4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的研究

焉媛媛 林 鵬 趙志龍 王秀英

遼寧省檢驗檢測認(rèn)證中心，遼寧 沈陽 110036

4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)為伊立替康脂質(zhì)體注射液中的一種輔料。外觀是白色結(jié)晶粉末，含量：99.0%，分子式: C8H18N2O4S，分子量: 238.31，PH值范圍：6.8-8.2，性質(zhì)比較穩(wěn)定，貯存于2-8℃，陰涼干燥環(huán)境，用于生物緩沖液，對細(xì)胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長時間控制恒定的PH范圍，提升藥物療效，適用于醫(yī)藥產(chǎn)品的原料中。為控制產(chǎn)品質(zhì)量，確保臨床用藥安全開展此項研究工作。

1 材料與儀器

1.1受試物：

1.114-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 規(guī)格原料藥,批號SLBP6989V，國藥一心制藥有限公司。2 . 鱟試劑：湛江安度斯生物有限公司，批號1705082，規(guī)格0.1ml，靈敏度0.125EU·ml-1，湛江博康海洋生物有限公司，批號1704110，規(guī)格0.1ml，靈敏度0.125EU·ml-1。3. 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水：湛江安度斯生物有限公司，批號1703210，規(guī)格2ml。4. 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品：批號150601-201782， 效價60EU·支-1，中國食品藥品檢定研究院。5. 儀器設(shè)備：電子天平，CP124S型 ，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司; 內(nèi)毒素凝膠法測定儀，型號ET-96，天津市天大天發(fā)科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1鱟試劑靈敏度(λ)的復(fù)核試驗 按照《中國藥典》2015年版四部通則1143“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”進(jìn)行檢查。使用靈敏度為0.125 EU·ml-1的鱟試劑。將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋至0.25、0.125、0.06、0.03 EU·ml-1。取復(fù)溶后的0.1ml鱟試劑溶液18支，其中16支分別加入0.1ml不同濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個內(nèi)毒素水平平行做4管；另外2管加入0.1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對照。加完樣品后，輕輕混勻，37±1℃保溫1小時，1小時后記錄試驗結(jié)果。結(jié)果見表1。

表1 鱟試劑靈敏度標(biāo)定結(jié)果

結(jié)果表明，兩個批次的鱟試劑標(biāo)定結(jié)果均在0.5λ～2λ之間可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

2.2細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定 根據(jù)制劑處方工藝，伊立替康脂質(zhì)體注射液中鹽酸伊立替康與HEPES的投料質(zhì)量比基本一致，因此HEPES內(nèi)毒素限值可以參考鹽酸伊立替康的限值來確定。參照《中國藥典》2015年版四部通則9301“注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則”及1143“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定，并求得最大無干擾濃度。

本品最大用量為：L=K·M-1

M為人用每公斤體重每小時最大劑量，臨床用法用量：70mg·(m2)-1，靜脈滴注90分鐘以上，每2周一次。

K為靜脈給藥途徑，人用每公斤體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量,為5EU·(Kg·h)-1。

計算本品限值：L = K·M-1= 5EU·(kg·h)-1/70mg·(m2·1.5h)-1×0.027= 4EU·mg-1。

根據(jù)“化學(xué)藥品注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則”要求，本品理論限值為4EU·mg-1，本品申報限值為1EU·mg-1，約為計算限值的1/3，限值設(shè)置合理。

2.3供試品干擾試驗預(yù)試驗 按照《中國藥典》2015年版四部通則1143“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”檢查。使用靈敏度為0.125 EU·ml-1的鱟試劑，供試品濃度為0.2mg·ml-1溶液，陰性對照為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，陽性對照為0.25EU·ml-1內(nèi)毒素溶液，供試品陽性對照為以供試液稀釋的0.25EU·ml-1的內(nèi)毒素溶液，加完樣品后，鱟試劑管用封口膜封好，輕輕混勻，37±1℃保溫1小時，1小時后記錄試驗結(jié)果。結(jié)果見表2。

表2 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)干擾預(yù)試驗結(jié)果

結(jié)果表明，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)0.2mg·ml-1溶液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查符合規(guī)定，初步確定0.2mg/ml溶液為最大無干擾濃度，0.2mg·ml-1溶液及以下濃度對樣品無干擾。

2.4供試品干擾試驗 按《中國藥典》2015年版四部通則1143“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”進(jìn)行干擾試驗，使用濃度為0.2mg·ml-1的供試品溶液。使用湛江安度斯生物有限公司和湛江博康海洋生物有限公司生產(chǎn)的鱟試劑，靈敏度分別為0.125 EU·ml-1。將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋至0.25、0.125、0.06、0.03 EU·ml-1，供試品組用4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)0.2mg·ml-1溶液代替細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至0.25、0.125、0.06、0.03EU·ml-1，加完樣品后，鱟試劑管用封口膜封好，輕輕混勻，37±1℃保溫1小時，1小時后記錄試驗結(jié)果。結(jié)果見表3。

表3 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)干擾試驗結(jié)果

結(jié)果表明，用兩個廠家生產(chǎn)的鱟試劑進(jìn)行干擾試驗，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)0.2mg·ml-1溶液對鱟試劑無干擾。

2.5細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 根據(jù)本品臨床用法用量，計算得出其細(xì)菌內(nèi)毒素限值參考標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)干擾試驗確證，其細(xì)菌內(nèi)毒素限值標(biāo)準(zhǔn)可擬定為“每1mg中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于1EU”。

計算公式為：C=λ/L =0.125EU/ml/1EU/mg=0.1mg/ml按《中國藥典》2015年版四部通則1143“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”檢查。使用靈敏度為0.125EU·ml-1的鱟試劑，供試品濃度為0.2mg·ml-1溶液，陰性對照為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，陽性對照為0.25EU·ml-1內(nèi)毒素溶液，供試品陽性對照為以供試品2倍稀釋液稀釋的0.25EU·ml-1的內(nèi)毒素溶液，加完樣品后，輕輕混勻，37±1℃保溫1小時，1小時后記錄試驗結(jié)果。結(jié)果見表4。

表4 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查試驗結(jié)果

結(jié)果表明，按照擬定標(biāo)準(zhǔn)檢驗，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查符合規(guī)定。

3 討 論

(一) 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)臨床用法用量：70mg·(m2)-1，靜脈滴注90分鐘以上，每2周一次。本品內(nèi)毒素限值擬定為1EU·mg-1，對1批樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查符合規(guī)定。4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)是輔料，也是生物緩沖液，無細(xì)胞毒性，可以減小伊立替康脂質(zhì)體注射液引起的毒性反應(yīng)。

(二)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法和傳統(tǒng)熱原檢查法的比較，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法用鱟試劑其靈敏度高，準(zhǔn)確性強，操作方便，受客觀影響因素較少；熱原檢查法，需要用家兔做試驗，成本高，誤差大，受客觀影響因素較多?，F(xiàn)在越來越多的藥品施行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。

(三)伊立替康脂質(zhì)體注射液，是抗腫瘤藥物，藥理作用為伊立替康是半合成喜樹堿的衍生物，它是一種治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的有效藥物。喜樹堿可特異性地與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ結(jié)合，后者誘導(dǎo)可逆性單鏈斷裂，從而使DNA雙鏈結(jié)構(gòu)解旋；伊立替康及其活性代謝物SN-38可與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ—DNA復(fù)合物結(jié)合，從而阻止斷裂單鏈的再連接。2015年美國FDA批準(zhǔn)伊立替康脂質(zhì)體注射液用于治療晚期胰腺癌。它可以使腫瘤增長開始時間延遲，伊立替康脂質(zhì)體注射液與氟尿嘧啶/亞葉酸聯(lián)合用藥可以使患者平均生存期延長為6.1個月，而單純用伊立替康脂質(zhì)體注射液治療患者生存期未見改善。另外，伊立替康脂質(zhì)體注射液還是廣譜抗腫瘤藥物，對乳腺癌、胃腺癌都有抗腫瘤活性，還能抑制乙酰膽堿酯酶。伊立替康脂質(zhì)體注射液發(fā)展前景廣闊，值得深入研究。