神經(jīng)電刺激對腦外傷昏迷大鼠前額葉皮質(zhì)5-羥色胺2A和γ-氨基丁酸b受體表達的影響

李益歡 錢春生 張斌 何云文 陳傳新

(江蘇大學(xué) 1醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2附屬金壇醫(yī)院神經(jīng)外科)

腦外傷導(dǎo)致的昏迷仍是世界范圍內(nèi)的難題，對患者本人和家庭的影響巨大〔1〕。近年來，部分學(xué)者認(rèn)為迷走神經(jīng)電刺激具有一定的促醒潛能，可通過刺激迷走神經(jīng)對大腦皮層重要區(qū)域進行調(diào)控，但具體機制尚未闡明〔2〕。5-羥色胺2A受體(5-HT2AR)和γ-氨基丁酸b受體(GABAbR)是腦內(nèi)與睡眠覺醒密切相關(guān)的物質(zhì)〔3〕。為探究迷走神經(jīng)電刺激對兩者表達的影響，本研究對腦外傷昏迷大鼠進行相關(guān)實驗。

1 資料和方法

1.1實驗動物及分組 108只雄性成年SD大鼠(由華西醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)，清潔級，體質(zhì)量250～300 g，自然光照下常規(guī)飼養(yǎng)，室溫保持在23℃左右。根據(jù)隨機數(shù)字表法將其分為刺激組、假刺激組和空白組各36只。實驗大鼠均健康，刺激組平均體重(232.7±7.6)g，假刺激組平均體重(233.5±7.7)g，空白組平均體重(233.0±7.5)g，3組大鼠體重?zé)o顯著差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2實驗設(shè)備及試劑 (1)MNT冷凍切片機(德國SLEE公司)；(2)ES-420型電刺激儀(日本伊藤超短波株式會社)；(3)Eppendorf 5427 R臺式高速冷凍離心機(艾本德中國有限公司)；(4)MY2300全自動免疫組織化學(xué)染色儀(澳大利亞郝思林公司)；(5)兔抗GABAbR抗體(ab75239)和兔抗5-HT2AR抗體(BA47258)均購自武漢博士德有限公司；(6)10%水合氯醛(青島宇龍海藻有限公司)。

1.3實驗方法

1.3.1腦外傷昏迷大鼠模型制備 通過自由落體撞擊法制備腦外傷昏迷大鼠模型。具體步驟：將刺激組和假刺激組大鼠放在標(biāo)本缸中，腹腔注射10%水合氯醛麻醉(0.5 ml/100 g)。麻醉后頭頂備皮消毒，逐層切開至暴露頂骨。在人字縫與顱頂冠狀縫交點處固定一圓形鐵板。大鼠恢復(fù)后爪疼痛刺激反射時，采用重400 g的金屬撞擊錘由40 cm高度自由下落撞擊鐵板。撞擊后30 min評估大鼠意識狀態(tài)，以翻正反射消失和(或)后爪疼痛反射消失并持續(xù)30 min定義為昏迷狀態(tài)，建模成功〔4〕。

1.3.2實驗過程及切片制備 將建模成功的刺激組大鼠仰臥位固定，去除頸毛，在胸骨與喉部間沿正中線取3 cm切口，將胸骨甲狀肌和胸骨舌骨肌分離、固定。找到頸動脈鞘后將頸部肌肉和皮膚固定，用止血鉗將左側(cè)迷走神經(jīng)鈍性分離3 cm。將電極連接至左側(cè)迷走神經(jīng)進行電刺激(電流1.5 mA，脈寬0.6 ms，頻率25 Hz)，單次刺激時間30 s，兩次間隔時間5 min，總刺激時間5 min。電刺激結(jié)束后去除電極，縫合切口，消毒后放回籠中。假刺激組手術(shù)操作同刺激組，但無電流輸出?？瞻捉M實驗全程無任何處理。3組于干預(yù)后12 h和24 h時分別以灌注過量10%水合氯醛的方式處死18只大鼠。處死后取前額葉皮質(zhì)，先后經(jīng)固定、脫水等處理后制得5 μm切片。

1.3.3免疫組織化學(xué)測定 將制得的切片首先脫蠟，然后浸泡于75%枸櫞酸鈉溶液中，時間20 min。后經(jīng)由磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液沖洗(0.02 mol/L)，時間20 min。室溫條件下，將沖洗后的切片先后經(jīng)20%過氧化氫浸泡和蒸餾水沖洗，分別為15 min。滴加兔抗GABAbR抗體(1∶300)和兔抗5-HT2AR抗體(1∶300)，靜置12 h(環(huán)境溫度2℃)，染色，于配套顯色盒下顯色。

1.4觀察指標(biāo) (1)定義翻正反射出現(xiàn)為覺醒，干預(yù)后12 h記錄各組覺醒大鼠數(shù)量〔5〕；(2)顯微鏡下觀察前額葉皮質(zhì)中GABAbR和5-HT2AR陽性細(xì)胞的數(shù)量，以染色呈棕色或棕褐色為陽性細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)，計算免疫組化(IHC)評分。評分標(biāo)準(zhǔn)：A表示陽性細(xì)胞數(shù)量級，<1%計0分，1%～10%計1分，11%～50%計2分，51%～80%計3分，81%～100%計4分；陽性細(xì)胞染色程度分級用B表示，分別計0～3分，依次對應(yīng)陰性、弱陽性、陽性和強陽性。IHC=A×B〔6〕。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件進行方差分析、獨立樣本t檢驗、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.13組大鼠意識狀態(tài)比較 刺激組和假刺激組大鼠均建模成功。干預(yù)后12 h，3組覺醒大鼠比例由高到低依次為空白組〔36只(100.0%)〕、刺激組〔27只(75.0%)〕和假刺激組〔13只(36.1%)〕，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.23組不同時間點前額葉皮質(zhì)5-HT2AR IHC評分 干預(yù)后12、24 h時3組前額葉皮質(zhì)5-HT2AR IHC評分由高到低依次為空白組、刺激組和假刺激組，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。各組不同時間點前額葉皮質(zhì)5-HT2AR IHC評分差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表1，圖1。

表1 3組不同時間點前額葉皮質(zhì)5-HT2AR IHC評分比較

空白組

刺激組

假刺激組

2.33組不同時間點前額葉皮質(zhì)GABAbR IHC評分比較 干預(yù)后12 h和24 h時3組前額葉皮質(zhì)GABAbR IHC評分由高到低依次為假刺激組、空白組和刺激組(均P<0.05)。各組不同時間點前額葉皮質(zhì)GABAbR IHC評分差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表2，圖2。

表2 3組不同時間點前額葉皮質(zhì)GABAbR IHC評分比較

空白組

刺激組

假刺激組

3 討 論

昏迷是腦外傷后最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，約15%腦外傷昏迷患者出院時仍處于昏迷狀態(tài)，不僅大大降低了整個家庭的生活質(zhì)量，同時加重了經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，對于此類病人的促覺醒治療一直是臨床上不易攻克的難關(guān)〔7〕。神經(jīng)刺激法治療腦外傷昏迷由來已久，常見方法包括經(jīng)顱磁刺激、正中神經(jīng)電刺激、經(jīng)顱直流電刺激等，效果不甚理想，同時具有較大的副作用〔8〕。迷走神經(jīng)屬于混合型神經(jīng)纖維，其在大腦皮質(zhì)內(nèi)廣泛性投射的解剖特點一直被認(rèn)為是治療各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)〔9〕。動物實驗證實，電刺激大鼠的迷走神經(jīng)具有改善認(rèn)知和運動功能的作用，其機制與抗水腫、保護血腦屏障和神經(jīng)元等途徑有關(guān)〔10〕。臨床上迷走神經(jīng)電刺激多用于治療偏頭痛、阿爾茨海默病和帕金森病等，效果顯著〔11〕。近年來，有報道稱迷走神經(jīng)電刺激可縮短腦外傷后癲癇患者白天快速動眼睡眠周期和嗜睡時間，并延長覺醒時間〔12〕。

本研究通過動物實驗分析迷走神經(jīng)電刺激對腦外傷昏迷大鼠的促覺醒作用和機制，具有較高的臨床意義。本研究干預(yù)后12 h，刺激組覺醒比例高于假刺激組，與杜青等〔13〕研究的結(jié)果一致，證實迷走神經(jīng)電刺激具有促昏迷大鼠覺醒的作用。GABAbR為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的受體，廣泛分布在哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，參與了負(fù)性情緒、癲癇、睡眠等生理或病理過程；5-HT2AR是5-HTR亞型中分布最為廣泛的一類受體，特別是在前額葉皮層中大量分布，研究認(rèn)為其與覺醒的調(diào)節(jié)密切相關(guān)〔14,15〕。本研究說明迷走神經(jīng)電刺激的促覺醒作用可能通過上調(diào)5-HT2AR表達，下調(diào)GABAbR表達有關(guān)，假刺激組GABAbR和5-HT2AR的表達高于空白組可能與腦外傷后的應(yīng)激作用有關(guān)。

本次研究的主要不足有以下3點：(1)實驗樣本量過小，且僅對前額葉皮質(zhì)中GABAbR和5-HT2AR的表達進行了檢測，其他促覺醒腦區(qū)是否有所改變尚需進一步探究；(2)測定物質(zhì)表達的時間點較少，因此干預(yù)后不同時間GABAbR和5-HT2AR變化的結(jié)果存在一定局限性，接下來的實驗匯總應(yīng)增加時間點使結(jié)果更客觀、可靠；(3)迷走神經(jīng)電刺激在臨床上仍屬于有創(chuàng)操作，用于臨床存在一定局限性，如何通過無創(chuàng)方法達到類似效果有待進一步研究。