李 霞, 陳海鷗, 尚一帆, 韋 瀅, 崔萌佳, 單 楊, 李海云

(1.桂林理工大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院, 廣西 桂林 541006; 2.桂林萬(wàn)禾農(nóng)產(chǎn)品有限公司, 廣西 桂林 541006;3.湖南省農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所, 長(zhǎng)沙 410125)

西番蓮(PassifloraedulisSims), 又稱(chēng)百香果、 雞蛋果, 是西番蓮科西番蓮屬多年生草質(zhì)藤本植物的果實(shí), 起源于熱帶地區(qū)[1]。西番蓮果肉中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì), 果皮也含有許多活性成分, 包括多糖、 多酚、 黃酮和生物堿等[2-3], 其中多糖是構(gòu)成西番蓮果皮的主要功能成分, 具有降血脂、 抗氧化和抗炎等生物活性[4-5]。研究表明, 多糖能夠調(diào)節(jié)腸道微生物的豐度, 且能夠被腸道微生物降解[6], 促進(jìn)有益于機(jī)體健康的短鏈脂肪酸(乙酸、 丙酸、 丁酸、 異丁酸、 戊酸和異戊酸等)生成, 調(diào)節(jié)機(jī)體的降血糖、 降血脂和免疫等功能[7]。

李霞等[1]研究發(fā)現(xiàn), 西番蓮果皮多糖具有一定的抗氧化活性, 且在一定濃度范圍內(nèi)呈量效關(guān)系; Salgado等[8]用添加西番蓮果皮粉的飼料飼喂糖尿病大鼠后, 大鼠血糖降低, 肝糖原含量顯著增加; Farid等[9]臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 西番蓮果皮提取物可一定程度的減少膝關(guān)節(jié)炎癥, 改善膝關(guān)節(jié)炎疼痛等癥狀。此外, 多糖的來(lái)源廣泛、 毒副作用低, 因此開(kāi)發(fā)多糖為益生元、 降血糖和降血脂等保健食品具有廣闊的應(yīng)用前景。但關(guān)于西番蓮果皮多糖改善腸道健康方面的研究鮮有報(bào)道。

本文以西番蓮果皮為材料, 采用熱水煮提和堿煮提法提取多糖, 研究西番蓮果皮多糖對(duì)大鼠的胃腸蠕動(dòng)功能、 短鏈脂肪酸的生成及血糖、 血脂調(diào)節(jié)的影響, 以期為西番蓮果皮多糖在保健食品的開(kāi)發(fā)方向提供理論數(shù)據(jù)和奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物: SD大鼠, 湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司, 雄性, 體質(zhì)量(230 ± 40) g; 西番蓮, 桂林萬(wàn)禾農(nóng)產(chǎn)品有限公司; 葡萄糖、 葡萄糖醛酸， 上海滬峰生物科技有限公司; 苯酚、 上?；瘜W(xué)試劑有限公司; 濃硫酸， 廉江市愛(ài)廉化學(xué)試劑有限公司; 四硼酸鈉、 咔唑, 西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2 儀器

高效液相色譜儀: Agilent 1100型, 美國(guó) Agilent 公司; 紫外檢測(cè)器: G1315B型, 美國(guó) Agilent 公司; pH計(jì): AZ8685型, 臺(tái)灣衡欣科技股份有限公司; 安準(zhǔn)血糖儀， 三諾生物傳感股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 西番蓮果皮多糖的制備 水提西番蓮果皮多糖: 西番蓮果皮， 干燥粉碎, 75 ℃水浴浸提2 h(料液比1∶40, 浸提4次), 抽濾, 離心(4 000 r/min, 15 min), 濃縮, 冷凍干燥, 得到西番蓮果皮水提多糖(water extracted polysaccharide fromPassifloraedulisSims peel, WPEP)。

堿提西番蓮果皮多糖: 將水提西番蓮果皮殘?jiān)?%氫氧化鈉浸沒(méi), 75 ℃ 浸提2 h、 4次, 抽濾, 離心(4 000 r/min, 15 min), 濃縮, 35%鹽酸中和, 流水透析48 h, 濃縮, 冷凍干燥, 得到堿提西番蓮果皮多糖(alkali extracted polysaccharide fromPassifloraedulisSims peel, APEP)。

1.3.2 西番蓮果皮多糖理化性質(zhì)的檢測(cè) 總糖含量的測(cè)定。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品, 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。參考文獻(xiàn)[1], 略作優(yōu)化, 將樣品配制為1 mg/mL, 取1.0 mL樣品, 加入0.5 mL 6%苯酚及2.5 mL濃硫酸, 搖勻， 冷卻, 于490 nm測(cè)量光密度值, 對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線求出總糖含量。

糖醛酸含量根據(jù)文獻(xiàn)[11]測(cè)定, 以葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品, 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品配制為1 mg/mL, 取1.0 mL多糖樣品, 在冰水浴中加入6.0 mL四硼酸鈉濃硫酸, 搖勻后在85 ℃水浴中靜置20 min, 待冷卻到室溫, 加入0.2 mL咔唑試液, 置于室溫環(huán)境下保持2 h, 在525 nm下測(cè)定其光密度值, 對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品中糖醛酸含量。

還原糖含量的測(cè)定。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品, 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品配制為1 mg/mL, 取2.0 mL, 加入2 mL DNS試劑, 搖勻后在沸水浴條件下反應(yīng)5 min, 流水下迅速冷卻至室溫, 加蒸餾水至15.0 mL, 搖勻, 于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)光密度值, 對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品中還原糖含量[12]。

蛋白含量的測(cè)定。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品, 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品配制為1 mg/mL, 取1.0 mL加入5.0 mL考馬斯亮藍(lán), 試劑旋渦混勻, 靜置5 min, 于595 nm波長(zhǎng)下測(cè)光密度值, 對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品中蛋白含量[13]。

1.3.3 動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì) (1)大鼠的分組及飼養(yǎng)。本次試驗(yàn)共用24只大鼠, 隨機(jī)分為3組(8只/組):對(duì)照組(no-treatment control group, NC): 喂食基礎(chǔ)飼料; WPEP組: 喂食混有0.2%WPEP(質(zhì)量分?jǐn)?shù), 下同)的基礎(chǔ)飼料; APEP組: 喂食混有0.2%APEP的基礎(chǔ)飼料。飼養(yǎng)溫度為25 ± 3 ℃, 飼養(yǎng)期間自然光照, 自由飲水和取食。干預(yù)飼養(yǎng)時(shí)間為5周, 期間記錄大鼠體質(zhì)量及食物攝入量。

基礎(chǔ)飼料組分為玉米淀粉、 酪蛋白(蛋白≥85%)、 糊化玉米淀粉、 蔗糖、 大豆油、 樣品、 混合礦物質(zhì)、 混合維生素。其中, 混合礦物質(zhì)包含: 氯化鈉、 氯化鎂、 氯化鋰、 氟化鈉、 硫酸鉀、 十二水硫酸鉻鉀、 無(wú)水碳酸鈣、 碳酸錳、 堿式碳酸鋅、 堿式碳酸銅、 碳酸亞鎳、 磷酸二氫鉀、 碘酸鉀、 釩酸銨、 硼酸、 二氧化硒、 四水鉬酸銨、 九水偏硅酸鈉、 檸檬酸三鉀、 檸檬酸鐵; 混合維生素包含: 維生素A、 維生素B1、 維生素B2、 維生素B3、 維生素B6、 維生素B9、 維生素B12、 維生素D3、 維生素E、 維生素K、 D-生物素、 泛酸鈣。酪蛋白(蛋白≥85%)、 糊化玉米淀粉、 蔗糖、 大豆油、 混合礦物質(zhì)、 混合維生素在對(duì)照組、 試驗(yàn)組含量一致, 均為14.07%、 15.56%、 11.77%、 4.0%、 2.77%、 0.03%, 玉米淀粉、 樣品在對(duì)照組含量為51.80%、 0, 在試驗(yàn)組含量為51.60%、 0.2%。

(2)胃腸道運(yùn)輸時(shí)間(GITT)的測(cè)定。飼養(yǎng)大鼠5周后, 測(cè)定大鼠胃腸道通過(guò)時(shí)間(gastrointestinal transit time, GITT)[14]。按照活性炭∶水為1∶50的質(zhì)量比在飼料里添加活性炭, 灌喂給禁食處理8 h的大鼠, 0.5 h后頸椎脫臼法處死大鼠, 打開(kāi)腹腔分離腸系膜, 剪取上端自幽門(mén)、 下端至回盲部的腸管, 置于托盤(pán)上, 輕輕將小腸拉成直線進(jìn)行測(cè)量, 計(jì)算公式

p=d1/d×100%，

式中:p—活性炭推進(jìn)率,%;d1—活性炭推進(jìn)長(zhǎng)度, mm;d—腸管長(zhǎng)度, mm。

(3)鼠便pH及含水率的測(cè)定[15]。飼養(yǎng)3周后取新鮮鼠便, 使用pH計(jì)測(cè)定pH值， 記錄鼠便濕重和烘干后的質(zhì)量, 計(jì)算鼠便的含水率(w)

w=(m0-m1)/m0×100%,

式中:m—鼠便濕重, g;m1—鼠便干重, g。

(4)短鏈脂肪酸的測(cè)定。糞便樣品立即與10倍體積(0.02%磷酸)酸化pH=3.0的異丙醇溶液在離心管中混合， 靜置30 min后, 4 000 r/min離心(4 ℃)5 min, 上清液保存并用無(wú)水硫酸鈉脫水, 立即用0.22 μm有機(jī)膜過(guò)濾。

用單標(biāo)法測(cè)定了乙酸、 丙酸、 異丁酸、 正丁酸、 異戊酸和戊酸的保留時(shí)間, 并用混合標(biāo)法確定了標(biāo)準(zhǔn)線。根據(jù)各樣品的曲線峰面積值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品的濃度。高效液相色譜條件[16]為: 色譜柱Agilent 6890 N, db-ffap122-3232毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm, 0.25 μm), 載氣為He, 載氣流速1.5 mL/min, 進(jìn)樣溫度200 ℃, 氫火焰離子化檢測(cè)器溫度250 ℃, 進(jìn)樣量2 μL, 分流比10∶1。 升溫程序: 初始溫度85 ℃, 保持2 min; 以15 ℃/min升至230 ℃, 保持3 min; 尾吹氣流量25 mL/min。

(5)血糖、 甘油三酯及膽固醇的測(cè)定。飼養(yǎng)大鼠5周后, 鼠尾取血0.5 mL, 使用血糖儀檢測(cè)大鼠血糖; 采用鼠尾刺血法取血, 立即以2 500 r/min離心10 min獲得血清, 并在4 ℃下保存。根據(jù)試劑盒說(shuō)明檢測(cè)甘油三酯(TG)和膽固醇(CHO)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析, 組間比較采用t檢驗(yàn), 以評(píng)估組之間的差異,P<0.05差異顯著,P<0.01差異極顯著, 采用GraphPad Prism 8進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 西番蓮果皮多糖的理化性質(zhì)分析

采用苯酚硫酸法、 硫酸咔唑法、 DNS法和托馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)西番蓮果皮多糖的總糖、 糖醛酸、 還原糖和蛋白含量, 結(jié)果見(jiàn)表1。WPEP和APEP的總糖含量分別為13.72%和0.39%, 原因是在堿浸提的過(guò)程中糖醛酸被中和。APEP的總糖含量明顯高于WPEP； 與WEPE相比, AEPE的蛋白質(zhì)的含量更高, 這歸因于蛋白質(zhì)和色素廣泛溶解在堿性溶液中, 從而導(dǎo)致純化過(guò)程復(fù)雜和蛋白質(zhì)含量較高[17]。

表1 西番蓮果皮多糖樣品的理化性質(zhì)

2.2 西番蓮果皮多糖對(duì)大鼠體質(zhì)量及食物攝入量的影響

如圖1a所示, 大鼠的體質(zhì)量隨著試驗(yàn)的進(jìn)行而增加。與NC中大鼠的體質(zhì)量相比, 多糖組觀察到有顯著性差異(P< 0.01)， 表明西番蓮果皮多糖對(duì)大鼠的體質(zhì)量有一定的影響。圖1b中, NC中的食物攝入量為144.41 g/d, APEP組大鼠的食物攝入量達(dá)到最高, APEP和WPEP組的食物攝入量分別比NC組高7.60%和5.66%。肥胖型糖尿病癥是代謝綜合征的一種表現(xiàn), 其特征為多食、 多飲和肥胖。可見(jiàn)， 體質(zhì)量不是完全由食物攝入量決定的, 還取決于代謝功能[18]?？梢酝茢? APEP對(duì)改善腸道代謝具有更大的潛在作用。

圖1 西番蓮果皮多糖對(duì)大鼠體質(zhì)量(a)及食物攝入量(b)的影響

2.3 西番蓮果皮多糖對(duì)大鼠腸道活性炭推進(jìn)率的影響

腸道內(nèi)活性炭的推進(jìn)率可作為衡量大鼠小腸蠕動(dòng)功能的指標(biāo)之一[19]。由圖2可知, 多糖處理組相較于對(duì)照組, 活性炭在小腸中推進(jìn)率較高, 均有顯著性差異(P<0.05)。腸道蠕動(dòng)頻率較低, 會(huì)造成糞便停留在腸道內(nèi)的時(shí)間加長(zhǎng), 導(dǎo)致有害細(xì)菌的大量繁殖, 從而威脅腸道健康[20]。用西番蓮果皮多糖飼養(yǎng)大鼠可以明顯提高活性炭在小腸中的推進(jìn)率, 且WPEP組的作用強(qiáng)于APEP組， 說(shuō)明西番蓮果皮多糖具有較好的促進(jìn)小腸蠕動(dòng)的效果, 有益于腸道健康。

圖2 西番蓮果皮多糖對(duì)活性炭在大鼠腸道中推進(jìn)率的影響

2.4 西番蓮果皮多糖對(duì)大鼠糞便含水率和pH的影響

試驗(yàn)期間,各組大鼠糞便大小均一,無(wú)便秘或稀便現(xiàn)象。多糖處理組的鼠便含水率(圖3a)(66.80%±4.61%、 59.88%±3.11%)均高于對(duì)照組(52.38%±4.31%), 且差異極顯著(P<0.01), 說(shuō)明西番蓮果皮多糖可以幫助軟化糞便, 緩解便秘; 多糖處理組的鼠便pH值(7.48±0.11、 7.25±0.14)均低于對(duì)照組(7.82±0.22), 差異極顯著(P<0.01), 說(shuō)明西番蓮果皮多糖可以降低腸道內(nèi)pH。腸道內(nèi)pH降低時(shí)有利于益生菌的生長(zhǎng)[21], 因此推斷西番蓮果皮多糖能夠改善腸道內(nèi)有益菌的生長(zhǎng)環(huán)境。

圖3 西番蓮果皮多糖對(duì)大鼠糞便含水率(a)和pH(b)的影響

2.5 西番蓮果皮多糖對(duì)短鏈脂肪酸生成的影響

西番蓮果皮多糖對(duì)大鼠糞便中短鏈脂肪酸的含量測(cè)試結(jié)果表明(表2), 與NC組相比, 多糖組的乙酸、 丙酸、 異丁酸和戊酸的含量明顯升高, 且差異均顯著。相比APEP組, WPEP組對(duì)短鏈脂肪酸生成的影響更大。短鏈脂肪酸主要在大腸內(nèi)由厭氧微生物發(fā)酵碳水化合物(寡糖、 非淀粉多糖、 抗性淀粉等)生成, 能夠影響結(jié)腸上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn), 促進(jìn)結(jié)腸細(xì)胞和小腸細(xì)胞的代謝、 生長(zhǎng)、 分化, 還可以降低結(jié)腸內(nèi)環(huán)境的pH值, 減少有害菌的生長(zhǎng), 防止腸道功能紊亂[22]。結(jié)果表明, 西番蓮果皮多糖能夠影響大鼠腸內(nèi)的短鏈脂肪酸的產(chǎn)生, 改變短鏈脂肪酸的構(gòu)成比例， 從而改善大鼠的腸道功能。

表2 西番蓮果皮多糖對(duì)大鼠糞便短鏈脂肪酸的影響

2.6 西番蓮果皮多糖對(duì)血糖、 CHO和TG的影響

TG和CHO是代表機(jī)體血脂含量的兩個(gè)重要指標(biāo), 血糖、 血脂的升高會(huì)誘發(fā)糖尿病、 冠心病和動(dòng)脈粥樣硬化等多種疾病[23]。由圖4a可知, 多糖處理組的血糖有下降趨勢(shì), 相比對(duì)照組下降了10.53%和175%, 差異性不顯著。此外,相比對(duì)照組CHO和TG, 多糖處理組呈下降趨勢(shì), 在CHO方面分別下降了5.48%和7.76%; 在TG方面下降了19.55%和18.05%。西番蓮果皮多糖有降低大鼠血糖和血脂的趨勢(shì), 但差異性不顯著, 推測(cè)是由于選用的是正常大鼠而非糖尿病模型鼠, 因此, 在后續(xù)工作中將選用Ⅱ型糖尿病小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物, 重點(diǎn)探究西番蓮果皮多糖的降血糖作用。

圖4 西番蓮果皮多糖對(duì)大鼠血糖(a)、 膽固醇(b)和甘油三酯(c)的影響

3 結(jié) 論

以西番蓮果皮為材料, 采用熱水煮提和堿煮提法提取西番蓮果皮中的多糖, 研究其對(duì)SD大鼠腸道功能、 血糖和血脂的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明, 食用西番蓮果皮多糖能夠提高活性炭推進(jìn)率、 降低大鼠糞便的pH、 增加糞便含水率、 促進(jìn)短鏈脂肪酸的生成, 說(shuō)明西番蓮果皮多糖能夠促進(jìn)大鼠的腸道蠕動(dòng), 降低大鼠腸道內(nèi)的pH, 為益生菌提供了有利的環(huán)境, 促進(jìn)生成乙酸、 丙酸、 異丁酸和戊酸等對(duì)機(jī)體有益的短鏈脂肪酸。

西番蓮果皮多糖對(duì)SD大鼠血糖、 血脂的影響研究表明, 食用西番蓮果皮多糖能夠一定程度降低大鼠的血糖、 甘油三酯和膽固醇, 但并不具有顯著性差異, 表明西番蓮果皮多糖具有潛在的降血糖和降血脂作用。在后續(xù)工作中將深入研究西番蓮果皮多糖對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠血糖、 血脂的調(diào)節(jié)作用， 以及和腸道菌群的關(guān)系, 以期為西番蓮果皮多糖的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供理論數(shù)據(jù)。