （Omega Bio-Tek，USA）試劑盒提取土壤微生物基因組DNA（gDNA），進(jìn)而利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA[20]。

1.3.3? 土壤細(xì)菌16SrRNA PCR擴(kuò)增? PCR采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，引物序列：338F （ACTCCTACGGGA GGCAGCAG），806R （GGACTACHVGGGTWTCT AAT）。PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體積25 μL，12.5 μL 2×Taq-PCR-MasterMix，3 μL BSA（2 ng/μL），每種引物1 μL（5 ?mol/L），2 μL模板DNA，5.5 μL ddH2O，在Mastercycler梯度PCR儀（德國(guó)Eppendorf）上進(jìn)行擴(kuò)增，循環(huán)參數(shù)為95 ℃ 5 min，然后在95 ℃下循環(huán)45 s，55 ℃下循環(huán)50 s，72 ℃下循環(huán)45 s，最終在72 ℃下延長(zhǎng)10 min。每個(gè)樣品3次重復(fù)。使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris_HCl洗脫。將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

參照電泳初步定量結(jié)果，PCR產(chǎn)物用QuantiFluor? -ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）進(jìn)行檢測(cè)定量，之后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。檢測(cè)合格的文庫(kù)采用Illumina miseq對(duì)16S rRNA基因序列的V3-V4區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.4? 數(shù)據(jù)處理

稀釋曲線（Katherine R Amato，2013）依據(jù)97%相似度提取OTU，利用mothur做rarefaction分析，R語(yǔ)言進(jìn)行PCA、Venn統(tǒng)計(jì)分析和作圖;采用RDPClassifier算法對(duì)OTU代表序列進(jìn)行比對(duì)分析; 基于Unweighted Unifrac距離矩陣，UPGMA方法聚類建樹，并將聚類結(jié)果與各樣品在門、綱、目、科、屬水平上的物種相對(duì)豐度整合展示。利用Qiime（Schloss PD et al，2011）version v.1.8 （http：// qiime. org/ scri-pts/alpha_rarefaction.html）分析軟件對(duì)樣品做Alpha多樣性分析[20]。

其余試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016及SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，處理間差異采用Duncan多重比較方法，差異顯著性水平為0.05。

2? 結(jié)? 果

2.1? 不同處理對(duì)土壤pH、有機(jī)質(zhì)和速效養(yǎng)分的影響

由表2看出，對(duì)于0～20 cm土層，添加生物炭可較CK顯著提高0～20 cm土層有機(jī)質(zhì)、堿解氮、有效磷以及速效鉀含量，增幅范圍分別為27.2%～28.9%、6.9%～7.3%、53.5%～55.3%與20.1%～24.1%，但不同用量的生物炭處理間均無(wú)顯著差異;T2處理較CK顯著提高耕層土壤pH。對(duì)于20～40 cm土層，添加生物炭最高較CK顯著提升土壤有機(jī)質(zhì)、堿解氮、有效磷和速效鉀含量分別為23.1%、25.5%、50.4%與41.8%，其中T1處理有機(jī)質(zhì)顯著高于T2，而T2處理速效鉀含量顯著高于T1。對(duì)于4060 cm土層，添加生物炭顯著降低土壤有機(jī)質(zhì)、堿解氮與有效磷含量，僅T1處理的速效鉀含量顯著高于CK 13.4%?？梢?jiàn)，添加生物炭能同時(shí)提高020與2040 cm土層土壤有機(jī)質(zhì)及速效養(yǎng)分，而對(duì)40～60 cm土壤有機(jī)質(zhì)有顯著降低效應(yīng)。

2.2? 不同處理土壤細(xì)菌α多樣性分析

Shannon-Winner曲線可反映樣本中微生物多樣性以及樣本微生物的豐度。由圖1可知，各處理的樣本Shannon-winner曲線都是上升后最終趨向于平坦，說(shuō)明樣品測(cè)序數(shù)據(jù)量足以反映各處理樣本中絕大多數(shù)的微生物信息。綜合分析表3和圖1中的相關(guān)數(shù)據(jù)可知，與CK相比，T1處理的Chao1、observed_species和Shannon數(shù)值都有所下降，降幅分別為3.48%、5.15%和1.75%;T2處理的Chao1、observed_species和Shannon數(shù)值都高于CK，增幅分別為3.24%、4.44%和1.75%;T1和T2處理的OTU數(shù)目與CK相比均有顯著的增加，增幅分別為28.59%和33.82%，表明T2處理在增加土壤細(xì)菌微生物的數(shù)目的同時(shí)也豐富了土壤細(xì)菌多樣性。

2.3? 細(xì)菌OTUs分布

由圖2可見(jiàn)，各處理土壤樣本中細(xì)菌OTUs總數(shù)為1701個(gè)，其中3個(gè)處理共有細(xì)菌OTUs總數(shù)為1269個(gè)，CK、T1和T2土壤樣本中的獨(dú)有OTUs數(shù)目分別為14、24和54。與CK相比，T1所特有的OTUs數(shù)目為277個(gè)，占OTUs總數(shù)的16.3%;與CK相比，T2所獨(dú)有的OTUs數(shù)目為307個(gè)，占OTUs總數(shù)的18.9%，同時(shí)T1和T2所單獨(dú)共有的OTUs數(shù)目為253個(gè)，這表明施用生物炭的處理有更為相似的微生物組成，生物炭對(duì)提高土壤中的細(xì)菌OTUs數(shù)目有明顯的作用，且影響程度隨施用量的增加而增加。

2.4? 細(xì)菌群落種類組成和相對(duì)豐度

由圖3和表4可知，3個(gè)處理土壤中細(xì)菌在門水平的主要菌群依次為：變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria），其中占主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)的3個(gè)門分別是Proteobacteria（29.46%33.91%）、Actinobacteria（18.15%23.4%）和Acidobacteria（16.94%20.99%），與CK相比，T1增加了土壤中變形菌門和放線菌門的相對(duì)豐度，T2提高了土壤中變形菌門的相對(duì)豐度，但T1和T2降低了酸桿菌門的相對(duì)豐度。

從屬的分類水平來(lái)看（表5、圖4），變形菌門細(xì)菌序列主要分布于鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、羅思河小桿菌屬（Rhodanobacter）、根霉菌屬（Rhizomicrobium）和鹽囊菌屬（Haliangium），放線菌門序列主要分布于節(jié)桿菌屬（Arthrobacter），酸桿菌門序列主要分布于Candidatus、Solibacter和Bryobacter，芽單孢菌門序列主要分布于芽單孢菌屬（Gemmatimonas）。

通過(guò)LDA Effect Size對(duì)比分析（圖5），不僅可以實(shí)現(xiàn)多個(gè)分組之間的比較，同時(shí)可以觀測(cè)組內(nèi)部的物種組成及豐度，可以看出T2處理的組內(nèi)菌群多樣性顯著高于T1和CK，表明增加生物炭用量對(duì)土壤細(xì)菌物種多樣性的提升有重要作用。

2.5? 土壤養(yǎng)分與優(yōu)勢(shì)群落相對(duì)豐度的綜合分析

PCA主成分分析（圖6）表明，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）對(duì)各處理樣品的差異性解釋度分別為20.38%和15.62%，合計(jì)為36.00%，CK樣本點(diǎn)主要分布在PC1的正半軸區(qū)域，T1和T2主要集中在PC1負(fù)半軸區(qū)域，從圖中各處理樣品點(diǎn)的相對(duì)位置可以看出T1和T2的細(xì)菌物種組成更為相似且均距離CK較遠(yuǎn)，表明生物炭的添加改變了土壤中細(xì)菌的物種組成及分布。

表6結(jié)果表明，變形菌門與土壤有效磷含量呈顯著正相關(guān)，與土壤速效鉀含量呈極顯著正相關(guān);放線菌門與土壤有效磷含量呈極顯著正相關(guān)，與土壤速效鉀含量呈顯著正相關(guān);酸桿菌門與土壤有效磷含量呈極顯著正相關(guān)，可見(jiàn)當(dāng)?shù)刂矡熗寥兰?xì)菌群落的變化與速效鉀和有效磷的含量密切相關(guān)。

3? 討? 論

3.1? 秸稈生物炭對(duì)土壤養(yǎng)分的提升效應(yīng)

本研究發(fā)現(xiàn)，施用生物炭增加了保山植煙紅壤不同土層有機(jī)質(zhì)、堿解氮、有效磷以及速效鉀養(yǎng)分含量，而李明等[21]的研究也表明，生物炭的施用可以有效改良紅壤酸度，并對(duì)有效磷和速效鉀的提升顯著，但對(duì)土壤堿解氮的作用效果不顯著。這一方面是因?yàn)樯锾坎牧媳旧砗械⒀?、硫等多種養(yǎng)分元素，可在一定程度上直接提升土壤養(yǎng)分[22];另一方面在于生物炭可以通過(guò)改變土壤環(huán)境而間接影響?zhàn)B分的遷移轉(zhuǎn)化過(guò)程，例如生物炭可以通過(guò)提供表面負(fù)電荷影響與磷結(jié)合的鐵鋁等元素，增加土壤磷素有效性[23]，生物炭中含有的無(wú)機(jī)碳酸鹽等可以參與中和土壤H+，降低土壤pH，同時(shí)生物炭還具有一定的離子交換能力和吸附特性，對(duì)NO3?-N、NH4+-N以及PO43?具有良好的吸附和截留作用[24-26]。

曾愛(ài)等[3]研究發(fā)現(xiàn)，生物炭高施用量比低施用量有利于提高速效鉀含量，但在生物炭低施用量下土壤堿解氮和有效磷含量顯著增高。而本研究發(fā)現(xiàn)高、低量生物炭均能顯著增加020和2040 cm土壤中有機(jī)質(zhì)、堿解氮、有效磷和速效鉀的含量，但二者差異并不顯著。這可能是因?yàn)楸狙芯康脑囼?yàn)時(shí)間較短，高量施用生物炭的后效尚未表現(xiàn)，故而后期仍需要繼續(xù)研究不同生物碳用量對(duì)植煙土壤的長(zhǎng)期作用效果。

3.2? 秸稈生物炭對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性的影響

以芳香烴類穩(wěn)定態(tài)碳為主的生物炭雖然自身具有耐微生物分解的抗性，但其多孔結(jié)構(gòu)為土壤微生物活動(dòng)提供了生存空間[27-29]，能夠有效改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，增加細(xì)菌群落豐度和多樣性[30-31]，從而促進(jìn)土壤養(yǎng)分的周轉(zhuǎn)利用。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照處理相比，施用生物炭處理的土壤樣品具有更為相似的細(xì)菌群落組成，尤其以高量施用生物炭能夠顯著提升土壤細(xì)菌群落豐度和多樣性，這一研究結(jié)果與陳澤斌等[32]、陳利軍等[31]的研究結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)紅壤土施用生物炭可顯著提高細(xì)菌群落多樣性，這可能因?yàn)樯锾渴┤牒笫雇寥纏H升高，堿性環(huán)境使微生物群落結(jié)構(gòu)趨于相似，而用量的增加相當(dāng)于為微生物提供了更廣泛的生存空間。另外，本研究對(duì)排名前5位的優(yōu)勢(shì)菌門與土壤養(yǎng)分進(jìn)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，施用生物炭后土壤中主要的細(xì)菌門類多與土壤有效磷及速效鉀含量顯著正相關(guān)，這與生物炭為微生物提供增殖生長(zhǎng)空間，促進(jìn)磷、鉀養(yǎng)分的有效轉(zhuǎn)化有關(guān)[23，29]。李明等[21]通過(guò)對(duì)紅壤微生物群落結(jié)構(gòu)和土壤性質(zhì)的典范對(duì)應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)土壤有效磷和速效鉀極顯著影響了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性，這表明土壤有效磷和速效鉀的變化與土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)改變具有協(xié)同效應(yīng)。

4? 結(jié)? 論

結(jié)果表明，保山煙區(qū)酸性黏質(zhì)紅壤耕層施生物炭可以顯著提升植煙土壤020與2040 cm土壤中有機(jī)質(zhì)和速效氮磷鉀養(yǎng)分，但僅對(duì)020 cm土壤pH有顯著提升。另外，施用生物炭可增加土壤細(xì)菌菌群豐度和多樣性，且在門水平上，土壤中主要優(yōu)勢(shì)菌群（Proteobacteria、Actinobacteria與Acidobacteria）與土壤中有效磷和速效鉀含量呈顯著正相關(guān)。綜上，施用生物炭一年即可有效提高植煙土壤養(yǎng)分含量并增加細(xì)菌菌群豐度及多樣性，常規(guī)施肥結(jié)合9 t/hm2秸稈生物炭效果更為顯著。

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