右美托咪定通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平抑制nNOS、PKCγ和PAR-2的表達(dá)發(fā)揮脊髓鎮(zhèn)痛作用

李鳳丹 張華 王福朝 鄭英霞

(衡水市人民醫(yī)院麻醉科，河北 衡水 053000)

內(nèi)臟痛具有患病率高、病情復(fù)雜、缺乏標(biāo)志物等特點(diǎn)，因此尚缺少治療內(nèi)臟痛的特異性藥物〔1〕。脊髓鎮(zhèn)痛較大腦鎮(zhèn)痛更具針對(duì)性和選擇性。文獻(xiàn)顯示，脊髓鎮(zhèn)痛已在剖宮產(chǎn)術(shù)后、脊柱手術(shù)后、胃癌等〔2～4〕多種手術(shù)和疾病的治療中得到應(yīng)用，并取得較好的療效，但對(duì)內(nèi)臟痛的鎮(zhèn)痛作用尚缺少文獻(xiàn)報(bào)道。因此，積極探索可通過脊髓鎮(zhèn)痛發(fā)揮內(nèi)臟痛鎮(zhèn)痛的新藥及其作用機(jī)制，對(duì)內(nèi)臟痛的治療具有重要臨床價(jià)值。右美托咪定(DEX)是一種新型高選擇性α2 腎上腺素能受體(α2-AR)激動(dòng)劑，其可通過激活突觸前、后膜α2-AR，抑制腎上腺素(EP)的釋放，阻礙疼痛信號(hào)傳導(dǎo)至中樞，同時(shí)還可增加脊髓中一氧化氮(NO)和乙酰膽堿(Ach)的合成與釋放，發(fā)揮脊髓水平的抗傷害效應(yīng)〔5〕。但是，DEX脊髓鎮(zhèn)痛具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和分子傳遞過程目前尚不清楚，且其在內(nèi)臟痛鎮(zhèn)痛中是否也可發(fā)揮作用仍缺少報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶(PK)C-NO通路在各種疼痛的產(chǎn)生和維持過程中發(fā)揮著重要作用，為疼痛的治療提供了新的思路〔6〕。本研究擬在確定DEX治療內(nèi)臟痛大鼠具有確切療效的基礎(chǔ)上，考察其對(duì)大鼠脊髓中神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響；同時(shí)對(duì)PKCγ、一氧化氮合酶(NOS)和蛋白酶激活受體(PAR)-2等PKC-NO痛覺通路相關(guān)信號(hào)分子水平進(jìn)行檢測(cè)，以期獲得DEX脊髓鎮(zhèn)痛的部分可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取60只健康SD大鼠，雄性，6～8周齡，體重200～250 g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(冀)2018-0014，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(冀)2018-0027，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，期間給予自由飲水和飲食，光照白晝各12 h。

1.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑 鹽酸DEX(規(guī)格：2 ml∶200 μg，批準(zhǔn)文號(hào)：H20090248，產(chǎn)品批號(hào)：20180511，生產(chǎn)廠家：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)；Ach、去甲腎上腺素(NA)和胍丁胺(AGM)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(規(guī)格均為96T，產(chǎn)品批號(hào)分別為：E-EL-R0355c、E-EL-0047c、E-EL-R0013c，生產(chǎn)廠家均為武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)；抗PKCγ、抗nNOS、抗PAR-2抗體(規(guī)格均為100 μl，產(chǎn)品批號(hào)分別為：59090S、4231S、6976S，生產(chǎn)廠家均為美國Cell Signaling Technology公司)；免疫組化試劑盒(規(guī)格為500片，產(chǎn)品批號(hào)：BF06099，購自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司)。

1.1.3主要儀器和設(shè)備 ECG-1106L VET型數(shù)字式動(dòng)物心電圖機(jī)購自深圳市凱沃爾電子有限公司；SSW-3型顯微外科手術(shù)器械包購自上海醫(yī)療器械(集團(tuán))有限公司手術(shù)器械廠；纖維素濾膜(0.22 μm)、混合纖維素濾膜(0.45 μm)購自德國BM公司；-80℃超低溫冰箱購自青島海爾集團(tuán)；4℃、-20℃冰箱購自合肥美菱股份有限公司；H1650-W離心機(jī)購自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；TGL-20M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)購自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；CKX41倒置顯微鏡、IX-71熒光倒置顯微鏡均購自日本Olympus光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社；Infinite M1000 Pro全波長酶標(biāo)儀購自TECAN公司；TANKPE060高純水機(jī)購自美國Millipore公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組 60只大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，稱取體重，根據(jù)體重分層隨機(jī)分成：對(duì)照組(A組，僅鞘內(nèi)注射生理鹽水10 μl，不予注射甲醛)、模型組(B組，鞘內(nèi)注射生理鹽水10 μl，予以注射甲醛)和DEX低劑量組(C組，鞘內(nèi)注射DEX 0.75 μg/kg，予以注射甲醛)、中劑量組(D組，鞘內(nèi)注射DEX 1.5 μg/kg，予以注射甲醛)和高劑量組(E組，鞘內(nèi)注射DEX 3.0 μg/kg，予以注射甲醛)〔7〕，每組12只。

1.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立 鞘內(nèi)注射藥物：采用吸入1.5%異氟烷將大鼠進(jìn)行麻醉，俯臥位固定，使用25 μl微量注射器于脊柱 L5～6間隙的位置(髖結(jié)節(jié)水平的椎體兩側(cè))垂直進(jìn)針，試探性回抽腦脊液，當(dāng)尾巴突然向側(cè)向甩動(dòng)或出現(xiàn)顫動(dòng)表示穿刺成功，此時(shí)按照分組要求緩慢注入藥物。

建立大鼠急性炎性內(nèi)臟痛模型：完成藥物注射15 min后，維持麻醉，利用37℃生理鹽水清理腸道。在直腸窺器輔助下，于乙狀結(jié)腸黏膜(距直腸緣35 mm)處注射100 μl 5%甲醛(注意切勿穿透結(jié)腸壁)。完成注射后，停止麻醉，將大鼠放回籠內(nèi)密切觀察。待大鼠蘇醒后，開始記錄大鼠舔腹部或外陰區(qū)域(L)、腹部收縮(A)、伸展身體(B)及肋腹部收縮(F)等行為學(xué)反應(yīng)，并每隔15 min記錄一次疼痛計(jì)分〔8〕，至2 h。

1.2.3取材 依照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，在大鼠復(fù)蘇2 h后，采用7%濃度水合氯醛對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，快速開胸，進(jìn)行主動(dòng)脈插管(遠(yuǎn)端插管，近端夾閉)，用37℃生理鹽水沖洗，除去血液，再用4℃ 500 ml 0.1 mol/L的磷酸緩沖液(PBS)進(jìn)行灌注，固定標(biāo)本。隨后迅速剪取大鼠脊L2～4節(jié)脊髓，置于冰面，利用顯微鏡觀察，切取約兩塊1 mm脊髓背角組織，分別利用液氮(用于ELISA檢測(cè))和4%多聚甲醛〔用于蘇木素-伊紅(HE)染色〕各保存一份備用。

1.2.4HE染色 (1)固定：將取得的大鼠肺組織標(biāo)本放置在4%濃度的甲醛溶液中充分浸泡30～50 min。 (2)脫水：分別用70%、80%、90%、95%、100%酒精進(jìn)行梯度脫水。(3)透明：用二甲苯將標(biāo)本透明2次，以替換標(biāo)本組織內(nèi)酒精，此過程需不斷觀察，直至標(biāo)本透明似琥珀。(4)浸蠟：將透明標(biāo)本組織放置在溶化好的石蠟里，置于溶蠟箱在65℃下保溫2 h。(5)包埋：觀察石蠟完全浸入到組織中以后進(jìn)行包埋，待其冷卻凝固以后便成為蠟塊。(6)編號(hào)：記錄為標(biāo)本來源大鼠編號(hào)。(7)切片：標(biāo)本組織蠟塊用切片機(jī)在其中部自動(dòng)橫行切取3張4 μm厚的薄片。(8)貼片：將切片在熱水中燙平，然后再貼在玻片上，置于烤箱58℃恒溫保持4 h。(9)染色：在脫蠟和水洗之后，采用蘇木素進(jìn)行染色，保持3 min，繼續(xù)水洗之后再藍(lán)化，保持10 min，使用1%濃度的鹽酸酒精再進(jìn)行分化，保持20 s，最后伊紅染色，保持5 min。(10)封片：使用70%、80%、90%、95%、100%酒精依次進(jìn)行脫水，各自保持3 min，使用二甲苯進(jìn)行透明，保持5 min，最后使用中性樹脂膠完成封片。

1.2.5ELISA 切割組織標(biāo)本，稱重，利用勻漿器充分勻漿，2 000～3 000 r/min離心20 min，收集上清液，備用；按照試劑盒說明書要求制備標(biāo)準(zhǔn)品，在待測(cè)樣品孔中的酶標(biāo)包被板上加40 μl樣品稀釋液，再加10 μl 5倍稀釋的待測(cè)樣品?？瞻讓?duì)照孔不加上述試劑和樣品，其余各步操作同待測(cè)樣品孔。封板膜封板37℃溫育，30 min；將濃縮液稀釋30倍后備用；揭掉封板膜，棄去孔內(nèi)的液體，甩干，在孔內(nèi)加滿洗滌液，靜置30 s，棄去液體重復(fù)5次，甩干；每孔加 50 μl 酶標(biāo)試劑(除空白對(duì)照孔外)；操作步驟同加樣；操作步驟同配液；每孔加 50 μl 顯色劑A，加50 μl顯色劑B，輕輕震蕩，混勻，37℃下避光顯色15 min；每孔加50 μl終止液，終止反應(yīng)時(shí)藍(lán)色變?yōu)辄S色；450 nm波長下依次測(cè)量各孔的OD值。

1.2.6Western印跡法 采用Western印跡法對(duì)肺組織中κB激酶抑制劑(IKK)、p65的表達(dá)進(jìn)行定量檢測(cè)。具體步驟：(1)取出大鼠的肺組織，立即在研磨器內(nèi)加細(xì)胞裂解液放置在冰上進(jìn)行研磨，持續(xù)30 min，將混合液小心吸入到離心管中。(2)將離心管置于低溫高速離心機(jī)內(nèi)，11 000 r/min，4℃離心，持續(xù)15 min，棄沉淀，取上清液。(3)將上清液收集起來，BCA法定量檢測(cè)蛋白濃度，依照3∶1的比例加入上樣緩沖液，再經(jīng)過沸水浴持續(xù)5 min，進(jìn)行滅活，在-20℃下儲(chǔ)存，以備后續(xù)使用。(4)在110 mV下，用聚丙烯酰胺凝膠電脈(PAGE)進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離，溴酚藍(lán)區(qū)帶到達(dá)分離膠以后，電壓調(diào)至200 mA，持續(xù)2 h，溴酚藍(lán)區(qū)帶進(jìn)入分離膠末端，并即將泳出分離膠底部，轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上。(5)按照20∶1的比例在吐溫磷酸鹽緩沖液(PBST)溶液中加脫脂奶粉，室溫條件下封閉1 h，依照一抗的推薦濃度和用量，加入奶粉對(duì)一抗進(jìn)行稀釋。將硝酸纖維膜置于雜交袋，加一抗工作液在袋中，然后封口，4℃條件下，孵育過夜。(6)采用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記好的二抗(抗兔IgG抗體，1∶2 000稀釋)工作液，再封口，37℃條件下，孵育1 h。(7)凝膠成像分析儀掃描并分析結(jié)果。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算濃度，結(jié)果用相對(duì)灰度值進(jìn)行表示。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1DEX對(duì)大鼠疼痛評(píng)分的影響 與A組相比，B組各時(shí)間點(diǎn)的疼痛評(píng)分均明顯升高(均P<0.05)，且B組最大值出現(xiàn)在造模15 min，隨時(shí)間推移B組疼痛評(píng)分逐漸下降；C、D、E組大鼠疼痛評(píng)分最大值均出現(xiàn)在造模30 min，且較B組分?jǐn)?shù)減少，除C組30 min外，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并呈劑量依賴性(P<0.05)。以上結(jié)果提示，鞘內(nèi)注射DEX對(duì)急性炎性內(nèi)臟痛大鼠具有一定的鎮(zhèn)痛作用，且可推遲疼痛高峰的出現(xiàn)。見表1。

2.2DEX對(duì)急性炎性內(nèi)臟痛大鼠心率的影響 各組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)心率之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。提示DEX鞘內(nèi)注射對(duì)急性炎性內(nèi)臟痛大鼠心率無明顯影響。見表1。

表1 DEX對(duì)造模不同時(shí)間大鼠疼痛評(píng)分和心率的影響

2.3DEX對(duì)大鼠脊髓中Ach、NA和AGM含量的影響 與A組相比，B、C、D、E組大鼠脊髓中Ach、NA含量均明顯升高(P<0.05)，AGM含量均明顯下降(P<0.05)；而與B組相比，C、D、E組Ach和AGM含量均明顯升高(P<0.05)，NA濃度明顯降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性。見表2。

表2 DEX對(duì)大鼠脊髓中Ach、NA、AGM、nNOS、PKCγ和PAR-2含量的影響

2.4DEX對(duì)大鼠急性炎性內(nèi)臟痛脊髓神經(jīng)毒性的影響 HE染色結(jié)果顯示，各組大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞染色后，細(xì)胞大小均勻，細(xì)胞間質(zhì)光滑、整齊，細(xì)胞核和黏液呈藍(lán)色或灰藍(lán)色，軟骨基質(zhì)呈深藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈粉色，嗜酸性顆粒、紅細(xì)胞、蛋白性液體等為紅色。見圖1。

圖1 各組大鼠脊髓神經(jīng)元HE染色(×400)

2.5免疫組化檢測(cè)大鼠脊髓組織中PKCγ和nNOS 的表達(dá) 如圖2所示，PKCγ陽性細(xì)胞多呈圓形或梭形，PKCγ主要分布于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)和胞膜上，呈棕黃色，胞內(nèi)染色較淡，胞膜染色較深。

圖2 脊髓組織中PKCγ表達(dá)免疫組化染色(×400)

如圖3所示，nNOS陽性細(xì)胞與PKCγ陽性細(xì)胞形狀相似，但胞體較小，nNOS主要分布于胞質(zhì)內(nèi)，呈棕褐色，染色較深，胞膜和胞核未著色。組間對(duì)比可見，與A組相比，B、C、D、E組PKCγ和nNOS陽性細(xì)胞明顯增多；而與B組相比，C、D、E組PKCγ和nNOS陽性細(xì)胞明顯下降，并呈劑量依賴性。

圖3 脊髓組織中nNOS表達(dá)免疫組化染色(×400)

2.6Western印跡檢測(cè)大鼠脊髓組織中nNOS、PKCγ和PAR-2蛋白表達(dá) 除E組nNOS外，B、C、D、E組大鼠肺組織中nNOS、PKCγ和PAR-2表達(dá)較A組明顯增加(P<0.05)，而C、D、E組nNOS、PKCγ和PAR-2表達(dá)量較B組明顯下降(P<0.05)，并呈劑量依賴性。由此可推斷，大鼠急性炎性內(nèi)臟痛可誘導(dǎo)PAR-2通路激活，使nNOS、PKCγ和PAR-2蛋白表達(dá)增加，DEX可抑制PAR-2通路激活。見表2、圖4。

圖4 Western印跡檢測(cè)脊髓組織nNOS、PKCγ和PAR-2蛋白表達(dá)

3 討 論

鞘內(nèi)注射可將藥物直接注入脊髓組織，使藥物富集于脊髓，同時(shí)可減少藥物劑量，因此在疼痛治療中具有一定的優(yōu)勢(shì)。在對(duì)鎮(zhèn)痛藥物的研究中，α2腎上腺素能藥物最受重視。Nagasaka等〔9〕發(fā)現(xiàn)，給大鼠鞘內(nèi)注射注入DEX，能顯著減弱疼痛刺激，提示DEX具有一定的神經(jīng)鎮(zhèn)痛作用，且與可樂定相比，DEX鎮(zhèn)痛療效更優(yōu)，不良反應(yīng)較小。也有研究證明，鞘內(nèi)注射1.5 μg/kg DEX在10 min時(shí)可發(fā)揮最大鎮(zhèn)痛效應(yīng)，并持續(xù)約6 h，其產(chǎn)生的抗傷害效應(yīng)約為其他鞘外注射用藥量的5倍，機(jī)制主要與激活通過外周和脊髓的α2-AR有關(guān)〔10〕。本研究結(jié)果顯示，鞘內(nèi)注射DEX可對(duì)急性炎性內(nèi)臟痛大鼠具有一定的鎮(zhèn)痛作用，且可推遲疼痛高峰的出現(xiàn)，同時(shí)結(jié)果還顯示鞘內(nèi)注射DEX對(duì)大鼠心率和神經(jīng)元損傷無明顯影響，但可增加Ach和AGM的表達(dá)，降低NA水平。

PKC是蛋白激酶超家族成員的一種，可發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)元興奮性調(diào)節(jié)、細(xì)胞增生及神經(jīng)遞質(zhì)釋放等多種生物學(xué)活性〔11～13〕。當(dāng)神經(jīng)發(fā)生損傷時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞會(huì)釋放大量P物質(zhì)(SP)，使胞質(zhì)內(nèi)無活性的PKC轉(zhuǎn)至細(xì)胞膜發(fā)生活化，活化的PKC又可誘導(dǎo)NOS發(fā)生磷酸化，使信號(hào)維持時(shí)間延長，導(dǎo)致中樞敏化〔14〕。PKCγ是PKC亞型的一種，其主要分布于三叉神經(jīng)、丘腦核束、皮質(zhì)脊髓束等神經(jīng)元細(xì)胞〔15〕。有研究表明，PKCγ活化是神經(jīng)疼痛和炎性疼痛產(chǎn)生的主要機(jī)制之一，當(dāng)小鼠敲除PKCγ基因后，其對(duì)刺激性傷害的疼痛反應(yīng)明顯下降〔16〕。國外研究還發(fā)現(xiàn)，利用甲醛在大鼠足底進(jìn)行注射致痛后，大鼠脊髓背角神經(jīng)元中的膜上PKCγ明顯增加〔17〕，提示PKCγ參與了機(jī)體的軀體痛覺傳入。牛敬忠等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)，利用甲醛進(jìn)行直腸內(nèi)注射致痛后，模型組大鼠神經(jīng)元PKCγ膜轉(zhuǎn)位明顯多于對(duì)照組；同時(shí)，給予PKC激動(dòng)劑(PMA)刺激后，神經(jīng)元細(xì)胞的膜轉(zhuǎn)位的程度也顯著增加，說明PKCγ還與炎性內(nèi)臟疼痛形成密切相關(guān)。

早期研究發(fā)現(xiàn)，DEX可直接抑制突觸釋放興奮性神經(jīng)遞質(zhì)〔SP、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)等〕到脊髓背角，達(dá)到抗傷害作用〔19〕。有研究表明，鞘內(nèi)注射DEX能明顯抑制骨癌大鼠的熱痛覺過敏，同時(shí)還可改善大鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙〔20〕；其機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，DEX組大鼠同側(cè)脊髓背角中PKCγ水平明顯下降，并呈劑量依賴性〔21〕。也有研究發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)注射DEX后，坐骨神經(jīng)損傷大鼠痛覺敏感明顯減輕，其機(jī)制與DEX抑制大鼠脊髓背角PKCγ轉(zhuǎn)膜有關(guān)〔22〕。國外研究也表明，鞘內(nèi)注射DEX可使脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠機(jī)械性痛敏顯著下降，這與DEX抑制脊髓中NO、nNOS等表達(dá)有關(guān)〔23〕。為進(jìn)一步探究DEX發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的機(jī)制，本研究結(jié)果顯示，DEX可明顯降低模型大鼠脊髓 nNOS、PKCγ和PAR-2表達(dá)水平。