大視場(chǎng)線掃描共聚焦全息顯微成像

縱浩天，張運(yùn)海，王發(fā)民，繆 新

（1.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，安徽合肥230026；2.中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所江蘇省醫(yī)學(xué)光學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇蘇州215163）

1 引 言

顯微鏡是人類觀察與探索微觀世界的重要工具，它在生物醫(yī)學(xué)和工業(yè)檢測(cè)等領(lǐng)域都發(fā)揮著重要的作用。然而，大部分細(xì)胞或生物組織的光學(xué)吸收系數(shù)很小，利用傳統(tǒng)顯微鏡觀察時(shí)需要對(duì)樣本進(jìn)行染色或熒光標(biāo)記處理，但這種處理往往會(huì)帶來(lái)光毒性和光污染，從而對(duì)細(xì)胞的活性產(chǎn)生不利的影響。針對(duì)這一問(wèn)題，Zernike相襯（Phase Contrast，PC）顯微鏡和微分干涉（Differ?ential Interference Contrast，DIC）顯微鏡應(yīng)運(yùn)而生，為活細(xì)胞非標(biāo)記成像研究提供了有效的手段［1-2］。它們基于光的衍射和干涉原理將樣本的相位差信息轉(zhuǎn)化為振幅信息，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)無(wú)染色樣本的觀察。隨著光學(xué)顯微技術(shù)的發(fā)展，相位成像逐漸成為研究熱點(diǎn)，定量相位成像技術(shù)得到了長(zhǎng)足的發(fā)展［3-11］。

20世紀(jì)50年代，Marvin Minsky發(fā)明了共聚焦顯微鏡，由于它能夠獲得高分辨率、高對(duì)比度的圖像和真正的光學(xué)切片，目前已經(jīng)在工業(yè)檢查、生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［12-14］。然而，傳統(tǒng)的共焦顯微鏡采用基于強(qiáng)度的成像方式，這意味著丟失了樣品的相位信息。為了恢復(fù)相位信息，有研究者在共焦顯微鏡中采用了差分干涉法和電光相位調(diào)制法［15］。近年來(lái)，數(shù)字全息技術(shù)（Digital Holography，DH）作為一種新興的定量相位成像方式，在光學(xué)計(jì)量、生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中得到了廣泛的研究和應(yīng)用［16-18］。DH作為一種寬場(chǎng)成像方式，雖然可以實(shí)現(xiàn)數(shù)字重聚焦，但仍不能抑制離焦光來(lái)實(shí)現(xiàn)真正的光學(xué)切片。

共焦全息顯微鏡（Confocal Holographic Mi?croscopy，CHM）的概念 是由Herring在1997年［19-20］提出的，用于研究微重力下的流體。CHM在成像中需要一個(gè)非常復(fù)雜的光學(xué)系統(tǒng)，這使得它很難應(yīng)用在其他領(lǐng)域。2012年，Goy等［21］將DH合并到點(diǎn)掃描共聚焦顯微鏡（Point-scanning Confocal Microscope，PCM）中，提出了一種數(shù)字點(diǎn)掃描共聚焦顯微鏡（Digital Point-scanning Confocal Microscope，DPCM），并于2013年［22］采集到生物樣品的相位圖。2014年，Schnell等［23］將合成光學(xué)全息術(shù)（Synthetic Optical Holography，SOH）與點(diǎn)掃描共聚焦成像系統(tǒng)結(jié)合，通過(guò)移動(dòng)參考光束實(shí)現(xiàn)了同軸全息，完成了合成光學(xué)全息定量共焦相位成像。2016年，Liu初步驗(yàn)證了線掃描共聚焦與DH結(jié)合的可行性［24］，在實(shí)驗(yàn)中用分辨率板做測(cè)試，但并未使用生物樣本，實(shí)際應(yīng)用中還存在問(wèn)題，比如受光路系統(tǒng)和CCD或CMOS等光電傳感器件的陣列尺寸和像素總數(shù)的限制成像視場(chǎng)過(guò)小，環(huán)境振動(dòng)會(huì)引起相位抖動(dòng)橫紋等，從而限制了這種成像技術(shù)在大視場(chǎng)測(cè)量中的應(yīng)用與推廣。

本文將線掃描共聚焦與離軸DH相結(jié)合，利用位移臺(tái)掃描獲取多條干涉線并合成二維共聚焦全息圖，采用頻域?yàn)V波法提取樣本的振幅與相位分布，實(shí)現(xiàn)線掃描共聚焦全息成像。采用多區(qū)域拼接法，在不影響分辨率的情況下擴(kuò)大了線掃描共聚焦全息成像的視場(chǎng)；且利用相鄰剖面相似的特點(diǎn)校正了環(huán)境、機(jī)械振動(dòng)等外部因素所造成的相位抖動(dòng)橫紋問(wèn)題，為相關(guān)儀器的研制提供了依據(jù)與指導(dǎo)。

2 方 法

線掃描共焦全息成像以DH為基礎(chǔ)，以高相干光源激光器作為光源（目前多為He-Ne激光器），邁克爾遜干涉儀或馬赫-曾德?tīng)枺∕ach-Zehnder，M-Z）干涉儀作為基本光路框架，將高相干的激光分為兩路，分別為探測(cè)光和參考光，利用線探測(cè)光和線參考光發(fā)生干涉從而產(chǎn)生一維干涉條紋。干涉條紋包含了物體的振幅與相位信息。通過(guò)狹縫濾除非焦面雜散光，用CCD作為探測(cè)器記錄干涉條紋進(jìn)而得到全息圖。

2.1 數(shù)字全息

在離軸數(shù)字全息的過(guò)程中，物光波與參考光波以一定的夾角在全息面上發(fā)生干涉并被CCD記錄下來(lái)。物光波的復(fù)振幅含有振幅和相位信息，但是CCD只能記錄強(qiáng)度信息，因此使用參考光與物光波發(fā)生干涉，使物光波的相位信息轉(zhuǎn)化為強(qiáng)度信息，即全息圖，于是相位信息便被記錄在干涉條紋中。后續(xù)的重建過(guò)程即從全息圖的條紋信息中將振幅與相位信息提取出來(lái)并處理。

圖1 離軸全息記錄示意圖Fig.1 Schematic diagram of off-axis holographic record?ing

定義到達(dá)CCD記錄面時(shí)物光波O(x，y)和參考光波R(x，y)的復(fù)振幅分別為：

式中：A1(x，y)和A2(x，y)分別是物光和參考光的振幅分布，φo(x，y)和φr(x，y)分別是物光和參考光的相位分布。CCD記錄面上的光強(qiáng)可以表示為：

將式（1）和式（2）中兩束光波的復(fù)振幅代入式（3）并化簡(jiǎn)可得：

式（4）為全息圖的分布，前兩項(xiàng)表征的是物光波和參考光波的振幅；而第三項(xiàng)則是物光與參考光的干涉項(xiàng)，在全息圖中表現(xiàn)為干涉條紋的分布，包含物光的振幅和相位信息，并且分別受到參考光振幅和相位的調(diào)制。由于物光與參考光存在一定的夾角，引入了參考光的載頻，因此干涉得到的全息圖經(jīng)傅里葉變換后，所得的空間頻譜圖的各干涉像相互分離，在全息圖衍射場(chǎng)中有0級(jí)和±1級(jí)干涉項(xiàng)。在濾波重建的過(guò)程中，需要消去+1級(jí)項(xiàng)中參考光的載頻，消去R*的方法可以表示為：

IR=(|R|2+|O|2)R+|R|2O+RRO*，（5）

式中，第一項(xiàng)為直透光或者零級(jí)像；第二項(xiàng)為+1級(jí)項(xiàng)或者原始像，包含物光的原始信息；第三項(xiàng)是產(chǎn)生畸變的共軛像，也稱為-1級(jí)項(xiàng)。在頻譜中將+1級(jí)項(xiàng)|R|2O單獨(dú)濾出，由于參考光一般為平面波，所以其振幅常作為常數(shù)忽略。一般情況下需要通過(guò)數(shù)值衍射的方式重建物光場(chǎng)，但線掃描共焦全息顯微成像利用的是像面全息，逆變換到空間域后無(wú)需進(jìn)行衍射重建。強(qiáng)度與相位分布分別為：

2.2 線掃描共聚焦全息

2.2.1 光路結(jié)構(gòu)

線掃描共焦全息顯微鏡是在線掃描共聚焦系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，增加一路參考光，形成邁克爾遜干涉儀框架，如圖2所示。激光經(jīng)擴(kuò)束準(zhǔn)直后，經(jīng)柱面鏡CL單方向會(huì)聚，即一個(gè)方向?yàn)槠叫泄?，另一個(gè)方向會(huì)聚，目的是為了在最終樣本面形成一條焦線，后續(xù)需要利用這條焦線掃描成像。由分光棱鏡BS分光后，反射的一路為常規(guī)線掃描共聚焦光路，經(jīng)物鏡在樣本面會(huì)聚成一條焦線，由位移臺(tái)控制樣本移動(dòng)實(shí)現(xiàn)掃描（見(jiàn)圖4）。透射的參考光路中采用和探測(cè)光路中相同的結(jié)構(gòu)，目的是為使兩路的光程差維持在光源的相干長(zhǎng)度內(nèi)，并且使參考光在CCD靶面上會(huì)聚成一條焦線，與物光的焦線發(fā)生干涉，生成共聚焦干涉線并由CCD記錄。為了實(shí)現(xiàn)一維離軸DH，在yoz平面內(nèi)稍微傾斜分光棱鏡BS來(lái)引入一個(gè)離軸角。

圖2 線掃描共聚焦全息成像系統(tǒng)光路Fig.2 Optical path of line-scanning confocal holographic imaging system

2.2.2 處理過(guò)程

由線掃描共聚焦成像的結(jié)構(gòu)可知，在探測(cè)端需要有狹縫濾除離焦光。本文采用的是虛擬狹縫，利用CCD的若干行像素寬度作為狹縫。優(yōu)勢(shì)為后期數(shù)據(jù)處理時(shí)可以根據(jù)具體情況自由調(diào)節(jié)狹縫的寬度。具體公式如下：

式（8）的含義是將虛擬狹縫內(nèi)的若干行像素對(duì)應(yīng)相加作為當(dāng)前第n行的像素值。虛擬狹縫的寬度為：

式中：λ為光源波長(zhǎng)，M為系統(tǒng)放大倍數(shù)，NA為物鏡的數(shù)值孔徑，P為CCD的像素尺寸。

線探測(cè)光與線參考光干涉生成一維干涉線并由CCD記錄，隨著位移臺(tái)的移動(dòng)掃描，CCD再記錄下一個(gè)位置的一維干涉線，以此類推。相對(duì)于針對(duì)每一條線都進(jìn)行全息重建，分別提取振幅與相位然后生成二維圖［24］，本文采用式（8）和式（9）處理每條一維干涉線，然后合成二維全息圖，后續(xù)只需進(jìn)行一次全息重建便可分別獲得振幅與相位圖，處理過(guò)程更加簡(jiǎn)潔高效，處理流程如圖3所示。

圖3 圖像處理流程Fig.3 Flow chart of image processing

2.2.3 抖動(dòng)校正

在位移臺(tái)掃描的過(guò)程中，由于干涉條紋很敏感，環(huán)境振動(dòng)、機(jī)械振動(dòng)可能會(huì)引起線上干涉條紋的整體抖動(dòng)，導(dǎo)致不同線的條紋分布會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)位。而相位信息正包含在條紋分布中，這種錯(cuò)位會(huì)引起相位的偏移。由于是線掃描，所以對(duì)于每一行的像素，其相位偏移值是相同的，利用相鄰行剖面相似的特性，采用下述步驟可以很大程度上校正抖動(dòng)：

（1）用第2行像素的相位減去第1行對(duì)應(yīng)像素的相位，然后對(duì)得到的結(jié)果取平均，得到第2行相對(duì)于第1行的相位偏移量?h1；

（2）第2行所有像素相位值都減去相位偏移量?h1；

（3）用第n+1行像素的相位減去第n行對(duì)應(yīng)像素的相位，然后對(duì)得到的結(jié)果取平均，得到第n+1行相對(duì)于第n行的相位偏移量?hn；

（4）第n+1行減去相位偏移量?hn；以此類推，直至最后一行。

這是一種較為近似的算法，能很大程度上去除抖動(dòng)所產(chǎn)生的橫紋，對(duì)于部分階躍型樣本可能存在較小的誤差，但在絕大多數(shù)情況下可以達(dá)到良好的效果。

2.3 大視場(chǎng)掃描拼接方法

受到線掃描共焦成像系統(tǒng)與CCD靶面尺寸的限制，無(wú)法同時(shí)滿足分辨率與視野的實(shí)際應(yīng)用需求。為了解決這一問(wèn)題，本文采用子圖拼接的方式，在保證CCD采樣分辨率的情況下獲取更大的成像視場(chǎng)。采用位移臺(tái)移動(dòng)掃描的方法實(shí)現(xiàn)多幅子圖的采集，對(duì)采集的子圖拼接，達(dá)到大視場(chǎng)成像的目的，并且結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單。

圖4 子區(qū)域圖像采集的掃描路徑示意圖Fig.4 Schematic diagram of scanning path for image ac?quisition in sub region

在線掃描共焦全息顯微系統(tǒng)中，光源發(fā)出的光束通過(guò)系統(tǒng)后在樣本面形成一條焦線，利用位移臺(tái)控制樣本移動(dòng)實(shí)現(xiàn)焦線對(duì)樣本的掃描，如圖4所示。根據(jù)重疊區(qū)域要求和單次成像區(qū)域大小確定位移臺(tái)沿X方向的位移量，位移臺(tái)每移動(dòng)一個(gè)位置，控制位移臺(tái)沿Y方向移動(dòng)掃描并采集一幅圖像。相比于其他拼接方式［16］，本文為了充分利用線掃描成像的優(yōu)勢(shì)，使后續(xù)拼接過(guò)程更加高效與便捷，利用位移臺(tái)沿Y方向連續(xù)掃描出一矩形區(qū)域，使用矩形區(qū)域拼接的方式，過(guò)程如下：

（1）控制位移臺(tái)移動(dòng)到某一待成像位置后，然后沿Y方向掃描一矩形區(qū)域，命名為A1，位移臺(tái)復(fù)位；

（2）控制位移臺(tái)沿X方向平移一固定步進(jìn)，以步驟1中相同位移量控制位移臺(tái)掃描一矩形區(qū)域，命名為A2，位移臺(tái)復(fù)位；

以此類推，至最后一個(gè)子區(qū)域An，后續(xù)對(duì)A1～An做拼接處理。為了避免信息丟失，子區(qū)域之間需要有一定的重疊區(qū)域，重疊區(qū)域的大小可以根據(jù)沿X軸的視場(chǎng)，通過(guò)控制位移臺(tái)的步進(jìn)調(diào)節(jié)。

常規(guī)拼接算法通常采用基于特征點(diǎn)的圖像配準(zhǔn)方法去確定圖像之間的重疊區(qū)域，然后再進(jìn)行拼接處理。但本文中重疊區(qū)域的大小可根據(jù)位移臺(tái)橫向步進(jìn)值和子區(qū)域橫向視場(chǎng)的大小計(jì)算得到，所以直接進(jìn)行拼接效率更高，拼接算法流程如圖5所示。

圖5 圖像拼接流程示意圖Fig.5 Flow chart of image splicing

根據(jù)圖像重疊部分的大小，將具有含有重疊區(qū)域的子區(qū)域分為非重疊區(qū)域和重疊區(qū)域，例如A與B、C與D。其中B與C為重疊區(qū)域，兩者疊加并平均可得重疊部分E圖，隨后將三部分A，E，D拼合，便可完成子區(qū)域拼接。多幅子區(qū)域圖像之間的拼接與上述相同。重疊區(qū)域的大小是根據(jù)位移臺(tái)橫向步進(jìn)值和子區(qū)域橫向視場(chǎng)計(jì)算得到的，因此拼接精度取決于位移臺(tái)的位移精度。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

線掃描共焦全息顯微鏡系統(tǒng)原理如圖2所示。光源選用He-Ne激光器，波長(zhǎng)為632.8 nm；顯微物鏡放大倍數(shù)為10；探測(cè)器采用面陣CMOS（濱松flash 4.0 V2），像素?cái)?shù)為2 048×2 048，像素尺寸為6.5μm×6.5μm，靶面尺寸約為13 mm，具有自定義工作區(qū)域的功能，本實(shí)驗(yàn)采用的虛擬狹縫就是利用這一功能，工作在條狀區(qū)域下的采集速度可達(dá)7 894 frame/s。柱面鏡CL的焦距f=100 mm，透鏡L4的焦距f=100 mm，筒鏡為OLYMPUS X71顯微鏡內(nèi)置，焦距為180 mm。L3的焦距f=300 mm，可以算得系統(tǒng)的總放大倍數(shù)為30。

局部狹縫內(nèi)線干涉線如圖6所示。根據(jù)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的相關(guān)參數(shù)，由式（9）算得狹縫寬度約為8.9行像素，實(shí)驗(yàn)中取整數(shù)8行，將面陣CMOS工作區(qū)域設(shè)置為2 048×8像素。首先對(duì)分辨率板進(jìn)行成像，由以上過(guò)程合成整幅線掃描二維共聚焦全息圖，如圖7所示。

圖6 局部狹縫內(nèi)的線干涉條紋Fig.6 Line interference fringes in local slit

以圖7（a）中的子區(qū)域A1為例，利用離軸全息重建算法，首先利用傅里葉變換得到其頻譜，可以看到-1級(jí)項(xiàng)、0級(jí)項(xiàng)、+1級(jí)項(xiàng)依次排布。根據(jù)全息重建原理，需要將+1級(jí)項(xiàng)單獨(dú)濾出并頻移到頻譜中心，利用傅里葉逆變換到空間域便可得到物光波復(fù)振幅，可以分別根據(jù)式（6）、式（7）提取物光的振幅與相位，如圖8所示。

圖7 合成二維共聚焦全息圖Fig.7 Synthesis of 2D confocal hologram

圖8 數(shù)據(jù)處理過(guò)程Fig.8 Demonstration of principle for operation and data processing

實(shí)驗(yàn)中采用減去系統(tǒng)空采相位圖的方法去除系統(tǒng)的相位畸變。用離軸全息重建算法分別對(duì)子區(qū)域A1，A2，A3進(jìn)行處理，提取出振幅和相位信息。其中相位圖中的橫紋是由于在位移臺(tái)掃描過(guò)程中，環(huán)境、機(jī)械振動(dòng)引起的條紋抖動(dòng)，導(dǎo)致最終重建出的線掃描共聚焦全息圖中的條紋產(chǎn)生了橫向上的微小錯(cuò)位，使最終重建的相位圖中產(chǎn)生橫紋，符合前期的預(yù)測(cè)。用第二節(jié)中的方法來(lái)校正抖動(dòng)所帶來(lái)的橫紋，效果如圖8（d）所示。圖9為圖8（c）中沿白線和8（d）中對(duì)應(yīng)位置的剖面對(duì)比，校正前后對(duì)比效果明顯，計(jì)算方差可知本次實(shí)驗(yàn)中抖動(dòng)程度降低了約84.7%。

圖9 抖動(dòng)校正前后對(duì)比Fig.9 Comparison before and after jitter correction

圖10 分辨率板成像拼接結(jié)果。（a）拼接后大視場(chǎng)振幅圖；（b）拼接后大視場(chǎng)相位圖；（c）局部放大；（d）（c）中沿虛線部分剖面；（e）與傳統(tǒng)線掃描共聚焦的軸向半高展寬對(duì)比Fig.10 Splicing results of the image of resolution plate.（a）Large field of view amplitude map after splic?ing；（b）Large field of view phase map after splicing；（c）Local magnification of red rectangle area in（a）；（d）Profile along the dashed red line in（c）；（e）Comparison of axial FWHM with tra?ditional line scanning confocal microscope（LCM）

對(duì)子區(qū)域重建后的圖像進(jìn)行拼接處理，拼得大視場(chǎng)圖像如圖10所示。拼接所得的視場(chǎng)達(dá)1 160μm×1 043μm，本文采用線掃描共聚焦成像方式，所以根據(jù)圖像線掃描方向可分為共聚焦方向和非共聚焦方向，理論上共聚焦方向和非共聚焦方向有著不同的成像分辨率，共聚焦方向的成像分辨率要略高于非共聚焦方向［25］。根據(jù)圖10（d）可以看出，分辨率板第8組第6條可以分辨清楚，共聚焦方向分辨率高于2.19μm，非共聚焦方向可分辨第8組第4條，非共聚焦方向分辨率高于2.73μm。由此可見(jiàn)，線掃描共聚焦全息成像的分辨率符合傳統(tǒng)線掃描共聚焦顯微鏡的分辨率的規(guī)律。通過(guò)在物鏡焦面附近沿Z軸方向按相同步進(jìn)值移動(dòng)反射鏡，測(cè)量其成像總強(qiáng)度，然后繪制可得其歸一化強(qiáng)度曲線，如圖10（e）所示。測(cè)兩者的半峰全寬（Full Width Half Maxi?mum，F(xiàn)WHM）可知，線掃描共聚焦全息顯微鏡的軸向分辨率與傳統(tǒng)線掃描共聚焦顯微鏡相當(dāng)。

圖11 為掃描洋蔥表皮細(xì)胞表面的結(jié)果。常見(jiàn)的動(dòng)植物細(xì)胞直徑約為5～100μm，理論上本成像系統(tǒng)的分辨率足以對(duì)一般的生物細(xì)胞成像。這里以洋蔥表皮細(xì)胞為例，圖中細(xì)胞近似長(zhǎng)方形，寬度約為60～100μm，長(zhǎng)度約為150～300 μm。圖11（a）為線掃描共焦掃描并拼接所得的洋蔥細(xì)胞成像圖；圖11（b）為線掃描共焦全息重建并拼接所得的洋蔥細(xì)胞成像圖；圖11（c）為全息重建算法提取出的相位信息，利用最小二乘解包裹算法［26］解包裹處理后拼接所得的相位成像圖。

圖11 洋蔥細(xì)胞大視場(chǎng)成像拼接結(jié)果Fig.11 Image splicing results of onion cells with large field of view

4 結(jié) 論

本文采用線掃描共聚焦與離軸DH相結(jié)合的方法，將獲得的共聚焦干涉線合成二維共聚焦全息圖，采用頻域?yàn)V波法成功提取出分辨率板和洋蔥表皮細(xì)胞的相位信息，實(shí)現(xiàn)了基于共聚焦的定量相位成像。采用相鄰剖面相似的特性校正了由于環(huán)境或機(jī)械振動(dòng)所造成的相位橫紋，使本實(shí)驗(yàn)中重建所得相位圖的抖動(dòng)程度降低了84.7%。并且提出了一種針對(duì)線掃描共聚焦全息成像的大視場(chǎng)成像系統(tǒng)，采用控制位移臺(tái)移動(dòng)樣本掃描的方法達(dá)到對(duì)樣本的大范圍線掃描的目的，實(shí)現(xiàn)了對(duì)大視場(chǎng)子區(qū)域的采集與拼接，達(dá)到了大視場(chǎng)成像的目的。該系統(tǒng)通過(guò)控制位移臺(tái)掃描3個(gè)矩形并且有一定重疊區(qū)域的子區(qū)域進(jìn)行拼接，在不影響成像分辨率的前提下獲得了1 160μm×1 043μm的大視場(chǎng)，并且采集更多子區(qū)域可以獲得更大的視場(chǎng)。它具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)，可為相關(guān)儀器的研制提供參考。