干露脅迫對(duì)脊尾白蝦存活率及氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

鄧高威，段健誠，王 玉，王林華，歐陽樂飛，高 煥,2,3，賴曉芳,2,3，張慶起，閻斌倫,2,3

(1.江蘇海洋大學(xué) 海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇 連云港 222005；3.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)，江蘇 南京 210014；4.連云港贛榆佳信水產(chǎn)開發(fā)有限公司，江蘇 連云港 222100)

脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)分布于印度—西太平洋區(qū)、韓國和我國近海，是我國特有的廣鹽性經(jīng)濟(jì)蝦類，其產(chǎn)量在我國東部沿海地區(qū)的混合養(yǎng)殖模式中占1/3。脊尾白蝦繁殖能力強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、環(huán)境適應(yīng)性廣[1]，養(yǎng)殖規(guī)模逐年增加[2]。

干露是指水生動(dòng)物短時(shí)間或長(zhǎng)時(shí)間離開水體的一種狀態(tài)，是自然環(huán)境、養(yǎng)殖或運(yùn)輸?shù)冗^程中常見的一種現(xiàn)象[3]。干露狀態(tài)的甲殼動(dòng)物主要遭受失水和低氧脅迫，產(chǎn)生過量活性氧、乳酸及有毒脂質(zhì)過氧化物等，影響正常生理代謝，導(dǎo)致機(jī)體損傷或死亡。在機(jī)體受到干露脅迫時(shí)，抗氧化酶發(fā)揮重要作用。干露脅迫對(duì)貝類的影響已有大量研究，但對(duì)甲殼類動(dòng)物的影響研究?jī)H有少量報(bào)道。段亞飛等[4]研究表明，干露脅迫可顯著影響日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeusjaponicus)抗氧化酶活性。姜娜等[5]研究發(fā)現(xiàn)，隨著干露時(shí)間的增加，三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)肝胰腺總抗氧化能力顯著降低。然而，目前關(guān)于干露脅迫對(duì)脊尾白蝦存活率和抗氧化系統(tǒng)的影響尚未見報(bào)道。筆者通過測(cè)定不同干露條件對(duì)脊尾白蝦存活率和抗氧化酶活性的影響，旨在探討不同干露條件下其耐干露能力和機(jī)制，為生產(chǎn)實(shí)踐提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用蝦

脊尾白蝦為本試驗(yàn)室自繁自育，選擇健康活力強(qiáng)的個(gè)體用于試驗(yàn)，體長(zhǎng)(4.1±0.1) cm，體質(zhì)量(1.92±0.12) g，在1000 L的聚氯乙烯桶中暫養(yǎng)，90尾/桶。暫養(yǎng)海水鹽度22，pH 8.0，溫度25 ℃，持續(xù)充氧，每日早晚各投喂1次，每2 d換水1/3，暫養(yǎng)7 d。

1.2 干露脅迫試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)置5組：1個(gè)對(duì)照組(繼續(xù)暫養(yǎng))和4個(gè)試驗(yàn)組(常溫干燥組、常溫濕潤組、低溫干燥組和低溫濕潤組)。每組30尾，3個(gè)平行。常溫干燥組和常溫濕潤組：在封閉無風(fēng)的室內(nèi)進(jìn)行，空調(diào)調(diào)制室溫25 ℃，濕度62%～65%，脊尾白蝦放于干凈泡沫板上進(jìn)行干露，常溫濕潤組每0.5 h噴灑一次海水，使其周圍濕度為70%～75%。低溫干燥組和低溫濕潤組：在冰箱保鮮層進(jìn)行，設(shè)置溫度6 ℃，低溫濕潤組每0.5 h噴灑一次海水，使其冰箱保鮮層濕度為70%～75%。

記錄每組脊尾白蝦各時(shí)間點(diǎn)的存活情況，并計(jì)算累計(jì)存活率。每組在試驗(yàn)開始的0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h各隨機(jī)挑選3尾脊尾白蝦，取肌肉組織凍存于-20 ℃冰箱，用于測(cè)定抗氧化酶活性。

1.3 樣品制備

取0.2 g肌肉組織，放入4 mL離心管，加入1.8 mL預(yù)冷的0.86%生理鹽水，制成10%組織勻漿。勻漿于低溫離心機(jī)4 ℃、2000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定組織抗氧化酶活性。

1.4 酶活性的測(cè)定

組織蛋白和丙二醛含量及過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。組織蛋白質(zhì)量濃度采用考馬斯亮藍(lán)法。過氧化氫酶活性采用可見光法，其單位定義：每毫克組織蛋白每秒鐘分解1 μmol的H2O2的量為1個(gè)酶活性單位(U)。谷胱甘肽過氧化物酶活性單位定義：每毫克蛋白質(zhì)，每分鐘扣除非酶反應(yīng)的作用，使反應(yīng)體系中谷胱甘肽過氧化物酶濃度降低1 μmol/L為1個(gè)酶活性單位(U)。超氧化物歧化酶活性采用羥胺法，其活性單位定義：每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中超氧化物歧化酶抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的超氧化物歧化酶量為1個(gè)超氧化物歧化酶活性單位(U)。丙二醛質(zhì)量摩爾濃度采用硫代巴比妥酸法，其單位定義是每毫克組織蛋白中丙二醛物質(zhì)的量(nmol/mg)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 25.0 進(jìn)行單因素方差分析和LSD多重比較，差異顯著水平設(shè)為0.05。用Origin 2018繪制柱狀圖并標(biāo)注差異顯著標(biāo)志。

2 結(jié) 果

2.1 干露脅迫對(duì)脊尾白蝦存活率的影響

脊尾白蝦累計(jì)存活率見表1。干露開始后脊尾白蝦劇烈跳動(dòng)，隨著時(shí)間推移，可見其鰓絲伴隨著頭胸甲內(nèi)的殘余水分進(jìn)行擺動(dòng)，脊尾白蝦觸須和腿變綠，開始死亡。4個(gè)試驗(yàn)組脊尾白蝦死亡速率由慢到快為：低溫濕潤組<低溫干燥組<常溫濕潤組<常溫干燥組。常溫干燥組的脊尾白蝦死亡速率最快，在3.0 h全部死亡，此時(shí)低溫濕潤組仍有40%個(gè)體存活；常溫濕潤組在試驗(yàn)開始后5.0 h全部死亡；低溫濕潤組存活時(shí)間最長(zhǎng)，在12.0 h時(shí)仍有4.4%的個(gè)體存活；對(duì)照組脊尾白蝦活力正常，未出現(xiàn)死亡。

表1 干露脅迫下脊尾白蝦的累積存活率 %Tab.1 Cumulative survival rate of ridgetail white prawn E.carinicauda exposed to air exposure

2.2 干露脅迫對(duì)過氧化氫酶活性的影響

干露脅迫對(duì)脊尾白蝦肌肉組織過氧化氫酶活性的影響見圖1。與對(duì)照組相比，干露脅迫后，試驗(yàn)組脊尾白蝦肌肉中過氧化氫酶活性顯著上升(P<0.05)，常溫干燥組在1.0 h達(dá)到最大值(8.63 U/mg)，是對(duì)照組的4.9倍(P<0.05)。常溫濕潤組在1.5 h達(dá)到最大值(8.26 U/mg)，是對(duì)照組的4.77倍(P<0.05)。低溫干燥組于2.0 h達(dá)到最大值(6.70 U/mg)，是對(duì)照組的3.87倍(P<0.05)。低溫濕潤組于2.5 h達(dá)到最大值(10.27 U/mg)，是對(duì)照組的5.94倍(P<0.05)。單因素方差分析表明，試驗(yàn)組與對(duì)照組以及各試驗(yàn)組間過氧化氫酶活性差異顯著(P<0.05)。單因素方差分析表明，試驗(yàn)組與對(duì)照組以及各試驗(yàn)組間過氧化氫酶活性差異顯著(P<0.05)。

圖1 干露脅迫對(duì)脊尾白蝦肌肉組織過氧化氫酶活性的影響Fig.1 Catalase activities in muscular tissue of ridgetail white prawn E.carinicauda exposed to air exposure stress

2.3 干露脅迫對(duì)谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響

干露脅迫對(duì)脊尾白蝦肌肉組織中谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響見圖2。與對(duì)照組相比，在干露脅迫條件下，常溫干燥組酶活性在2.5 h達(dá)到最大值(25.52 U/mg)，為對(duì)照組的1.35倍(P<0.05)。常溫濕潤組酶活性在0.5 h達(dá)到最大值(26.81 U/mg)，為對(duì)照組1.41倍(P<0.05)。低溫干燥組酶活性在1.0 h達(dá)到最大值(21.77 U/mg)，為對(duì)照組1.49倍(P<0.05)。低溫濕潤組酶活性在2.5 h達(dá)到最大值(32.44 U/mg)，為對(duì)照組的1.71倍(P<0.05)。單因素方差分析結(jié)果表明，試驗(yàn)組與對(duì)照組以及各試驗(yàn)組間谷胱甘肽過氧化物酶活性差異顯著(P<0.05)。

圖2 干露脅迫對(duì)脊尾白蝦肌肉組織谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響Fig.2 Glutathione peroxidase (GPx) activity in muscular tissue of ridgetail white prawn E.carinicauda exposed to air exposure stress

2.4 干露脅迫對(duì)超氧化物歧化酶活性的影響

干露脅迫對(duì)脊尾白蝦肌肉中超氧化物歧化酶活性的影響見圖3。與對(duì)照組相比，常溫干燥組酶活性在2.5 h達(dá)到最大值(14.72 U/mg)，為對(duì)照組的1.59倍(P<0.05)。常溫濕潤組和低溫濕潤組酶活性均在2.0 h達(dá)到最大值(14.46 U/mg和12.72 U/mg)，分別為對(duì)照組的1.56倍和1.37倍(P<0.05)。低溫干燥組酶活性在1.0 h達(dá)到最大值(10.11 U/mg)，為對(duì)照組的1.09倍(P<0.05)。單因素方差分析結(jié)果表明，試驗(yàn)組與對(duì)照組以及各試驗(yàn)組間超氧化物歧化酶活性差異顯著(P<0.05)。

圖3 干露脅迫對(duì)脊尾白蝦肌肉組織超氧化物歧化酶活性的影響Fig.3 Superoxide dismutase activity in muscular tissue of ridgetail white prawn E.carinicauda exposed to air exposure stress

2.5 干露脅迫對(duì)丙二醛含量的影響

干露脅迫對(duì)脊尾白蝦肌肉組織中丙二醛含量的影響見圖4。與對(duì)照組相比，常溫干燥組在1.5 h達(dá)到最大值(2.26 nmol/mg)，為對(duì)照組1.75倍(P<0.05)。常溫濕潤組和低溫濕潤組均在2.0 h 達(dá)到最大值(3.27 nmol/mg和2.92 nmol/mg)，為對(duì)照組2.53倍和2.26倍(P<0.05)。低溫干燥組在1.0 h達(dá)到最大值(2.03 nmol/mg)，為對(duì)照組的1.57倍(P<0.05)。單因素方差分析結(jié)果表明，試驗(yàn)組與對(duì)照組以及各試驗(yàn)組間丙二醛含量差異顯著(P<0.05)。

圖4 干露脅迫對(duì)脊尾白蝦肌肉組織丙二醛含量的影響Fig.4 Malonaldehyde content content in muscular tissue of ridgetail white prawn E.carinicauda exposed to air exposure stress

3 討 論

3.1 干露脅迫對(duì)脊尾白蝦存活率的影響

干露條件下水生動(dòng)物的成活率受多種因素的影響，如溫度、濕度、發(fā)育階段[6-7]、形態(tài)差異[3]、物種[8]和干露時(shí)間等。研究發(fā)現(xiàn)，毛蚶(Scapharcasubcrenata)[9]耐干露能力受溫度影響較明顯，蝦夷扇貝 (Patinopectenyessoensis)[6]和單環(huán)刺螠(Urechisunicinctus)[10]的耐干露能力隨溫度升高而降低；施氏獺蛤稚貝(Lutrariasieboldii)[11]和三疣梭子蟹幼體[12]在20 ℃耐干露能力較強(qiáng)；低溫下厚殼貽貝(Mytiluscoruscus)的耐干露能力是高溫時(shí)的3倍[13]。本試驗(yàn)中，低溫干露組脊尾白蝦的存活率高于常溫干露組。可能是由于常溫環(huán)境脊尾白蝦鰓絲表面的水分蒸發(fā)快，鰓絲間水分會(huì)以更快的速度被蒸發(fā)，導(dǎo)致脊尾白蝦因不能正常攝取氧氣而加速死亡[14]。適當(dāng)?shù)慕禍啬芙档退鷦?dòng)物新陳代謝、耗氧率和體力消耗，對(duì)氧氣、餌料和水分的需求減少，因此提高了耐干露能力[15]。

濕度也是影響干露存活率的另一個(gè)重要因素。處于干露狀態(tài)下的口蝦蛄(Oratosquillaoratoria)[16]、天津厚蟹(Helicetientsinesis)[17]、厚殼貽貝[13]和日本囊對(duì)蝦[14]存活率與環(huán)境相對(duì)濕度呈正相關(guān)。本試驗(yàn)的結(jié)果類似，常溫濕潤組脊尾白蝦存活時(shí)間高于常溫干燥組，低溫濕潤組脊尾白蝦存活時(shí)間高于低溫干燥組?？赡苁且?yàn)榧讱?dòng)物主要通過鰓絲表面的水分來進(jìn)行呼吸，空氣中的氧氣進(jìn)入鰓絲表面的水分里，再以溶解氧的形式被利用，濕潤環(huán)境增加鰓絲間的水分，提高鰓絲對(duì)空氣中氧氣的攝取能力，從而有效降低組織損傷，提高抗氧化能力。因此增加濕度可以減緩缺氧情況，提高耐干露能力和成活率[16]。

3.2 干露脅迫對(duì)脊尾白蝦抗氧化系統(tǒng)的影響

在應(yīng)激脅迫環(huán)境中，動(dòng)物機(jī)體因代謝異常產(chǎn)生過量的活性氧自由基，主要包括超氧陰離子自由基、羥自由基和過氧化氫等，過量的活性氧可導(dǎo)致機(jī)體氧化損傷[18]。蝦類在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成一套抗氧化酶系統(tǒng)，主要有過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶等，用來清除多余的活性氧，減少和避免氧化損傷對(duì)機(jī)體造成的損害[5]。因此，筆者選擇了過氧化氫酶活性、谷胱甘肽過氧化物酶活性、超氧化物歧化酶活性和丙二醛的含量與抗氧化系統(tǒng)相關(guān)的指標(biāo)，來反映脊尾白蝦在干露脅迫下機(jī)體生理生化變化情況。

過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶之間具有協(xié)同作用。生理?xiàng)l件下組織中存在一定活性氧自由基，超氧化物歧化酶中的Cu2+可被過氧化氫還原從而失去活性，過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶可清除過氧化氫，一定程度上保護(hù)了超氧化物歧化酶。超氧陰離子自由基又能使過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶失活，而超氧化物歧化酶可將生物體內(nèi)的超氧陰離子自由基歧化為過氧化氫和氧氣，保護(hù)這2種酶，3種酶形成互相保護(hù)的防御系統(tǒng)[19-20]。丙二醛既是機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的重要產(chǎn)物[21]，同時(shí)又可與蛋白質(zhì)的游離氨基相互作用，引起蛋白質(zhì)分子內(nèi)與分子間交聯(lián)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷[22-23]。超氧化物歧化酶可緩解與調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化應(yīng)激，清除自由基，促使機(jī)體恢復(fù)。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，干露脅迫條件下，過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著上升(圖1)，超氧化物歧化酶活性則呈先降后升趨勢(shì)(圖3)，而丙二醛含量總體呈先升后降的趨勢(shì)(圖4)。分析可能是脅迫時(shí)產(chǎn)生的大量超氧陰離子自由基被超氧化物歧化酶還原成過氧化氫，超氧陰離子自由基的減少以及過氧化氫的大量產(chǎn)生，導(dǎo)致超氧化物歧化酶活性的下降[24]。超氧化物歧化酶活性隨著時(shí)間的推移呈上升趨勢(shì)，可能是在過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶作用下，過氧化氫被分解成水和氧氣，抑制解除。過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著升高，說明干露脅迫導(dǎo)致脊尾白蝦缺氧，使體內(nèi)活性氧自由基顯著增加，進(jìn)而導(dǎo)致酶活性的升高[4]，機(jī)體需要提高抗氧化酶活性來適應(yīng)這種脅迫環(huán)境[25]。de Almeida等[26]研究發(fā)現(xiàn)，干露脅迫后棕色貽貝(Pernaperna)肝胰腺中脂質(zhì)過氧化物含量顯著增加。本試驗(yàn)中，丙二醛含量呈先升后降的趨勢(shì)，表明干露初期過量活性氧超出脊尾白蝦抗氧化防御能力，對(duì)機(jī)體造成氧化損傷甚至致其死亡[27]；隨著活性氧積累，激化了抗氧化系統(tǒng)，增強(qiáng)了清除自由基的能力，使丙二醛含量下降。超氧化物歧化酶活性間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力，而丙二醛的含量間接反映了機(jī)體受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，兩者相互配合使用，有利于更好地了解脊尾白蝦的健康狀況[28]。

4 結(jié) 論

綜上所述，干露脅迫可誘導(dǎo)脊尾白蝦產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，使過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性發(fā)生顯著變化，以消除丙二醛等有害物質(zhì)。適量的降低溫度、提高濕度可降低干露脅迫所帶來的機(jī)體損傷，顯著提高脊尾白蝦干露脅迫下的存活率。