去甲烏藥堿對(duì)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的影響研究

翁嘉灝 周 苗 孫思明

（上海市中醫(yī)醫(yī)院，上海200071）

血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）是構(gòu)成血管壁組織結(jié)構(gòu)及維持其正常生理功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，其結(jié)構(gòu)和功能的改變?nèi)绠惓Ｔ鲋?、遷移、表型轉(zhuǎn)化等是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓和血管成形術(shù)后再狹窄等多種心血管疾病共同的細(xì)胞病理學(xué)基礎(chǔ)[1]。附子是“回陽救逆第一品”，自《傷寒論》開始，就被用于治療心力衰竭類似癥狀。近年來研究發(fā)現(xiàn)去甲烏藥堿作為附子主要水溶性單體，具有抗血小板凝集、增加心臟收縮力及收縮頻率、抗心肌細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞凋亡等作用[2-4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)去甲烏藥堿能夠通過β2/PI3K/AKT通路抑制成年小鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激引起的凋亡，亦有研究證明其能夠通過興奮β2受體松弛氣管平滑肌，而對(duì)于VSMC的研究尚未見報(bào)道。因此本研究通過體外培養(yǎng)大鼠VSMC，觀察去甲烏藥堿對(duì)VSMC遷移和增殖的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，體重180～200 g，雄性，許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0004。

1.2 試劑與儀器 去甲烏藥堿（上海同田生物技術(shù)有限公司，批號(hào)5843-65-2），水合氯醛（由上海市中醫(yī)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供），Ⅱ型膠原酶（美國(guó)Worthington Biochemical公司，批 號(hào)F8H18380），胰彈性蛋白酶（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)SLBV9311），DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)SH30243.01），磷酸緩沖鹽溶液（PBS，美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)SH30256.01），胎牛血清（FBS，南美AnLite公司，批號(hào)170216），CCK-8試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)C0039）。

生物安全柜（Heal Force），隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅），超凈工作臺(tái)（上海博迅），CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司），恒溫?fù)u床（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備），酶標(biāo)系統(tǒng)多功能儀（上海百基生物），倒置顯微鏡（萊卡），低溫高速離心機(jī)（Sigma公司），純水機(jī)Cascada TMIX（頗爾），6孔板、96孔板（美國(guó)Corning公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 血管平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng) 雄性SD大鼠3～5只，用10%水合氯醛0.1 mL/100g腹腔注射麻醉，無菌條件下迅速取出胸主動(dòng)脈，取出后用DMEM培養(yǎng)基將主動(dòng)脈腔內(nèi)殘留的血液沖洗干凈。用鑷子去除血管周圍脂肪及結(jié)締組織，并用PBS沖洗3次。將沖洗干凈的胸主動(dòng)脈放入0.1%Ⅱ型膠原酶培養(yǎng)皿中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化45 min左右，消化后的組織轉(zhuǎn)到DMEM培養(yǎng)基中。在顯微鏡下剝除外膜，刮除內(nèi)膜，再將剩余的血管中膜移至干凈的培養(yǎng)皿中剪碎（約1 mm×1 mm左右大?。?，加入0.1%的胰蛋白酶溶液和胰彈性蛋白酶的平衡鹽溶液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化，放置1h后置37℃搖床中，消化過夜。將消化好的組織塊1000 r/min離心10 min（離心半徑10 cm），倒去上清液，加入20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，吹打混勻后，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每3 d換液1次。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞選用4～6代細(xì)胞進(jìn)行。

2.2 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)觀察去甲烏藥堿對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響 待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合時(shí)，將細(xì)胞分為不同濃度（0，10，30，100 μmol/L）去甲烏藥堿處理組。在備用的6孔板背面做好標(biāo)記，每孔間隔相等距離水平橫向畫出3條線。選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的VSMC按照每孔5×105個(gè)細(xì)胞均勻接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至均勻鋪滿時(shí)，按標(biāo)記線以垂直方向平均相等距離使用無菌200 μL槍頭快速劃下，PBS漂洗，去除漂浮細(xì)胞，加入無血清DMEM培養(yǎng)液，使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞遷移程度并拍照，即0h細(xì)胞遷移狀態(tài)。再將細(xì)胞放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，拍照記錄。以上均用顯微鏡在4倍鏡下記錄細(xì)胞遷移狀態(tài)，每孔平均9張圖片，采用Image-Pro plus 6.0軟件對(duì)遷移距離進(jìn)行分析。

細(xì)胞遷移率=（0h劃痕寬度－培養(yǎng)后劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%

2.3 CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)去甲烏藥堿對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖功能的影響 在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)至80%左右的VSMC消化、離心、計(jì)數(shù)，用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整至5×104個(gè)/mL，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。第2天將原培養(yǎng)基換成0.1%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后換含有去甲烏藥堿的培養(yǎng)基，濃度分別為0、10、30、100 μmol/L，孵育24 h后棄去培養(yǎng)基。棄去上清后，每孔加入100 μL、10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，再加入10 μL CCK-8液，將培養(yǎng)板繼續(xù)放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。置酶聯(lián)檢測(cè)儀上測(cè)定各孔于450 nm處光密度（OD）值，根據(jù)每孔OD值計(jì)算藥物干預(yù)后細(xì)胞的增殖率。

增殖率（細(xì)胞活力）＝（OD實(shí)驗(yàn)組－OD空白對(duì)照組）/（OD陰性對(duì)照組－ OD空白對(duì)照組）×100%。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以上試驗(yàn)各組重復(fù)3次，所有數(shù)-據(jù)均使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理分析，以（±s）表示。2組之間統(tǒng)計(jì)分析使用student’s分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 不同濃度去甲烏藥堿對(duì)平滑肌細(xì)胞遷移能力的影響 結(jié)果表明，30 μmol/L及以上濃度去甲烏藥堿具有明顯的抑制細(xì)胞遷移距離的作用，且呈劑量依賴性，見圖1。

3.2 不同濃度去甲烏藥堿對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖能力的影響 本研究各劑量去甲烏藥堿均能明顯抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，且呈現(xiàn)劑量依賴性，見圖2。

圖1 不同濃度去甲烏藥堿對(duì)平滑肌細(xì)胞趨化遷移能力的影響

圖2 不同濃度去甲烏藥堿對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖能力的影響

4 討論

血管重塑性疾病指因內(nèi)皮損傷、血管平滑肌細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)沉積所致的血管壁增厚和管腔狹窄性心血管疾病，包括動(dòng)脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后再狹窄、高血壓等，隨著病程的進(jìn)展會(huì)不同程度地影響靶器官的功能[5]。VSMC是動(dòng)脈中層的主要成分，主要分為收縮型和分泌型兩種表型。正常成人動(dòng)脈血管的平滑肌細(xì)胞以收縮型為主，其主要功能是維持血管的彈性和收縮血管。在各種刺激下，VSMC在靜態(tài)收縮和增殖合成表型之間發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，進(jìn)而導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞的異?；罨⒃鲋?、遷移以及表達(dá)SMC標(biāo)記-α平滑肌肌動(dòng)蛋白等，是病理性血管重建的重要病理標(biāo)志，在動(dòng)脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后再狹窄、旁路靜脈移植失敗、同種異體移植血管病變等多種血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6-8]。

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化心臟病可歸屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”“胸痛”“真心痛”等范疇，其主要病機(jī)是“瘀血阻滯，郁結(jié)于血脈”，根據(jù)“久病多瘀”“久病多虛”的理論，臨床以“活血，溫通”為治療大法。附子具有回陽救逆、溫陽散寒之效?，F(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)附子具有強(qiáng)心、抗心衰、抗心腦缺血和抗心律失常等功能[9]。有研究表明附子中表達(dá)強(qiáng)心作用的主要成分是去甲烏藥堿[10]。

去甲烏藥堿作為附子強(qiáng)心成分的主要水溶性單體，具有強(qiáng)心、擴(kuò)血管、抗血小板凝集等心血管多靶點(diǎn)作用[11]?，F(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為，去甲烏藥堿還具有血流動(dòng)力學(xué)作用，亦可作為一種血管擴(kuò)張劑來降低主動(dòng)脈阻抗和全身血管阻力以及降低后負(fù)荷。此外，相比其他正性肌力藥物，去甲烏藥堿還具有一個(gè)優(yōu)勢(shì)，其血流動(dòng)力學(xué)作用只有幾分鐘，從而能快速達(dá)到所需的血流動(dòng)力學(xué)反應(yīng)，但也意味著輸液停止后去甲烏藥堿的作用也會(huì)迅速消失。去甲烏藥堿通過靜脈給藥后有短時(shí)間內(nèi)起效快的藥理作用，對(duì)急性心力衰竭的短期治療很有價(jià)值。同時(shí)，去甲烏藥堿的血管擴(kuò)張作用，以及強(qiáng)大的正性肌力作用，除了可以作用于VSMC，還對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞起到抗炎作用，從而抑制新生內(nèi)膜的形成[12-14]。因此，去甲烏藥堿通過抑制平滑肌細(xì)胞的合成狀態(tài)阻斷血管狹窄性疾病的發(fā)展代表了一種新的治療方法。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，去甲烏藥堿有抑制平滑肌細(xì)胞趨化遷移和增殖的作用，且濃度越高細(xì)胞的遷移能力越弱，增殖率越低。

本研究結(jié)果從體外證明了去甲烏藥堿能夠抑制平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移能力，但是關(guān)于去甲烏藥堿引起VSMC功能改變的具體作用機(jī)制仍在探索中。在多種影響平滑肌細(xì)胞生物學(xué)行為和功能的因素中，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）作為一種多功能肽，是VSMC重要的調(diào)節(jié)因素，對(duì)VSMC有著廣泛的調(diào)節(jié)。它能調(diào)節(jié)血管緊張度，調(diào)節(jié)VSMC生長(zhǎng)凋亡，促進(jìn)細(xì)胞遷移和胞外基質(zhì)沉積，促進(jìn)細(xì)胞炎癥反應(yīng)。因此，AngⅡ介導(dǎo)的VSMC信號(hào)通路機(jī)制也顯得十分重要。下一步我們將以AngⅡ信號(hào)通路作為切入點(diǎn)，從體內(nèi)及體外進(jìn)一步深入研究去甲烏藥堿的具體作用機(jī)制，從而為心血管疾病的防治提供藥理學(xué)依據(jù)。