基于leptin-AMPK-ACC通路探究西格列汀對2型糖尿病大鼠糖脂代謝的改善作用

喬鵬 朱亮 張華 馬妍菁 王曉暉

(蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科，江蘇 蘇州 215004)

糖尿病是一組因胰島素絕對或者相對分泌不足、胰島素利用障礙引起的碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪代謝紊亂性疾病，主要標(biāo)志為高血糖〔1，2〕。其臨床癥狀為多飲、多尿、多食和體重下降〔3〕。病程過久會引起系統(tǒng)損害，導(dǎo)致眼、腎、神經(jīng)、血管等組織器官發(fā)生慢性進(jìn)行性病變功能減退等不良癥狀。糖尿病主要包括1型糖尿病和2型糖尿病(T2DM)〔4，5〕。據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟統(tǒng)計(jì)顯示，我國糖尿病患者居世界首位，其中T2DM患者占我國糖尿病患者95%以上，其病因多為胰島素抵抗、胰島素進(jìn)行性分泌不足或二者兼有〔6〕。因此尋找一種治療T2DM的方法具有重要意義。西格列汀作為二肽基肽酶-4抑制劑，可單獨(dú)應(yīng)用或與其他降糖藥組成復(fù)方藥物治療T2DM。西格列汀具有一定的安全性，能夠減少低血糖及體重增加的不良發(fā)生率〔7〕。本研究探究西格列汀對T2DM模型大鼠糖脂代謝的改善作用及對瘦素(leptin)-腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)-乙酰輔酶A羧化酶(ACC)通路的影響。

1 材料與方法

1.1材料 選取SD健康雄性大鼠(江蘇大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心)40只，體重180～230 g，平均(194.75±33.48)g。放在18～26℃下，濕度45%～55%的干凈籠子喂養(yǎng)，飲水和新鮮干燥的飼料均進(jìn)行消毒之后供其自由食用。高糖高脂飼料成分為：15%蔗糖，20%豬油，3%蛋黃，62%基礎(chǔ)飼料。主要試劑：兔抗小鼠空腹胰島素(FINS)、三酰甘油(TG)抗體(Selleck公司)；1∶50兔抗鼠糖化血紅蛋白(HbA1c)抗體(博士德生物工程有限公司)；大鼠抗小鼠Leptin、AMPK、ACC抗體(Hyclone公司)。

1.2方法

1.2.1T2DM模型制作 除正常對照組(10只)大鼠外，其他大鼠在自由飲水和攝食1 w后，采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)進(jìn)行造模：T2DM模型組、西格列汀組、二甲雙胍對照組均對大鼠投放高糖高脂飼料，喂養(yǎng)1個(gè)月后禁食12 h，隨后對模型大鼠空腹腔注射35 mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)溶液，大鼠靜脈抽血1 ml測定空腹血糖(FBG)，以FBG≥1.90 mmol/L來判定造模成功。最終建模成功大鼠26只，隨機(jī)分組為T2DM模型組8只，西格列汀組9只，二甲雙胍對照組9只。

1.2.2取材 西格列汀組灌胃給藥30 mg/kg，二甲雙胍對照組腹腔注射給藥100 mg/kg，T2DM模型組與正常對照組均給予30 ml/kg生理鹽水。每天清晨灌胃給藥，連續(xù)給藥1個(gè)月后處死，取腹主動脈血5 ml，離心分離血清與血漿。

1.2.3空腹FINS、TG測定 采用放射免疫法測量血清中FINS：加入適量緩沖液、乙二胺四乙酸(EDTA)溶液、標(biāo)準(zhǔn)液和標(biāo)志物抗血清，震混搖勻在4℃下放置24 h。取出后加入免疫分離劑，在4℃下放置15 min，離心后棄上清液，測沉淀物放射性計(jì)數(shù)。采用酶比色法測定TG。

1.2.4FBG、HbAlc測定 使用HbA1c分析儀測定HbAlc時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格遵守儀器操作制度。采用酶法測定FBG：取1份洗滌過后的紅細(xì)胞，加入1%酶液，放置37℃水浴溫育15 min，用生理鹽水洗滌處理過的細(xì)胞3次，配成2%～5%的紅細(xì)胞懸液1滴加入血清放置37℃溫育10 min，離心后觀察凝集反應(yīng)。

1.2.5總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測定 使用酶比色法檢測：稱取5 g TC、LDL-C、HDL-C、內(nèi)脂素(Visfatin)、抵抗素(Resistin)、脂聯(lián)素(APN)置于50 ml容量瓶中，加入1 ml甲苯處理，加入5 ml 10%的尿素液與10 ml的檸檬酸鹽緩沖液，隨后放在37℃環(huán)境下培養(yǎng)1 d，用高溫蒸餾水進(jìn)行稀釋，將懸液過濾。取1 ml過濾液使用蒸餾水稀釋后加入5 ml苯酚鈉溶液，隨即再加入3 ml次氯酸鈉溶液搖勻。30 min后檢測TC、LDL-C、HDL-C、Visfatin、Resistin、APN值。

1.2.6Leptin、AMPKα、ACC測定 使用磷酸鹽緩沖液(PBS)對標(biāo)本沖洗后裂解30 min，測定蛋白濃度。取20 μg/孔蛋白質(zhì)，添加蛋白緩沖液后進(jìn)行電泳，10 min后將電轉(zhuǎn)膜置于10%的牛奶中浸泡，常溫環(huán)境下封閉90 min。之后結(jié)合一抗、稀釋，孵育1 d，取出后使用TBST緩沖液沖洗，結(jié)合二抗，60 min后清洗、顯色，對蛋白Leptin、AMPKα、ACC表達(dá)進(jìn)行檢測。

1.2.7使用蘇木素-伊紅(HE)染色對大鼠肝臟組織檢測 對各組大鼠進(jìn)行全麻處死，取肝臟組織，液氮冷凍后常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，間距5 mm做連續(xù)切片。將切片烤干后進(jìn)行脫蠟處理，之后順序置入不同濃度的酒精中各復(fù)水3 min。使用蘇木精染色15 min后清洗3次，使用鹽酸酒精分化處理30 s，充分清洗后使用1%伊紅染色，使用酒精脫水處理后進(jìn)行脫蠟處理，封片后使用顯微鏡觀察。

1.2.8使用反轉(zhuǎn)錄(RT)-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測各組大鼠肝臟、腎臟組織內(nèi)leptin mRNA、AMPKα mRNA、ACC mRNA的表達(dá) 提取液氮冷凍的大鼠肝臟、腎臟組織，隨后加入1 ml Trizol研磨成粉末狀，按照制備試劑盒說明書提取大鼠肝臟、腎臟組織中的總RNA，對RNA的純度和含量檢測，然后使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄處理后獲得cDNA，使用Primer5.0軟件對引物序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，最后使用RT-PCR方法檢測大鼠肝臟、腎臟組織中l(wèi)eptin mRNA、AMPKα mRNA、ACC mRNA的表達(dá)量，采用2-△△Ct方法計(jì)算出需要檢測的leptin mRNA、AMPKα mRNA、ACC mRNA表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組肝臟組織HE染色 正常對照組肝臟小葉結(jié)構(gòu)清晰，呈索狀排列，未見腫脹。T2DM模型組肝臟細(xì)胞排列順序紊亂，出現(xiàn)大量脂肪樣和空泡。二甲雙胍對照組肝臟細(xì)胞排列規(guī)則，脂肪樣大量減少，空泡排列疏松，密度小。西格列汀組與二甲雙胍對照組比較，肝組織結(jié)構(gòu)并無太大差異。見圖1。

圖1 各組肝臟組織(HE，×200)

2.2各組Visfatin、Resistin、APN水平比較 T2DM模型組Resistin和APN水平均顯著低于其他3組，Visfatin水平顯著高于其他3組(P<0.05)；西格列汀組APN、Resistin水平顯著高于T2DM模型組和正常對照組且Resistin水平顯著低于二甲雙胍對照組，APN水平顯著高于二甲雙胍對照組，Visfatin水平顯著低于T2DM模型組和二甲雙胍對照組且顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組Visfatin、Resistin、APN水平比較

2.3各組FBG、HbA1c、FINS比較 T2DM模型組FBG、HbA1c顯著高于其他3組，F(xiàn)INS低于其他3組(P<0.05)；西格列汀組FBG、HbA1c顯著高于正常對照組，F(xiàn)INS顯著低于正常對照組且顯著高于T2DM模型和二甲雙胍對照組(P<0.05)。二甲雙胍對照組FBG顯著高于正常對照組，顯著低于T2DM模型組、西格列汀組，HbA1c顯著高于正常對照組，顯著低于T2DM模型組和西格列汀組，F(xiàn)INS顯著高于T2DM模型組，顯著低于正常對照組、西格列汀組(P<0.05)。見表1。

2.4各組TC、TG、LDL-C、HDL-C比較 T2DM模型組TC、TG、LDL-C顯著高于其他3組，HDL-C顯著低于其他3組(P<0.05)；西格列汀組TC、TG、LDL-C均顯著高于正常對照組(P<0.05)。二甲雙胍對照組HDL-C顯著低于西格列汀組，TC、TG、LDL-C顯著高于西格列汀組(P<0.05)。見表2。

表2 各組TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比較

2.5各組leptin、AMPKα、ACC及mRNA水平比較 T2DM模型組leptin水平顯著高于其他3組，AMPKα水平顯著低于其他3組，ACC水平顯著高于正常對照組且低于西格列汀組、二甲雙胍對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；西格列汀組leptin、ACC顯著高于正常對照組，AMPK顯著低于正常對照組(P<0.05)。

T2DM模型組leptin mRNA、ACC mRNA表達(dá)顯著高于其他3組，AMPKα mRNA表達(dá)顯著低于其他3組(P<0.05)。二甲雙胍對照組leptin mRNA、ACC mRNA表達(dá)顯著低于T2DM模型組、西格列汀組且顯著高于正常對照組，AMPKα mRNA表達(dá)顯著高于其他3組(P<0.05)。見圖2和表3。

圖2 各組leptin、AMPK、ACC水平比較

表3 各組leptin、AMPKα、ACC及mRNA水平比較

3 討 論

T2DM也稱成人發(fā)病型糖尿病，多發(fā)生于30歲以后〔8〕。其發(fā)病機(jī)制多為患者體內(nèi)產(chǎn)生的胰島素過多或減少導(dǎo)致胰島素的作用效果變差從而進(jìn)一步加重病情〔9〕。研究表明，高熱量飲食、活動量不足、肥胖和增齡是T2DM患者產(chǎn)生的最常見環(huán)境因素，高血壓、高脂血癥等因素也會增加患病風(fēng)險(xiǎn)〔10，11〕。與白種人和亞洲黃種人比較，T2DM更易在土著美洲人、非洲人及西班牙人群中發(fā)生〔12〕。因此，尋找一種安全、有效治療T2DM的方法有重要意義。

胰島素是一種蛋白質(zhì)激素，主要由胰臟內(nèi)的胰島β細(xì)胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)刺激分泌而來。是機(jī)體內(nèi)唯一能降低血糖的激素，同時(shí)還可促進(jìn)糖原、脂肪等物質(zhì)的合成。進(jìn)行糖尿病治療時(shí)主要用外源性胰島素〔13〕。FBG是指在隔夜空腹(飲水除外的8～10 h內(nèi)未進(jìn)任何食物)后，早餐前采取血液檢測出來的血糖值，多用于檢測糖尿病，反映胰島β細(xì)胞功能〔14〕。HbA1c為紅細(xì)胞中的血紅蛋白與血清中的糖類相結(jié)合的產(chǎn)物，是通過緩慢、持續(xù)及不可逆的糖化反應(yīng)形成，血糖的濃度、血糖與血紅蛋白接觸時(shí)間決定了HbA1c在機(jī)體內(nèi)的含量。因此被用作糖尿病控制的監(jiān)測指標(biāo)〔15〕。TG為脂肪的組成成分，是由甘油和3個(gè)脂肪酸所形成的酯，一般情況下血漿中的TG保持著動態(tài)平衡〔16〕。TC為血液中所有脂蛋白所含的膽固醇之和，其合成和儲存的主要器官為肝臟。其血清濃度可以作為脂代謝的指標(biāo)〔17〕。LDL-C是以脂蛋白的形式存在于血液中，血漿中LDL是運(yùn)輸內(nèi)源性膽固醇的主要載體〔18〕。本研究說明西格列汀可調(diào)節(jié)T2DM模型大鼠體內(nèi)的FBG、HbA1c、TG、TC、FINS、LDL-C、HDL-C，可有效治療T2DM。

脂肪組織主要是由大量聚集成團(tuán)的脂肪細(xì)胞組成，APN便是其中之一。Resistin是含有108個(gè)氨基酸的前肽，它與人體的脂肪生成分化有密切關(guān)系。visfatin為內(nèi)臟脂肪素，主要是由內(nèi)臟脂肪組織分泌表達(dá)并具有多種的生物學(xué)活性。本研究表明使用西格列汀可通過調(diào)節(jié)大鼠體內(nèi)的APN、Resistin、visfatin水平來治療T2DM模型大鼠，效果顯著。