毛蚴感染對湖北釘螺生存及抗氧化酶系統(tǒng)的影響

易佳，何匯，李博，涂珍，唐麗，張聰，劉建兵

湖北省疾病預(yù)防控制中心，湖北 武漢 430079

湖北釘螺(Oncomelaniahupensis)是日本血吸蟲的唯一中間宿主，日本血吸蟲毛蚴必須在釘螺體內(nèi)經(jīng)過無性繁殖才能發(fā)育為感染人、畜的尾蚴[1]。因此，釘螺在日本血吸蟲病的傳播與流行中起著關(guān)鍵作用[2-3]，而控制和消滅釘螺是防控血吸蟲病的重要措施[4-6]。為了更好實(shí)現(xiàn)防控血吸蟲病的目標(biāo)，開展釘螺的生活史研究(包括血吸蟲毛蚴感染階段)就顯得尤為重要。眾所周知，包括釘螺在內(nèi)的所有生物體其體內(nèi)的氧化還原平衡是機(jī)體正常行使功能的基礎(chǔ)。因此，評估釘螺感染毛蚴后其抗氧化酶體系的變化對全面認(rèn)識釘螺生活史具有重要意義。生物體內(nèi)的氧化還原平衡主要由超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、過氧化物酶(peroxidase，POD)等組成的抗氧化酶系統(tǒng)調(diào)節(jié)。當(dāng)化學(xué)物質(zhì)或機(jī)體自身的應(yīng)激反應(yīng)激發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生過多的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)時，SOD、CAT和POD可協(xié)同發(fā)揮作用，清除活性氧自由基，對增強(qiáng)吞噬細(xì)胞防御能力和機(jī)體免疫功能有重要作用[7]。當(dāng)抗氧化防御系統(tǒng)遭到破壞時，活性氧自由基不斷積累并攻擊細(xì)胞膜的脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)生丙二醛(malondialdehyde，MDA)，引起氧化損傷反應(yīng)[8-9]。

毛蚴感染釘螺后，釘螺體內(nèi)的免疫應(yīng)答反應(yīng)將導(dǎo)致螺體內(nèi)產(chǎn)生大量的不穩(wěn)定活性氧自由基，進(jìn)而可能誘導(dǎo)機(jī)體抗氧化酶體系激活以適應(yīng)高度的氧化脅迫壓力[10]。然而，目前湖北釘螺對日本血吸蟲侵襲感染的氧化應(yīng)激響應(yīng)及免疫防御機(jī)制仍不清楚。本研究探討了毛蚴入侵對釘螺存活情況和抗氧化酶體系的影響，旨在為釘螺免疫功能的研究提供參考，也為更加全面認(rèn)識釘螺生活史提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 在春季藥物滅螺前從湖北省陽新縣現(xiàn)場采集肋殼釘螺，室內(nèi)經(jīng)逸蚴法鑒定為陰性后，用爬行法選取活力較強(qiáng)的成螺(7～8個螺旋)用于實(shí)驗(yàn)。采用湖北省血吸蟲病防治研究所實(shí)驗(yàn)室數(shù)次傳代的日本血吸蟲湖北株尾蚴人工感染家兔，45 d后解剖分離兔肝臟，用搗碎法提取新鮮蟲卵，按常規(guī)方法孵化獲得毛蚴。

1.2實(shí)驗(yàn)處理及樣本采集 實(shí)驗(yàn)設(shè)置對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組各設(shè)3個平皿做平行對照。每個平皿中放入500只釘螺，實(shí)驗(yàn)組釘螺毛蚴感染參照文獻(xiàn)[11]，采用釘螺群體感染法，按釘螺與毛蚴數(shù)量比為1∶10的比例量取毛蚴孵化液至平皿中；對照組加入同等體積不含毛蚴的去氯水至平皿中。兩組同樣置于25℃室溫4 h，并蓋上尼龍紗網(wǎng)防止釘螺爬出。4 h后，將對照組和實(shí)驗(yàn)組釘螺分別置于泥缽中飼養(yǎng)，溫度保持在22℃。每3天換水加飼料1次，每天清除其中的死亡釘螺并記錄各組死亡數(shù)量。此外，在感染后的0、6、12、24、48、72 h和1、2、4、6、8、12周從每個泥缽隨機(jī)挑取10只活釘螺，迅速置于解剖鏡下進(jìn)行解剖，快速分離出軟體組織，準(zhǔn)確稱取釘螺軟體組織重量，做好標(biāo)記，置于-80℃保存待用。

1.3酶活性的測定 按釘螺組織與生理鹽水質(zhì)量比為1∶9的比例加入生理鹽水，冰水浴條件下機(jī)械勻漿。充分勻漿后，700g離心10 min，取上清液用于蛋白質(zhì)濃度、酶活及MDA含量的測定。試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，所有測定步驟均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。蛋白濃度測定采用考馬斯亮藍(lán)法，測定單位為 g/L；SOD活性測定采用WST-1法，SOD活力單位定義為37℃下，每毫克組織蛋白(mg prot)在每毫升反應(yīng)液中超氧化物歧化酶抑制率達(dá)50%時所對應(yīng)的酶量為1個活力單位(U)；CAT活性測定采用可見光法，CAT活力單位定義為每毫克組織蛋白(mg prot)每秒鐘分解1 μmol H2O2的量為1個活力單位(U)；POD測定采用比色法，POD活力單位定義為37℃下，每毫克組織蛋白(mg prot)每分鐘催化1 μg底物的酶量為1個活力單位(U)；采用TBA法測定釘螺組織中的MDA含量。

1.4數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)整理后，用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)算各觀察時間釘螺的死亡率、酶活性及MDA含量(以算術(shù)均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示)，并用χ2檢驗(yàn)比較釘螺存活情況，用雙因素方差分析及多重比較分析不同時間點(diǎn)兩組間酶活力及MDA含量的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1釘螺感染血吸蟲毛蚴后的死亡情況 自感染結(jié)束第1周起，每周實(shí)驗(yàn)組和對照組均有釘螺死亡，但有血吸蟲感染的實(shí)驗(yàn)組釘螺每周死亡率均高于對照組，且二者之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。第10周后實(shí)驗(yàn)組釘螺死亡數(shù)增多，至15周時實(shí)驗(yàn)組釘螺累計(jì)死亡率為43.60%，對照組累計(jì)死亡率為5.93%。

表1 釘螺死亡情況

2.2釘螺感染血吸蟲毛蚴后72 h內(nèi)抗氧化酶活性及丙二醛含量變化 釘螺感染血吸蟲毛蚴后72 h內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組和對照組釘螺SOD、CAT、POD活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(SOD：F=34.63，P<0.01；CAT：F=23.50，P<0.01；POD：F=8.594，P<0.01)，實(shí)驗(yàn)組釘螺SOD、CAT、POD活性隨時間逐步升高。釘螺感染血吸蟲毛蚴后24、48、72 h，實(shí)驗(yàn)組SOD活性分別為(42.78±5.81)U/mg prot、(46.11±2.91)U/mg prot和(47.91±2.12)U/mg prot，與對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)(圖1a)；感染血吸蟲毛蚴后72 h，實(shí)驗(yàn)組CAT和POD活性分別為(23.15±1.21)U/mg prot和(15.66±1.44)U/mg prot，較對照組相比活性上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)(圖1b、圖1c)。

注：與對照組比較，*表示P<0.05；**表示P<0.01。

2.3釘螺感染血吸蟲毛蚴后12周內(nèi)抗氧化酶活性及丙二醛含量變化 釘螺感染血吸蟲毛蚴后12周內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組和對照組SOD、CAT、POD活性和MDA含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(SOD：F=88.00，P<0.01；CAT：F=68.69，P<0.01；POD：F=49.19，P<0.01；MDA：F=56.1，P<0.01)。與對照組相比，感染血吸蟲毛蚴的釘螺組SOD活性在第1周出現(xiàn)上升，第4周到達(dá)峰值，第6周開始下降至對照組水平，隨后趨于穩(wěn)定，第1、2、4周實(shí)驗(yàn)組SOD活性與對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)(圖2a)。實(shí)驗(yàn)組CAT活性在第1周就達(dá)到峰值，隨后開始下降，第4周開始趨近于對照組水平，隨后趨于穩(wěn)定。與對照組相比，第1、2周CAT活性上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)(圖2b)。實(shí)驗(yàn)組POD活性在第1周出現(xiàn)上升，第2周到達(dá)峰值，第4周下降，隨后趨于穩(wěn)定。與對照組相比，第1、2周POD活性上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)(圖2c)。實(shí)驗(yàn)組MDA含量隨著時間逐漸上升，自第2周開始，MDA含量均高于對照組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)(圖2d)。

注：與對照組比較，*表示P<0.05；**表示P<0.01。

3 討 論

釘螺感染血吸蟲后，會產(chǎn)生幼蟲移行的機(jī)械損傷、螺體抗感染的免疫損害、營養(yǎng)物質(zhì)被掠奪的生理代謝紊亂等損害，甚至導(dǎo)致死亡[12]。關(guān)于毛蚴侵入對釘螺生存生長的影響，熊春蓉等[13]發(fā)現(xiàn)釘螺與毛蚴按照數(shù)量1∶20比例室內(nèi)人工群體感染4 h后，60 d釘螺死亡率高達(dá)71.1%。田月等[14]用不同宿主源性日本血吸蟲毛蚴單個釘螺感染法感染釘螺，釘螺與毛蚴數(shù)量比為1∶5，感染4 h并室內(nèi)飼養(yǎng)60 d后，釘螺死亡率為13.5%～49.5%，平均死亡率為 26.8%。本研究中，釘螺人工感染血吸蟲毛蚴后，15周(105 d)時累計(jì)死亡率為43.60%，與張聰?shù)萚11]室內(nèi)人工感染后110 d釘螺死亡率為43.80%的研究結(jié)果較為接近。對照組釘螺15周時累計(jì)死亡率僅為5.93%。以往研究報道感染螺的壽命一般為3～6個月，感染了血吸蟲的釘螺死亡率明顯增高，生存時間顯著縮短[15]。

釘螺通常能夠通過抗菌肽、凝集素、溶菌酶、酚氧化酶等體液免疫方式攻擊入侵的寄生蟲[16-18]。除體液免疫外，釘螺血淋巴細(xì)胞也會通過吞噬、胞飲和細(xì)胞毒反應(yīng)防御入侵的寄生蟲，在此過程中血淋巴細(xì)胞會消耗大量的氧，并產(chǎn)生多種活性氧化物。釘螺等需氧生物具有SOD、CAT和 POD等組成的較為完整的抗氧化酶系統(tǒng)，能及時清除活性氧化物，而使自身免于遭受氧化傷害[19-20]。本研究中，感染早期釘螺的抗氧化酶活性升高，SOD活力在24 h、CAT和POD活力在72 h開始與對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，MDA值72 h內(nèi)無明顯變化，說明毛蚴入侵能夠誘導(dǎo)釘螺啟動抗氧化系統(tǒng)，產(chǎn)生抗氧化防御，即為了阻止活性氧帶來的氧化損傷，螺體內(nèi)合成分泌大量SOD、CAT和POD來維持正常的新陳代謝。隨著時間的延長，抗氧化酶活性逐漸降低，SOD活性在感染后第6周、CAT和POD活性在第4周時趨近于對照組水平。而MDA自第2周開始呈現(xiàn)不斷積累趨勢，可能是抗氧化酶系統(tǒng)逐漸遭到破壞，大量活性氧自由基不能及時清除，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物增多，丙二醛含量增多間接反映了釘螺氧化損傷程度在不斷加劇，這也與感染釘螺死亡情況相一致。自第2周開始，實(shí)驗(yàn)組和對照組釘螺死亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且隨時間延長，氧化損傷加劇，實(shí)驗(yàn)組釘螺死亡率逐漸升高。

總之，本研究表明感染早期釘螺能夠通過調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性來適應(yīng)毛蚴入侵的脅迫，以清除體內(nèi)積累的活性氧自由基，免受氧化損傷。然而，隨著毛蚴在釘螺體內(nèi)增殖、生長和發(fā)育，釘螺的抗氧化酶體系可能逐漸失效，釘螺組織氧化損傷的程度加劇，導(dǎo)致釘螺出現(xiàn)死亡。本研究有助于加深對血吸蟲與釘螺共存機(jī)制的認(rèn)識，也為釘螺免疫功能的研究提供參考依據(jù)。