黃顙魚(♀)、長(zhǎng)吻(♂)及其雜交F1代遺傳多樣性分析

王宏玉，武兆文，付東勇，蘇孟園，楊汶珊，唐榮葉，王 濤，尹紹武

(南京師范大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省特色水產(chǎn)育種與綠色高效養(yǎng)殖技術(shù)工程研究中心，江蘇 南京 210023)

微衛(wèi)星DNA也稱簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)序列(SSRs)，由非常短的串聯(lián)重復(fù)DNA片段組成，是廣泛分布于真核生物基因組中的一種中度重復(fù)序列[7]。微衛(wèi)星DNA有著高突變率、中性、共顯性，及在真核基因組中普遍存在等特點(diǎn)[8]，相比于其他分子標(biāo)記手段有著明顯的優(yōu)勢(shì)，能成功地用于揭示群體遺傳分析[9]，進(jìn)行種質(zhì)資源及親緣關(guān)系的鑒定和遺傳連鎖圖譜繪制[10]。微衛(wèi)星DNA在魚類中的應(yīng)用進(jìn)展非常快，到目前為止，魚類雜交后代的遺傳分析也都普遍使用微衛(wèi)星DNA技術(shù)，已有學(xué)者對(duì)黃顙魚(♀)×瓦氏黃顙魚(P.vachelli)(♂)[11]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)(♀)×薩羅羅非魚(Sarotherodonmelanotheron)(♂)[12]、團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)(♀)×翹嘴鲌(Culteralburnus)(♂)[13]等進(jìn)行親本與子代的分析。筆者采用微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)，尋找能夠鑒定黃顙魚、長(zhǎng)吻及雜交F1代3個(gè)群體的特異性微衛(wèi)星分子標(biāo)記并進(jìn)行遺傳多樣性分析，在分子水平上探索雙親與子代的遺傳規(guī)律，為實(shí)現(xiàn)雜交鲿科魚類新品種選育提供基礎(chǔ)資料和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取

使用上海捷瑞生物公司的細(xì)胞(組織)基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，取黃顙魚、長(zhǎng)吻、雜交F1代的尾鰭各約0.5 g，進(jìn)行DNA提取，并使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性與純度，置于冰箱-20 ℃保存，待使用時(shí)取出。

1.2.2 微衛(wèi)星引物的篩選

表1 在3個(gè)群體中表達(dá)的12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的特征Tab.1 Features of 12 microsatellite loci expressed in 3 populations

1.2.3 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增參照文獻(xiàn)[14]的設(shè)計(jì)。反應(yīng)總體系為20 μL，包括：DNA模板1 μL，正、反引物各0.8 μL，滅菌水7.4 μL，2×Taq Master Mix 10 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94 ℃變性30 s，退火30 s(每個(gè)位點(diǎn)退火溫度見表1)，72 ℃延伸30 s；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像儀中觀察是否有單一的條帶。將檢測(cè)到有單一條帶的產(chǎn)物上樣于ABI3500xl基因分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，利用軟件GeneMapper 4.1分析微衛(wèi)星位點(diǎn)的片段大小。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理參考文獻(xiàn)[15]。利用POPGENE 1.32分析微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、遺傳相似度、Nei氏遺傳距離；利用PIC-CALC計(jì)算多態(tài)信息含量值(PIC)。利用MEGA 5.0構(gòu)建非加權(quán)組平均法3個(gè)群體的UPGMA的親緣關(guān)系樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 有效引物篩選

自每個(gè)群體的32個(gè)DNA樣品中選取5個(gè)，用來驗(yàn)證所篩選的20對(duì)引物，所得條帶見圖1。經(jīng)驗(yàn)證后共有12對(duì)能在黃顙魚、長(zhǎng)吻及其雜交子代中擴(kuò)增出清晰條帶(圖2)。其中雙堿基引物10個(gè)、三堿基引物1個(gè)、四堿基引物1個(gè)，產(chǎn)物大小211～310 bp，每種引物擴(kuò)增出的多態(tài)性位點(diǎn)差別不大。

圖1 篩選出的能在3個(gè)群體中表達(dá)的引物Fig.1 Primers screened for expression in three populations前5個(gè)為黃顙魚，中間5個(gè)為長(zhǎng)吻，后5個(gè)為雜交F1代.The first five bands are yellow catfish P.fulvidraco,the middle five ones are longsnout catfish L.longirostris,and the last five ones are hybrids F1.

圖2 同一引物在3個(gè)群體中的表達(dá)情況Fig.2 Expression of the same primer in three populationsa.雜交F1代；b.長(zhǎng)吻；c.黃顙魚a.Hybrid F1;b.longsnout catfish L.longirostris;c.yellow catfish P.fulvidraco.

2.2 3個(gè)群體遺傳特性分析

雜交F1代的平均有效等位基因數(shù)為2.535，高于黃顙魚(2.382)和長(zhǎng)吻(2.221)(表2)。黃顙魚的平均觀測(cè)雜合度(0.419)高于長(zhǎng)吻的平均觀測(cè)雜合度(0.367)，而雜交F1代的平均有效觀測(cè)雜合度(0.604)也比雙親高。雜交F1代的平均多態(tài)信息含量為0.509，黃顙魚為0.420、長(zhǎng)吻為0.365。

表2 黃顙魚、長(zhǎng)吻、雜交F1代的遺傳多樣性參數(shù)Tab.2 Parameters of genetic diversity in yellow catfish P.fulvidraco,longsnout catfish L.longirostris and hybrid F1

表2 黃顙魚、長(zhǎng)吻、雜交F1代的遺傳多樣性參數(shù)Tab.2 Parameters of genetic diversity in yellow catfish P.fulvidraco,longsnout catfish L.longirostris and hybrid F1

位點(diǎn)Locus黃顙魚P.fulvidraco長(zhǎng)吻L.longirostris雜交F1代HybridF1NaNeHoHePICNaNeHoHePICNaNeHoHePICL1931.0990.0940.0920.08811.0000.0000.0000.00022.0001.0000.5080.375L2521.9520.8440.4960.36941.1000.0630.0920.08993.7440.8750.7450.698L3353.7790.7810.7470.68721.9090.5310.4840.36342.2530.1250.5650.458L35106.0770.5940.8490.81765.1070.5940.8170.775113.5620.9690.7310.703L3972.4980.2500.6090.57784.3570.7810.7830.73632.4300.2190.5980.501L4151.8430.0630.4650.43032.1810.6560.5500.61821.9980.9690.5070.375L4332.1810.8440.5500.45731.5340.3130.3540.45742.4180.0940.5960.506L4431.2900.1880.2280.21021.0640.0000.0620.05932.2530.6560.5650.481L4572.7420.2190.6450.56811.0000.0000.0000.000132.9130.8750.6670.639L4762.1200.6250.5370.44421.1680.1560.1460.13742.1810.0310.5500.439L5432.0020.5310.5080.39084.1290.6560.7700.72232.7130.7190.6410.560L7711.0000.0000.0000.0004.2.1010.6560.5320.42921.9520.7190.4960.369均值Mean4.5832.3820.4190.4770.4203.6672.2210.3670.3830.3655.0002.5350.6040.5970.509

注：Na.等位基因數(shù)；Ne.有效等位基因數(shù)；Ho.觀測(cè)雜合度；He.期望雜合度；PIC.多態(tài)信息含量.Note：Na.number of allele；Ne.number of effective allele；Ho.observed heterozygosity；He.expected heterozygosity；PIC.polymorphic information content.

2.3 群體間遺傳距離和遺傳系數(shù)分析

表3 3個(gè)群體的遺傳距離和遺傳相似系數(shù)Tab.3 Genetic distance and genetic similarity coefficient of three populations

基于Nei氏遺傳距離，用MGEA 5.0軟件構(gòu)建的UPGMA樹顯示，雜交F1代與父本長(zhǎng)吻親緣關(guān)系最近，先聚為一支，然后再與母本黃顙魚聚為一支(圖3)。

圖3 黃顙魚、長(zhǎng)吻和雜交F1的UPGMA聚類分析Fig.3 UPGAM molecular trees of yellow catfish P.fulvidraco,long-snout catfish L.longirostris and hybrid F1 based on genetic distance

3 討 論

3.1 3個(gè)群體的遺傳多樣性

生物的遺傳多樣性是評(píng)價(jià)生物資源狀況的一個(gè)重要依據(jù)[16]。微衛(wèi)星DNA標(biāo)記是進(jìn)行物種親緣關(guān)系研究及遺傳多樣性分析的有效工具，是分子水平上研究遺傳多樣性的一個(gè)重要手段[17]。微衛(wèi)星DNA憑借較高的突變率使得微衛(wèi)星具有高度的遺傳多態(tài)性，在鑒定種群內(nèi)的親緣關(guān)系以及近親自交程度等均有著較為普遍的應(yīng)用[18]。彭濤等[19]曾利用12對(duì)湖鱘(Acipenserfulvescens)微衛(wèi)星引物對(duì)小體鱘(A.ruthenus)、施氏鱘(A.schrenckii)、西伯利亞鱘(A.baeri)及3種鱘魚雜交后代的引物通用性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，只有4對(duì)引物在6種鱘魚中表現(xiàn)出多態(tài)性，用來分析遺傳多樣性。唐江等[20]從50對(duì)石斑魚屬(Epinephelus)微衛(wèi)星引物中篩出27對(duì)引物，用來分析鞍帶石斑魚(E.lanceolatus)(♂)、云紋石斑魚(E.moara)(♀)及其雜交子一代云龍斑的遺傳性狀，最終有25對(duì)引物在子代中檢測(cè)出多態(tài)性。本試驗(yàn)通過一步篩選，最終從20對(duì)引物中篩選出12對(duì)具有多態(tài)性位點(diǎn)，有效擴(kuò)增率為60%。

有效等位基因數(shù)是基因純合度的倒數(shù)，反映了等位基因間的相互影響，可作為群體遺傳變異的一個(gè)指標(biāo)[21]。根據(jù)12對(duì)有效擴(kuò)增結(jié)果顯示，黃顙魚、長(zhǎng)吻及雜交F1代的平均有效等位基因數(shù)為2.382、2.221、2.535。有效基因數(shù)的增加證明了在雜交子代保持較高的遺傳潛力。由表2可知，雜交F1代的平均觀測(cè)雜合度和平均期望雜合度為0.604、0.597，略高于母本黃顙魚(0.419、0.477)，明顯高于父本長(zhǎng)吻(0.367、0.383)。雜合度又稱基因多樣性，是測(cè)量群體遺傳變異的最佳參數(shù)[22]。通過檢測(cè)位點(diǎn)上雜合子基因型占據(jù)該位點(diǎn)所有基因型的比例，能夠反映群體間的遺傳變異高低[23]。而且有效基因數(shù)、觀測(cè)雜合度、期望雜合度三者數(shù)值越大，基因豐富度就越高。雜交F1代的基因雜合度都高于雙親，基于等位基因變異有較高的遺傳多樣性，這是雜種優(yōu)勢(shì)得以形成的重要遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)之一。以Botstein等[24]提出的用多態(tài)信息含量來衡量基因變異程度高低為依據(jù)，當(dāng)多態(tài)信息含量≥0.5時(shí)為高度多態(tài)，0.25<多態(tài)信息含量<0.5時(shí)為中度多態(tài)，多態(tài)信息含量≤0.25時(shí)為低度多態(tài)。由表2可知，黃顙魚和長(zhǎng)吻的多態(tài)信息含量為0.420和0.365，為中度多態(tài)，雜交F1代為0.509大于0.5為高度多態(tài)，雜交F1代的多態(tài)信息含量高于雙親。這個(gè)結(jié)果表明，在所篩選到的引物中，雜交F1代呈現(xiàn)出比親本高的變異程度，這與李景芬等[25]研究黃顙魚(♀)×瓦氏黃顙魚(♂)得出的雜種一代基因變異程度比雙親高，DNA多態(tài)性豐富，以及在紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)(♀)、菊黃東方鲀(T.flavidus)(♂)及其雜交子代遺傳分析結(jié)果顯示的子代遺傳多樣性高于雙親[26]的結(jié)論是一致的。這些都體現(xiàn)出雜交F1代較雙親的遺傳多樣性有所增加，具有一定的雜交優(yōu)勢(shì)，可以有培育的潛力。

3.2 遺傳距離和遺傳相似指數(shù)

在以往的研究結(jié)果中不難發(fā)現(xiàn)，雜種優(yōu)勢(shì)與遺傳距離存在著正相關(guān)性[12]，親本間遺傳差異越大，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，其后代雜種優(yōu)勢(shì)越明顯[14]。由Nei氏遺傳距離(表3)可知，黃顙魚和長(zhǎng)吻存在著2.0316的雜交距離，說明雜交F1代應(yīng)該具有一定的雜交優(yōu)勢(shì)。UPGMA聚類分析結(jié)果表明，雜交F1代與父本長(zhǎng)吻的遺傳距離(0.8551)小于與母本黃顙魚的遺傳距離(1.7271)，說明子代與父本的遺傳差異小于與母本的遺傳差異，與父本的親緣關(guān)系較近，從父本獲得更多的遺傳物質(zhì)。

4 結(jié) 論