17a-羥孕酮試劑盒性能驗證及臨床評價

姜亞鋒，王雷雷，劉雙，侯思南，程瑞飛

(1.江蘇省連云港市婦幼保健院新生兒疾病篩查中心,江蘇 連云港222000；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)連云港附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇連云港222000）

近年來，隨著醫(yī)療水平的不斷上升，新生兒疾病篩查的覆蓋范圍逐漸擴大,篩查的疾病種類也在不斷的增多[1]。21羥化酶缺乏癥(21-hydroxyulase deficiency，簡稱21-OHD)是最先發(fā)現(xiàn)、研究最多的一種先天性腎上腺皮質(zhì)增生，是最常見的CAH類型。過多的雄性激素均可對患兒生長發(fā)育造成一系列的嚴重影響,女性患兒出現(xiàn)男性化和失鹽癥狀,嚴重時威脅生命。17a-羥孕酮（17α-Hydroxyprogesterone，簡稱17-OHP）是目前篩查21-OHD最常用的敏感指標,通過篩查可早期診斷大部分21-OHD類型的CAH患兒。我院新生兒疾病篩查中心為了更好的滿足新生兒疾病篩查工作的需要，于2016年購入1235-AUTO DELFIA全自動時間分辨熒光免疫分析儀一臺,用于連云港市新生兒疾病篩查項目TSH和17a-羥孕酮的檢測。2016年至2018年連云港地區(qū)共計篩查新生兒17a-羥孕酮干血斑樣本164012例，其中經(jīng)二代基因測序技術(shù)確診5例，發(fā)病率為0.03‰，低于全國范圍內(nèi)的整體發(fā)病率1/20000~1/10000[2]。研究表明17a-羥孕酮的檢測值受孕周,新生兒出生體重等因素的影響[3-5]，為了提高篩查效率，PerkinElmer廠家推出了B024-104/112新試劑盒，稱其效能優(yōu)于原B015-112試劑盒。根據(jù)WS/T420-2013《臨床實驗室對商品定量試劑盒分析性能的驗證》[6]及CNAS-CL02：2012《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認可準則》[7]及其相關(guān)的應(yīng)用說明文件的要求，本實驗室針對B024-104/112試劑盒做精密度、正確度以及線性范圍的驗證，并驗證17a-羥孕酮的篩查切值[8，9]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采用B024試劑盒配套的L、H兩個濃度樣本以及標準品5個濃度樣本做試劑盒的性能驗證。分別收集2019年1月采用B024-104/112試劑盒篩查樣本3269例，2016年至2018年使用B015-112試劑盒篩查樣本164012例做百分位數(shù)分析。同時收集2018年度B015-112試劑盒篩查并確診的3例陽性樣本，25例初篩陽性樣本做兩種試劑盒檢測結(jié)果的比對。所有收集的樣本均為新生兒疾病篩查血片采集技術(shù)規(guī)范[10]要求的合格干血斑。

1.2 儀器與試劑1235-AUTO DELFIA全自動時間分辨熒光免疫分析儀,試劑盒為B024-104/112,標準品由試劑盒自帶,質(zhì)控品由江蘇省統(tǒng)一使用的室內(nèi)質(zhì)控品（杭州寶榮公司生產(chǎn)，批號R1180101），執(zhí)行標準：Q/HZBR 1-2016《新生兒篩查血斑質(zhì)控品》。嚴格按照B024-104/112試劑盒的使用說明進行樣本檢測。

1.3 方法

1.3.1 精密度驗證實驗方法 采用B024-104/112試劑盒自帶標準品B、C、E三個濃度樣本作為測試樣本，每個濃度樣本每天測量1個批次，共進行5天，每批次對各濃度樣本重復(fù)測量3次，每個濃度各15個測量值，采用統(tǒng)計學(xué)方法計算批內(nèi)變異系數(shù)CV批內(nèi)和總變異系數(shù)CV總。CV批內(nèi)和CV總分別小于廠家聲稱的8.2%、8.3%時為合格。

1.3.2 正確度驗證實驗方法 采用B024-104/112試劑盒自帶質(zhì)控品L（指定靶值23.3nmol/L,CV%為10%，允許偏移區(qū)間16.31～30.29 nmol/L）和質(zhì)控品H（指定靶值67.9 nmol/L，CV%為10%，允許偏移區(qū)間47.53～88.27nmol/L）兩個濃度樣本作為測試樣本，每個樣本每天測量1個批次，每批次測量5次，共進行5d，每個濃度各25個測量值，統(tǒng)計測量總均值與靶值的相對偏差是否在允許偏差范圍10%內(nèi)。

1.3.3 線性范圍驗證實驗方法 用B024-104/112試劑盒標準品B、C、D、E、F作為測量樣本，每個樣本測量3次，在一批測量中完成。以17a-羥孕酮理論值為X軸，實際測量均值為Y軸，進行線性回歸分析。

1.3.4 切值的驗證及臨床評價 對2019年1月連云港市新生兒疾病篩查中心以B024-104/112試劑盒篩查的3269例樣本結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析，回顧性分析2016年至2018年三年采用B015-112試劑盒檢測的164 012例樣本,采用SPSS統(tǒng)計軟件分別進行百分位數(shù)分析并驗證切值。同時收集2018年度3個經(jīng)二代基因測序確診陽性樣本以及25個初篩陽性樣本（以B015-112試劑盒檢測），采用B024-104/112試劑盒進行檢測，與原B015-112試劑盒檢測值進行對比驗證切值。

2 結(jié)果

2.1 精密度驗證結(jié)果 試劑盒自帶標準品B、C、E三個濃度的批內(nèi)CV%分別為6.72%、3.96%、3.79%，均低于廠家聲稱的批內(nèi)變異系數(shù)8.2%，批內(nèi)精密度符合要求。三個濃度總變異系數(shù)CV總分別是7.85%、6.88%、6.71%，低于廠家聲稱的總變異系數(shù)8.3%，總精密度符合要求。見表1。

2.2 正確度驗證結(jié)果 質(zhì)控濃度L、H靶值分別為23.3nmol/L、67.9nmol/L,各濃度25次測量均值分別為23.9nmol/L、65.57nmol/L,跟靶值的相對偏差分別為2.58%、3.43%，小于允許偏差，符合要求。見表2。

2.3 線性范圍驗證結(jié)果 在5.06～323.67nmol/L的濃度范圍內(nèi)，其線性回歸方程為：y=0.9673x-0.2424，R2=0.9999。見圖1。

圖1 17a-羥孕酮理論值與檢測值的線性回歸方程

2.4 切值驗證結(jié)果 通過回顧性分析,B015-112試劑盒的切值為30.0nmol/L取自P99.5，B024-104/112試劑盒P99.5對應(yīng)的切值為12.4nmol/L,與廠家推薦的12.0nmol/L基本一致,本實驗室采用12.0nmol/L作為切值。25例B015-112試劑盒初篩陽性及3例B015-112試劑盒初篩陽性并經(jīng)二代測序法確診的樣本以B024-104/112試劑盒檢測，兩種試劑盒檢測結(jié)果的符合率為92.9%,其中2例B015-112試劑盒初篩陽性，B024-104/112試劑盒檢測陰性。以B015-112試劑盒對這2例召回復(fù)篩，結(jié)果為陰性，臨床隨診暫未發(fā)現(xiàn)異常，可認為這2例為假陽性，與B024-104/112檢測結(jié)果相符，這與廠家聲明的新試劑盒會降低假陽性率的預(yù)期一致。見表3，表4。

表1 17-OHP精密度驗證結(jié)果(單位：nmol/L)

表2 17-OHP正確度驗證結(jié)果(單位：nmol/L)

表3 B024-104/112實驗方法和B015-112實驗方法百分位數(shù)結(jié)果分布

3 討論

全國推行的新生兒疾病的大規(guī)模篩查,旨在盡早的發(fā)現(xiàn)新生兒指標異常并及時有效的進行臨床干預(yù)，以提高出生人口素質(zhì)，降低出生缺陷[11-13]。因此全國各地新生兒疾病篩查實驗室的技術(shù)水平成為重中之重，除了人員資質(zhì)外，儀器和試劑的性能顯得尤為重要,不論是儀器的更替亦或是試劑的變化都要對其性能做出驗證及評價，判斷其是否滿足本實驗室的要求。

本文研究結(jié)果顯示AUTO DELFIA 1235檢測17a-羥孕酮的批內(nèi)變異系數(shù)均低于廠家聲稱的批內(nèi)變異系數(shù)8.2%，批內(nèi)精密度符合要求?？傋儺愊禂?shù)均低于廠家聲稱的總變異系數(shù)8.3%,總精密度符合要求。質(zhì)控濃度L、H的測量總均值均處于允許偏移區(qū)間內(nèi),與靶值的相對偏差分別為2.58%、3.43%,遠小于允許偏差10%，17a-羥孕酮檢測的正確度符合要求。在5.06～323.67nmol/L覆蓋大部分樣本的濃度范圍內(nèi),標準曲線5個濃度值的檢測均值與理論值呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.9999符合要求，線性良好。AUTO DELFIA 1235采用B024-104/112試劑盒檢測的精密度、正確度以及線性范圍均達到要求，適于臨床常規(guī)檢測使用。

表4 原B015-112和現(xiàn)B024-104/112試劑盒檢測值對比

合理的陽性切值對于CAH的篩查是至關(guān)重要的，影響篩查結(jié)果的判斷。由于地區(qū)人群分布及篩查實驗室的條件的不同,建議建立本實驗室合理的切值。在新試劑盒使用初期，如直接使用廠家提供的切值，需要驗證切值的合理性。對于17a-羥孕酮的切值的制定國內(nèi)外實驗室多采用百分位數(shù)法進行分析，取P99.5或者P99.8相對應(yīng)的水平來作為該實驗室的切值[14,15]。本實驗室將試劑盒B015-112和B024-104/112所檢測的初篩樣本分別進行百分位數(shù)法分析，B015-112試劑盒檢測數(shù)據(jù)取其P99.5所對應(yīng)的值為30.5nmol/L，我實驗室將17a-羥孕酮的切值定為30.0nmol/L。為了進一步驗證新試劑盒廠家推薦使用的切值12.0nmol/L的可靠性，本實驗室采用B015-112試劑盒篩查并經(jīng)二代測序技術(shù)確診的3例樣本以及25個初篩陽性樣本,采用B024-104/112試劑盒進行再檢測(見表6),符合率為92.9%，2例樣本初篩結(jié)論不一致，考慮與試劑廠家聲稱的B024-104/112試劑盒會降低假陽性率有關(guān)[16]。12.0nmol/L僅僅作為項目新試劑盒使用初期的本實驗室的初始切值，隨著大量檢測數(shù)據(jù)和確診病例的累計,將參考篩查及臨床診斷數(shù)據(jù)來調(diào)整切值的設(shè)定。此外由于新生兒體內(nèi)17a-羥孕酮水平與胎齡、出生體重，是否早產(chǎn)等因素有關(guān)[17-19]，也與新生兒合并心肺疾病有關(guān)[20]，只設(shè)定一個總的切值存在一定局限性。后期將積累更多的初篩樣本，結(jié)合胎齡，出生體重等各種影響因素，做進一步的大數(shù)據(jù)分析,以建立更加符合本實驗室的17a-羥孕酮的切值,以在減少假陽性率的同時防止CAH的漏診。