響應(yīng)面優(yōu)化血根堿β-環(huán)糊精包合物的制備工藝

梁浩 錢璽丞 杜曉靜 郁建生

摘??? 要：本研究旨在制備血根堿β-環(huán)糊精包合物，從而拓寬其應(yīng)用范圍。首先通過單因素試驗(yàn)對(duì)條件進(jìn)行優(yōu)化，隨后再以包合率考察指標(biāo)，采用響應(yīng)面法對(duì)包合比、包合溫度、包合時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的工藝參數(shù)。結(jié)果表明：包合時(shí)間140 min，包合比7∶1，包合溫度62 ℃時(shí)包合率達(dá)到56.05%，與軟件預(yù)測(cè)值（56.11%）接近（相對(duì)誤差0.11%）。

關(guān)鍵詞：β-環(huán)糊精;血根堿;響應(yīng)面分析法

中圖分類號(hào)：TS201.1????????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A????????? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.02.001

Response Surface Optimization of the Preparation Process of Sanguinarine β-cyclodextrin Inclusion Compound

LIANG Hao， QIAN Xicheng， DU Xiaojing， YU Jiansheng

（Key Open Laboratory of Traditional Chinese Veterinary Medicine， Tongren Polytechnic College， Tongren，Guizhou? 554300， China）

Abstract： This study aims to prepare sanguinarine β-cyclodextrin inclusion compound to broaden its application range. Firstly， the conditions were optimized through single factor test， and then the indicators were investigated by inclusion rate. The response surface method was used to optimize the inclusion ratio， inclusion temperature， and inclusion time to determine the best process parameters.The results showed that when the inclusion time of the inclusion reaction was 140 min， the inclusion ratio of β-cyclodextrin and sanguinarine was 7∶1， and the temperature of the inclusion reaction was 62 ℃， and the inclusion rate reached 56.05% ， which was close to the software predicted value （56.11%） （relative error 0.11%）.

Key words： β-cyclodextrin; Sanguinarine; response surface methodology

血根堿是一種苯并菲啶型的異喹琳類生物堿，主要存在于紫堇的根塊、血水草的地上部分以及白屈菜和博落回的全草之中[1-8]。研究表明具有多種藥理活性（抗腫瘤、抗炎、抗菌等）[9-11]，在生物醫(yī)藥、獸藥和植物源生物農(nóng)藥方面應(yīng)用廣泛[12-18]。此外，血根堿還具有一定的清除自由基功能，因此可作為一種潛在的天然食品抗氧化劑[19]。但由于血根堿在水中的溶解度和穩(wěn)定性較差，限制了其應(yīng)用范圍。環(huán)糊精包合技術(shù)能很好地解決這一難題，不僅可以增加客體分子的水溶性，還可以降低其自身的毒性，掩蓋其苦味，防止客體分子在加工和貯存過程中變質(zhì)等[20]。目前苯并菲啶型生物堿的環(huán)糊精包合物主要集中在對(duì)小檗堿的包合，以掩蓋其苦味，對(duì)血根堿的包合作用研究較少[21-24]。因此，本試驗(yàn)主要研究了β-環(huán)糊精對(duì)血根堿的包合作用，以期改善其溶解性和穩(wěn)定性，從而拓寬其應(yīng)用范圍。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

血根堿原料（HPLC檢測(cè)純度為95.5%），參照文獻(xiàn)[25]自制，血根堿標(biāo)品（純度≥98%;上海源葉生物科技有限公司）和β-環(huán)糊精（純度≥98%;上海源葉生物科技有限公司）;其它常規(guī)試劑為分析純購(gòu)自國(guó)藥試劑。

超高效液相色譜儀（型號(hào)：Agilent1290）購(gòu)自安捷倫;真空干燥箱（型號(hào)：FZG-1）購(gòu)自南京華莎;十萬分之一分析天平（型號(hào)：CPA225D）購(gòu)自賽多利斯;千分之一分析天平（型號(hào)：AE224）購(gòu)自上海舜宇;磁力攪拌器（型號(hào)：DF-101S）購(gòu)自鞏義予華;紫外可見分光光度計(jì)（型號(hào)：T10CS）購(gòu)自北京普析;超聲波清洗機(jī)（型號(hào)：SG5200HE）購(gòu)自上海冠特;鼓風(fēng)干燥箱（型號(hào)：DHG-9140B）購(gòu)自上海福絮。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 溶液制備：稱取10.29 mg血根堿標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇-1.0%鹽酸溶液（50∶50）溶解，超聲30 s，采用100 mL容量瓶定容，配置得到血根堿標(biāo)準(zhǔn)溶液母液。準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)品母液1.0 mL、3.0 mL、5.0 mL、7.0 mL、10.0 mL于容量瓶（50 mL）中，并定容。

色譜條件：ZORBAX Eclipse Plus C18 型超高壓快速高分離度窄徑柱（2.1*50， 1.8 μm）色譜柱，波長(zhǎng)271 nm;流動(dòng)相0.1%磷酸-乙腈;柱溫25℃;進(jìn)樣量 2 μL;流速 0.5 mL·min-1。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：橫坐標(biāo)X軸為血根堿濃度，縱坐標(biāo)Y軸為峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。該曲線在 0～20 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=-0.589 14+14.956 9x，R2=0.999 93。

1.2.2 血根堿-β-環(huán)糊精包合物制備 稱取一定量β-CD，加入5 mL蒸餾水，水浴加熱攪拌至溶解，緩慢加入0.1 g血根堿，避光攪拌，攪拌結(jié)束后將反應(yīng)液冷藏過夜，過濾反應(yīng)液，濾餅用蒸餾水洗滌，濾餅40℃真空干燥，粉碎后即得包合物粉末。

1.2.3 血根堿β-環(huán)糊精包合單因素試驗(yàn) 包合溫度：固定反應(yīng)的包合時(shí)間和包合比，以包合率為指標(biāo)，包合溫度分別30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃，確定較佳包合溫度。

包合時(shí)間：固定反應(yīng)的包合比和包合溫度，以包合率為指標(biāo)，包合時(shí)間分別1 h，2 h，3 h，4 h，5 h，6 h，確定較佳包合時(shí)間。

包合比：固定反應(yīng)的包合時(shí)間和包合溫度，以包合率為指標(biāo)，包合比分別1∶1，2∶1，4∶1，6∶1，8∶1，10∶1，確定較佳包合比。

1.2.4 包合物制備工藝的響應(yīng)面優(yōu)化 結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以血根堿包合物包合率（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察包合比（X1）、包合時(shí)間（X3）和包合溫度（X2）這3個(gè)因素，通過優(yōu)化Box-Behnken響應(yīng)面分析確定最佳的血根堿包合參數(shù)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的水平及編碼值見表1。

1.2.5 樣品溶液的配制及含量測(cè)定 準(zhǔn)確稱取血根堿包合物，采用1.0%鹽酸-甲醇溶液（50∶50）溶解，超聲30 s，定容于25 mL容量瓶中，搖勻，采用有機(jī)溶劑微孔濾膜（0.22 μm）過濾，得待測(cè)包合物樣品溶液。采用高效液相色譜法（檢測(cè)波長(zhǎng)271 nm）測(cè)定包合物中血根堿含量。血根堿包合率= 1-（濾液中血根堿質(zhì)量+包合物中未反應(yīng)血根堿質(zhì)量）/稱量血根堿質(zhì)量×100%。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析 單因素試驗(yàn)均重復(fù)3次取平均值，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用OriginPro 9.1 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.6.1軟件統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 β-環(huán)糊精與血根堿的配比對(duì)包合反應(yīng)的影響 采用單因素方差分析通過包合比對(duì)包合率影響的試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯著性分析得P=0.009 4達(dá)到極顯著水平（P<0.01），由圖2可知，血根堿的包合率隨β-環(huán)糊精與血根堿的包合比的增大而增大，當(dāng)包合比為6∶1時(shí)包合率達(dá)到最大值38.6%，繼續(xù)增大包合比，包合率減小，因此選擇包合比為6∶1。

2.1.2 攪拌反應(yīng)溫度對(duì)包合率的影響 采用單因素方差分析通過包合溫度對(duì)包合率影響的試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯著性分析得P=0.005 7達(dá)到極顯著水平（P<0.01），由圖3可知，包合溫度較低或較高時(shí)包合比都會(huì)降低，可能是溫度較低不利于血根堿進(jìn)入環(huán)糊精內(nèi)部的空腔結(jié)構(gòu)，溫度過又會(huì)導(dǎo)致已經(jīng)形成的包合物分解。因此選取包合溫度為60℃。

2.1.3 包合時(shí)間對(duì)血根堿包合率的影響 采用單因素方差分析通過包合時(shí)間對(duì)包合率影響的試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯著性分析得P=5.24×10-6達(dá)到極顯著水平（P<0.01），由圖4可知，包合時(shí)間過長(zhǎng)或過短時(shí)均不利于包合物的形成，當(dāng)包合時(shí)間為2 h時(shí)包合率達(dá)到最大值，可能是由于包合時(shí)間縮短血根堿的包合反應(yīng)過程尚未完成，時(shí)間太長(zhǎng)又會(huì)導(dǎo)致以形成的包合物脫包合。因此選擇2 h為包合時(shí)間。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 試驗(yàn)結(jié)果與分析 響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-Expert8.0.6.1軟件分析，試驗(yàn)結(jié)果見表2，建立數(shù)學(xué)模型方程為：Y=53.44+2.78X1-0.23X2+4.25X3+2.52X1X2+4.43X1X3-0.34X2 X3-3.60X12-3.15X22-6.34X32。

方差分析結(jié)果見表3。該模型P值達(dá)到極顯著水平，二次項(xiàng)均顯著，說明方程與試驗(yàn)擬合度較好。模型方差分析表明，各影響因素對(duì)血根堿的包合率影響次序?yàn)椋喊蠒r(shí)間>主客分子包合比>包合溫度。

2.2.2 包合工藝的響應(yīng)面交互作用分析 圖5為β-環(huán)糊精與血根堿包合工藝的響應(yīng)面分析圖。由圖5 可看出，X1和X3的交互作用對(duì)包合率影響極顯著，X1X2和X2X3對(duì)包合率的影響不顯著。根據(jù)響應(yīng)面分析得到的最佳包和參數(shù)為包合比6.91∶1，包合時(shí)間2.32 h，包合溫度61.82℃時(shí)包合率的理論最大值為56.11%。

2.2.3 血根堿與β-環(huán)糊精環(huán)糊精包合工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 考慮到實(shí)際操作的局限性，因此將包合工藝的參數(shù)進(jìn)一步修訂，包合比修訂為7∶1，包合時(shí)間修訂為140 min，包合溫度修訂為62℃，將此條件重復(fù)三次取平均值，包合率達(dá)到56.05%與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為0. 11%。由此可知，理論值與實(shí)際值誤差在± 1%以內(nèi)，說明采用Box-Behnken組合優(yōu)化得到的包合參數(shù)準(zhǔn)確可靠，可以較好地反應(yīng)β-環(huán)糊精與血根堿的包合情況，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

2.3 血根堿包合物的紫外光譜分析

在200～400 nm波長(zhǎng)條件下，分別對(duì)四種不同溶液（血根堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液、β-環(huán)糊精樣品溶液、包合物溶液、混合物溶液）進(jìn)行紫外掃描，其紫外光譜如圖6所示。由圖可知，包合物的紫外吸收波峰和波谷與β-環(huán)糊精、血根堿以及兩者的物理混合物的波峰和波谷的吸收波長(zhǎng)均有所差異，因此可判定得到的不是血根堿與β-環(huán)糊精的簡(jiǎn)單混合物（不同物質(zhì)的紫外吸收曲線波峰和波谷的位置均有差異），因而初步驗(yàn)證了血根堿-β-環(huán)糊精包合物已形成。

3 結(jié)論與討論

近年來環(huán)糊精包合技術(shù)在制藥工業(yè)中應(yīng)用越來越多，經(jīng)環(huán)糊精包合以后，不僅可以延長(zhǎng)延誤的貨架期，改善藥物的口感提高適口性。還可以提高藥物的溶解度、生物利用度、控制藥物的釋放、還可以實(shí)現(xiàn)靶向治療等[26]。目前環(huán)糊精對(duì)小檗堿的包合作用已被多人報(bào)到，經(jīng)包合以后小檗堿的溶解性和苦味都有所改善，血根堿與小檗堿同屬苯丙菲啶型生物堿，結(jié)構(gòu)相似，因此環(huán)糊精對(duì)血根堿的包合作用應(yīng)該也能實(shí)現(xiàn)。通過環(huán)糊精對(duì)血根堿的包合，以期改善其穩(wěn)定性和溶解性。

本研究通過單因素試驗(yàn)確定了β環(huán)糊精和血根堿的包合比為6∶1，包合溫度為60℃、包合時(shí)間為2 h。再通過用Box-Benhnken 設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，得到了β環(huán)糊精和血根堿的最佳包合工藝：包合比7∶1、包合溫度62℃、包合時(shí)間140 min，包合率達(dá)到56.05%。經(jīng)紫外光譜初步鑒定，包合物已形成，本試驗(yàn)通過響應(yīng)面優(yōu)化得到的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠，理論值與實(shí)際值相差不大，因此該工藝具有很好的應(yīng)用價(jià)值，可為血根堿新型制劑的開發(fā)提供技術(shù)支持。

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