特征圖譜結(jié)合模式識別方法在半邊蓮質(zhì)量控制中的應(yīng)用

曾慧芬，賈 磊，麥 曦，李 娜，陳 葶，李 健

(南昌大學(xué)藥學(xué)院，南昌 330006)

中藥化學(xué)成分復(fù)雜，多成分、多靶點(diǎn)的作用特性使其同時(shí)具有多種藥用價(jià)值，僅從單一成分入手難以表征其質(zhì)量特性。中藥指紋圖譜作為一種綜合的、整體的中藥質(zhì)量控制技術(shù)，已得到廣泛應(yīng)用，該技術(shù)能綜合反映中藥質(zhì)量，具有分析快速、分離效能高、應(yīng)用設(shè)備普遍等優(yōu)點(diǎn)[1]。中藥特征圖譜是在指紋圖譜基礎(chǔ)上提取出典型的共有特征峰進(jìn)行中藥質(zhì)量控制的技術(shù)，該技術(shù)既有指紋圖譜綜合評價(jià)的優(yōu)點(diǎn)又兼顧了中藥來源的多變性和復(fù)雜性，強(qiáng)調(diào)的是中藥的典型特征成分，而非全部成分，較指紋圖譜更加符合中藥的具體實(shí)際情況[2-3]。模式識別能根據(jù)大批樣品的分析數(shù)據(jù)進(jìn)行分類研究，常用的方法有主成分分析(PCA)、偏最小二乘法-判別分析(PLSDA)及正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)等。將模式識別方法與中藥特征圖譜結(jié)合，能快速而有效地處理數(shù)據(jù)并挖掘出有價(jià)值的信息，從而能更好地控制中藥質(zhì)量[4-6]。

半邊蓮為桔?？浦参锇脒吷彽母稍锶荩家娪凇兜崮媳静荨?，后在李時(shí)珍所著的《本草綱目》中也有詳細(xì)記載，性辛、平，歸心、肺、小腸經(jīng)，為清熱解毒、利尿消腫之良品[7-8]。半邊蓮在我國分布廣泛，屬于臨床常用中藥材，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)收載于2015年版《中國藥典》[9]，但其僅對半邊蓮的性狀、水分和浸出物等進(jìn)行質(zhì)量控制，很難保證該藥材的質(zhì)量。文獻(xiàn)[10]對產(chǎn)自安徽、江蘇、浙江、湖北及廣西的10批半邊蓮建立了指紋圖譜，采用中藥指紋圖譜相似度軟件進(jìn)行相似度的評價(jià)，發(fā)現(xiàn)即使是產(chǎn)地相同的半邊蓮藥材相似度也存在較大差異。因此，有必要更廣泛地收集全國各產(chǎn)地的半邊蓮藥材進(jìn)行深入研究，以完善其質(zhì)量控制方法。本工作收集了全國各產(chǎn)地的半邊蓮藥材和半邊蓮飲片(共48批)，建立特征圖譜，并進(jìn)行了特征峰的歸屬和鑒定，還采用模式識別方法對48批樣品的特征圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合分析，建立了有效判別模型，能對半邊蓮藥材和半邊蓮飲片進(jìn)行分類，并確定出半邊蓮中的香葉木苷和蒙花苷對半邊蓮藥材和半邊蓮飲片的分類貢獻(xiàn)較大，從而對這2個(gè)組分建立了測定方法，為半邊蓮的質(zhì)量控制提供了方法基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC-20AD 型二元泵高效液相色譜儀，配DGU-20A3型真空在線脫氣機(jī)、SIL-20A 型自動進(jìn)樣器、SPD-20A 型二極管陣列檢測器；KQ-250B型超聲波清洗器。

香葉木苷和蒙花苷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:含8.000 mg·L－1香葉木苷和4.000 mg·L－1蒙花苷，稱取適量的香葉木苷和蒙花苷，用適量二甲基亞砜(DMSO)溶解并用甲醇稀釋而成。

香葉木苷對照品的純度不小于98%；蒙花苷對照品的純度不小于96.6%；甲醇為色譜純；試驗(yàn)用水為純凈水。

1.2 色譜條件

Inertsil-ODS 3-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10μL；流量1.0 mL·min－1；檢測波長360 nm。流動相:A 為甲醇，B 為水。梯度洗脫程序:0～8 min 時(shí)，A 由40%升至45%；8～15 min 時(shí)，A 由45%升至60%；15～22 min時(shí)，A 由60%升至65%；22～30 min時(shí)，A由65%升至70%；30～40 min 時(shí)，A 由70%升至75%；40～45 min時(shí)，A 由75%降至40%。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

24批半邊蓮藥材(S1～S24)產(chǎn)自湖南、福建、江西、安徽、四川、貴州、江蘇、浙江、廣東、廣西、湖北等11個(gè)產(chǎn)地；24批半邊蓮飲片(Y1～Y24)由江西、貴州、河北、浙江、河南、安徽、廣西、四川、海南等地的18個(gè)飲片生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)。

將半邊蓮藥材或半邊蓮飲片研磨后過0.25 mm(4號)篩，稱取半邊蓮粉末樣品約1.0 g，置于具塞錐形瓶中，加入70%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇溶液25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲提取(功率250 W，頻率40 k Hz)30 min，冷卻至室溫。再次稱定質(zhì)量，用70%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液按色譜條件進(jìn)行測定。

1.3.2 數(shù)據(jù)處理

將48批半邊蓮樣品在波長360 nm 處測得的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)出，采用Excel軟件進(jìn)行峰對齊處理，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 13.0軟件，采用自動標(biāo)度化程序進(jìn)行預(yù)處理后用于模式識別。首先采用PLS-DA程序進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，然后采用OPLS-DA 程序使數(shù)據(jù)(峰強(qiáng)度)和響應(yīng)變量(預(yù)測分類)的協(xié)方差最大化。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

試驗(yàn)考察了甲醇-0.2%(體積分?jǐn)?shù))磷酸溶液體系、乙腈-水體系和甲醇-水體系作為流動相時(shí)梯度洗脫的效果。結(jié)果表明:采用甲醇-水體系進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，色譜峰分離度較好，響應(yīng)值較高，基線平穩(wěn)。試驗(yàn)選擇流動相為甲醇-水體系。

試驗(yàn)通過二極管陣列檢測器在190～400 nm進(jìn)行全波長掃描，考察了檢測波長依次為249，254，308，360 nm 時(shí)的色譜峰形態(tài)。結(jié)果表明:檢測波長為360 nm 時(shí)，色譜峰形態(tài)較好且基線平穩(wěn)，主要色譜峰分離度好，干擾峰較少。試驗(yàn)選擇檢測波長為360 nm。

2.2 提取方法的選擇

試驗(yàn)考察了減壓濃縮、加熱回流以及不同溶劑超聲等提取方法對半邊蓮特征峰出峰情況的影響。結(jié)果表明:提取方法為減壓濃縮及加熱回流時(shí)，樣品中各目標(biāo)成分響應(yīng)值相差較大，色譜峰多而雜，分離度不好；樣品采用70%甲醇溶液超聲提取30 min后，獲得的色譜峰數(shù)量和強(qiáng)度適宜，且分離度較好。試驗(yàn)選用70%甲醇溶液超聲提取樣品30 min。

2.3 特征峰和參照物峰的指認(rèn)

分別取不同產(chǎn)地的半邊蓮藥材和半邊蓮飲片共37批，按試驗(yàn)方法進(jìn)行分析，得到其特征圖譜，發(fā)現(xiàn)半邊蓮有5個(gè)共有特征峰。

半邊蓮對照品的特征圖譜見圖1。

將半邊蓮對照品的特征圖譜數(shù)據(jù)與多個(gè)香葉木苷對照品、蒙花苷對照品等的圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，確定1號峰和3號峰分別為香葉木苷和蒙花苷，其中蒙花苷峰保留時(shí)間適中，與鄰近峰的分離度良好，可將其作為參照物峰。計(jì)算各特征峰與參照物峰的相對保留時(shí)間作為特征參數(shù)。

2.4 樣品特征圖譜測定及模式識別分析

按試驗(yàn)方法測定48 批樣品(S1～S24，Y1～Y24)的特征圖譜，將特征圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 13.0軟件，啟動PLS-DA 程序，擬合提取得到4 個(gè)主成分，能說明85.3%的X變量和88.7%的Y變量的變化，擁有49.8%的預(yù)測能力，模型的預(yù)測能力不好。在軟件中繼續(xù)啟動OPLS-DA 程序，擬合提取得到4 個(gè)主成分，能說明85.3%的X變量和88.7%的Y變量的變化，擁有75.9%的預(yù)測能力，表明建模成功，可用于半邊蓮特征圖譜的模式識別。

OPLS-DA 程序擬合分析的得分散點(diǎn)圖見圖2。

圖2 OPLS-DA 程序擬合分析的得分散點(diǎn)圖Fig.2 Score scatter plot of fitting analysis by OPLS-DA program

由圖2可知:除S7和Y17外，46個(gè)批次的半邊蓮樣品的數(shù)據(jù)點(diǎn)均落在95%的置信區(qū)間內(nèi)；飲片組中Y1較接近藥材組，其他藥材和飲片各自聚集，且明顯區(qū)分開，說明半邊蓮藥材和半邊蓮飲片的特征圖譜存在一定差異。

S7和Y17為在95%置信區(qū)間外的異常值，提示二者的特征圖譜存在不同之處。將Y1、S7 和Y17進(jìn)行標(biāo)記后，提取三者的圖譜與正常組分S1進(jìn)行比較，樣品(S1、Y1、S7和Y17)的特征圖譜見圖3。

圖3 樣品(S1、Y1、S7和Y17)的特征圖譜Fig.3 Characteristic chromatograms of the samples(S1，Y1，S7 and Y17)

由圖3可知:S7的特征峰5的響應(yīng)值較大，Y17的特征峰4的響應(yīng)值較大，異于其他批次樣品從而造成差異。

飲片Y1介于藥材組和飲片組之間，或許兼具藥材組和飲片組的共性。從得分散點(diǎn)圖的距離及特征圖譜的比較來看，Y1靠近S1，S1的半邊蓮藥材產(chǎn)于湖南攸縣，Y1 的半邊蓮飲片的產(chǎn)地為湖南懷化，Y1與S1相近的原因或許與這兩批半邊蓮的產(chǎn)地相近從而成分相近有關(guān)。

篩選變量重要性值大于1的成分，5個(gè)特征峰的變量重要性值依次如下:香葉木苷為3.14，蒙花苷為1.98，峰2為1.89，峰4為0.41，峰5為0.16。香葉木苷和蒙花苷這兩個(gè)組分對半邊蓮藥材和半邊蓮飲片的分類貢獻(xiàn)較大，提示應(yīng)對這兩個(gè)已知組分建立質(zhì)量控制方法，需建立香葉木苷和蒙花苷含量的測定方法。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按色譜條件對含0.399 7，1.998，7.993，11.99，19.98，39.97 mg·L－1香葉木苷和0.185 5，0.927 6，3.711，5.566，9.277，18.55 mg·L－1蒙花苷的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測定，以香葉木苷和蒙花苷的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

香葉木苷和蒙花苷的線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表1。

根據(jù)3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限(3S/N)，結(jié)果見表1。

表1 線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Tab.1 Linearity ranges，linear regression equations，correlation coefficients and detection limits

2.6 精密度和回收試驗(yàn)

按色譜條件對香葉木苷和蒙花苷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，測定香葉木苷和蒙花苷峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果分別為0.47%，1.4%，儀器精密度良好。

按試驗(yàn)方法對同一批次半邊蓮粉末樣品進(jìn)行分析，平行測定6次，并進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，計(jì)算回收率和測定值的RSD，結(jié)果見表2。

表2 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按色譜條件將香葉木苷和蒙花苷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別于0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣測定。結(jié)果表明:香葉木苷、蒙花苷峰面積的RSD 分別為1.2%，1.8%。這表明香葉木苷和蒙花苷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 樣品分析

按試驗(yàn)方法對半邊蓮藥材樣品和半邊蓮飲片樣品進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。

表3 樣品分析結(jié)果Tab.3 Analytical results of the samples

表3 (續(xù))

由表3可知:半邊蓮藥材中香葉木苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.225 8～0.381 6 mg·g－1，平均值為0.322 1 mg·g－1，蒙花苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.036 15～0.308 6 mg·g－1，平均值為0.077 96 mg·g－1；半邊蓮飲片中香葉木苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.218 6～0.369 9 mg·g－1，平均值為0.291 9 mg·g－1，蒙花苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.031 01～0.137 5 mg·g－1，平均值為0.059 26 mg·g－1。半邊蓮藥材中香葉木苷和蒙花苷的含量均高于半邊蓮飲片中香葉木苷和蒙花苷的含量，或許這是造成半邊蓮藥材和半邊蓮飲片分類差異的原因之一。雖然S7和Y17為模式識別分析中的異常值，但兩者的香葉木苷和蒙花苷含量無異常之處，可見這兩批樣品與其他樣品的差異不是由香葉木苷和蒙花苷的含量差異造成的，而主要是由特征峰4和特征峰5的較大差異造成的。

本工作采用高效液相色譜法建立了半邊蓮的特征圖譜，其具有5個(gè)典型特征峰，其中的1 號峰和3號峰分別為香葉木苷和蒙花苷。通過模式識別方法對48批半邊蓮樣品建立OPLS-DA 模型，該模型能夠成功區(qū)分半邊蓮藥材和半邊蓮飲片，并發(fā)現(xiàn)其中的差異樣品，通過對差異樣品進(jìn)行標(biāo)記和提取相關(guān)圖譜進(jìn)行比較，揭示了產(chǎn)生差異的原因。篩選變量重要性值大于1的成分，香葉木苷和蒙花苷對半邊蓮藥材和半邊蓮飲片的分類貢獻(xiàn)較大，因此建立了香葉木苷和蒙花苷的含量測定方法，全面測定48批半邊蓮樣品中香葉木苷和蒙花苷的含量。半邊蓮飲片中香葉木苷和蒙花苷的含量均低于半邊蓮藥材中香葉木苷和蒙花苷的含量，這或許是造成半邊蓮藥材和半邊蓮飲片分類差異的原因之一。本方法為半邊蓮的鑒定及質(zhì)量評價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)，對半邊蓮質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高有積極意義。