自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠對大鼠宮腔粘連形成的預(yù)防作用及對NF-κB相關(guān)因子的影響

楊雅嵋 何浩 王文平 冉偉 曾玉華

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1婦產(chǎn)科，四川 南充 637000；2重癥醫(yī)學(xué)科)

自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠是目前臨床上常用的防止宮腔粘連(IUA)方法，相容性好、流動性強、半衰期長〔1，2〕，但具體機制尚不明確。IUA伴隨炎癥反應(yīng)；同時引起纖維細胞增生，而纖維細胞增生受纖維蛋白的調(diào)控〔3〕；已有研究表明大鼠陰道炎、宮頸炎、盆腔炎等疾病中炎癥水平升高、纖維細胞增生影響疾病進程〔4,5〕。因此降低機體炎癥水平、降低組織纖維化對緩解IUA極為重要。本研究建立IUA模型，觀察自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠對IUA大鼠的保護作用并探討對核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB相關(guān)因子的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級健康SD雌性未孕性成熟大鼠〔川北醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，許可證號：SCXK(川)2017-0025〕，體重200～220 g。所有大鼠在溫度(25±1)℃、濕度(50±10)%、光照/黑暗12 h/12 h的實驗動物中心常規(guī)飼養(yǎng)1 w進行后續(xù)實驗。實驗均經(jīng)醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準。

1.2試劑與儀器 苯酚(上海麥克林生化科技有限公司，批號：108-95-2)，自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠(安徽引導(dǎo)者醫(yī)療科技有限公司，批準文號：3641453)，蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：C0105)，Masson染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號：G1340)，大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1、IL-18酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒，一抗NF-κB抗兔、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1抗兔、結(jié)締組織生長因子(CTGF)抗兔、膠原蛋白(collagen )Ⅲ抗鼠、collagen Ⅰ抗鼠、內(nèi)參GAPDH抗鼠、二抗羊抗鼠、羊抗兔(英國abcam，批號分別為：ab208348、ab100704、ab216165、ab238420、ab179695、ab125943、ab6310、ab6308、ab8245、ab150117、ab150077)，RNA提取試劑盒(美國Invitrogen，批號：12183020)，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Fermentas，批號：K1622)，2×Hi SYBR Green QPCR Mix(北京百奧萊博科技有限公司，編號：PC3301)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑(上海生工生物工程有限公司，批號：PW017)。實時熒光定量 PCR(qRT-PCR)儀(美國ABI，型號： StepOnePlus)，蛋白凝膠成像儀(上海天能科技有限公司，型號：4800)。

1.3方法

1.3.1動物造模 參照文獻中方法動物造模〔6〕。造模前液化苯酚5 ml、甘油4 ml、阿拉伯樹膠1 g，加蒸餾水至20 ml，配制25%苯酚膠漿待用。24只雌性性成熟未孕SD大鼠選取6只為空白組不做任何處理；其余18只麻醉后，在下腹部正中、尿道上端約1.0 cm處切開皮膚組織，暴露出子宮，隨機選取6只大鼠為假手術(shù)組，4號針頭在子宮分叉處向卵巢方向注0.04 ml生理鹽水；其余12只同樣方法注0.04 ml 25%苯酚膠漿構(gòu)建大鼠IUA模型，肉眼可見宮腔隆起即為注射成功。IUA組不做處理，IUA+自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組硬脊膜暴露區(qū)創(chuàng)傷面涂抹1%自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠0.5 ml/kg〔7〕。所有打開腹腔動物用無菌絲線逐層縫合。各組禁食但不禁水12 h后常規(guī)飼養(yǎng)，7 d后檢測各指標。

1.3.2HE、Masson染色觀察子宮組織變化 造模7 d后腹腔注射麻醉處死所有大鼠，立即打開腹腔取出子宮組織。每個樣本部分組織放-20℃做ELISA實驗、部分組織移至-80℃冰箱做qRT-PCR、蛋白免疫印跡(WB)實驗、部分放于4%多聚甲醛中固定。固定于4%多聚甲醛中的子宮組織過夜后至酒精中脫水，二甲苯中透明，置于溶化的石蠟包埋、冷凍凝固后切片。部分切片HE染色試劑盒染色，光學(xué)顯微鏡拍照觀察子宮組織形態(tài)學(xué)變化，測微標尺測量子宮內(nèi)膜厚度，每組隨機選6張切片求平均值為該組子宮內(nèi)膜厚度。切片每組選6個用Masson染色試劑盒染色，光學(xué)顯微鏡拍照觀察子宮組織變化，每個切片隨機選取3個視野，計算每個視野下子宮內(nèi)膜纖維化面積的比例，求其平均值即為該子宮組織內(nèi)膜間質(zhì)纖維化面積占子宮內(nèi)膜面積的比例。

1.3.3ELISA檢測大鼠子宮組織中TNF-α、IL-1、IL-18水平 -20℃冰箱凍存組織去除血液后組織勻漿。5 000 r/min離心5 min，收集上清后分裝待測。嚴格按照大鼠TNF-α、IL-1、IL-18 ELISA試劑盒說明書步驟操作。

1.3.4qRT-PCR檢測大鼠子宮組織中NF-κB、TGF-β1、CTGF、collagen Ⅲ、collagen Ⅰ mRNA水平 取-80℃冰箱部分凍存組織，RNA提取試劑盒提取子宮組織總RNA，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄cDNA，qRT-PCR儀對NF-κB、TGF-β1、CTGF、collagen Ⅲ、collagen Ⅰ、GAPDH擴增。引物序列見表1。上樣體系：cDNA 1 μl(50 ng/μl)，F(xiàn)/R(10 μmol/L)各0.5 μl，2×Hi SYBR Green QPCR Mix 10 μl，雙蒸水(ddH2O) 8.0 μl。反應(yīng)條件：95℃、90 s；95℃、30 s；62℃、55 s；45個循環(huán)。2-ΔΔCt法對子宮組織中NF-κB、TGF-β1、CTGF、collagen Ⅲ、collagen Ⅰ、GAPDH表達水平定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.5WB檢測大鼠子宮組織中NF-κB、TGF-β1、CTGF、collagen Ⅲ、collagen Ⅰ蛋白水平 每個樣品取30 mg凍存組織冰上研磨，每管加1 ml蛋白裂解液冰上裂解30 min，提取子宮組織總蛋白，凝膠電泳分離蛋白質(zhì)后PVDF膜280 mA轉(zhuǎn)膜1 h；5%脫脂奶粉封閉2 h；加入對應(yīng)一抗NF-κB、TGF-β1、CTGF、collagen Ⅲ、collagen Ⅰ、GAPDH，4℃孵育過夜；加入對應(yīng)二抗，室溫孵育1 h。DAB顯色試劑顯色，蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.14組HE染色檢測子宮組織變化 空白組、假手術(shù)組子宮內(nèi)膜、腎上腺和宮腔組織結(jié)構(gòu)完整，子宮內(nèi)膜壁光滑有彈性、粗細均勻，腎上腺細胞豐富。IUA組子宮內(nèi)膜粗糙且彈性差，內(nèi)膜層細胞壞死嚴重，腎上腺細胞缺失，腔上皮細胞結(jié)構(gòu)不完整，可見宮腔粘連緊密。IUA+自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組可觀察到子宮內(nèi)膜、腎上腺和宮腔組織，子宮內(nèi)膜變厚但卻粗糙，無宮腔粘連現(xiàn)象。見圖1。與空白組〔(779.59±158.63)μm〕相比，IUA組、IUA+自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組子宮內(nèi)膜厚度顯著變薄〔(405.82±112.69)μm、(582.68±132.51)μm；P<0.05〕；與假手術(shù)組〔(735.56±169.52)μm〕相比，IUA組子宮內(nèi)膜厚度顯著變薄(P<0.05)；與IUA組相比，IUA+自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組子宮內(nèi)膜厚度顯著變厚(P<0.05)。

箭頭所指為宮腔粘連處圖1 4組HE染色檢測子宮組織變化(×200)

2.24組Masson染色檢測子宮組織變化 與空白組〔(37.65±8.75)%〕相比，IUA組、IUA+自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組纖維化面積顯著擴大〔(86.73±15.56)%、(54.52±10.61)%；P<0.05〕；與假手術(shù)組〔(38.85±9.16)%〕相比，IUA組、IUA+自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組纖維化面積顯著擴大(P<0.05)；與IUA組相比，IUA+自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組纖維化面積顯著縮小(P<0.05)。見圖2。

圖2 4組Masson染色檢測子宮組織變化(×200)

2.34組子宮組織炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-18變化情況 與空白組及假手術(shù)組相比，IUA組子宮組織TNF-α、IL-1、IL-18表達量顯著升高，IUA+自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組子宮組織IL-1、IL-18表達量顯著升高(P<0.05)；與空白組和假手術(shù)組相比，IUA+自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組子宮組織IL-1、IL-18表達量顯著升高(P<0.05)；與IUA組相比，IUA+自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組子宮組織TNF-α、IL-1、IL-18表達量顯著下降(P<0.05)。見表2。

表2 4組子宮組織炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-18水平及NF-κB mRNA、蛋白表達比較

2.44組子宮組織NF-κB mRNA變化情況 與空白組及假手術(shù)組相比，IUA組、IUA+自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組子宮組織NF-κB mRNA水平顯著升高(P<0.05)；與IUA組相比，IUA+自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組子宮組織NF-κB mRNA水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.54組子宮組織NF-κB蛋白變化情況 與空白組及假手術(shù)組相比，IUA組子宮組織NF-κB蛋白水平升高(P<0.05)；與IUA組相比，IUA+自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組子宮組織NF-κB蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見表2、圖3。

1～4：空白組；假手術(shù)組；IUA組；IUA+自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組；圖4同圖3 4組子宮組織NF-κB蛋白水平比較

2.64組子宮組織TGF-β1、CTGF、collagen Ⅲ、collagen Ⅰ mRNA變化情況 與空白組及假手術(shù)組相比，IUA組子宮組織TGF-β1、CTGF、collagen Ⅲ、collagen Ⅰ mRNA表達顯著升高，IUA+自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組子宮組織TGF-β1、collagen Ⅲ、collagen Ⅰ mRNA表達顯著升高(P<0.05)；與IUA組相比，IUA+自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組子宮組織TGF-β1、CTGF、collagen Ⅲ mRNA表達顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 4組子宮組織TGF-β1、CTGF、collagen Ⅲ、collagen Ⅰ mRNA水平比較

2.74組子宮組織TGF-β1、CTGF、collagen Ⅲ、collagen Ⅰ蛋白變化情況 與空白組相比，假手術(shù)組子宮組織collagen I蛋白表達顯著升高，IUA組子宮組織TGF-β1、CTGF、collagen Ⅲ、collagen Ⅰ蛋白表達顯著升高，IUA+自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組子宮組織TGF-β1、collagen Ⅲ、collagen Ⅰ蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與假手術(shù)組相比，IUA組子宮組織TGF-β1、CTGF、collagen Ⅲ、collagen Ⅰ蛋白表達顯著升高，IUA+自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組子宮組織TGF-β1、collagen Ⅲ、collagen Ⅰ蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與IUA組相比，IUA+自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組子宮組織TGF-β1、CTGF、collagen Ⅲ蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖4、表4。

圖4 4組子宮組織TGF-β1、CTGF、collagen Ⅲ、collagen Ⅰ蛋白水平比較

表4 4組子宮組織TGF-β1、CTGF、collagen Ⅲ、collagen Ⅰ蛋白水平比較

3 討 論

IUA也稱Asherman綜合征，是子宮內(nèi)膜基底層破壞無法修復(fù)，致使肌層組織裸露而引起宮壁組織相互粘連疾病，已成為月經(jīng)稀少、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、不孕不育的重要原因〔7〕，是婦科常見宮腔疾病之一，多次人工流產(chǎn)、刮宮致IUA發(fā)生率已高達25%～30%〔8〕。宮腔鏡IUA分離術(shù)是治療IUA的標準術(shù)式，然而術(shù)后再粘連率高達62.5%，因此防止IUA分離術(shù)后再粘連是治療IUA的關(guān)鍵。研究表明，自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉相較于自然透明質(zhì)酸鈉凝膠具有半衰期長且不易降解特點，為預(yù)防IUA提供了可能〔9〕。苯酚膠漿法模擬IUA癥狀，苯酚膠漿處理大鼠后內(nèi)膜層細胞壞死嚴重、子宮內(nèi)膜粗糙且彈性差，可見宮腔粘連緊密現(xiàn)象并且組織纖維化嚴重；測量發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜厚度變薄，提示IUA造模成功。IUA涂抹自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉后子宮內(nèi)膜變厚、組織纖維化面積變小，無IUA現(xiàn)象；提示自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉可減緩IUA癥狀，可增加子宮內(nèi)膜厚度、降低組織纖維化。

炎癥因子TNF-α是炎癥反應(yīng)中出現(xiàn)最早、最重要的炎癥介質(zhì)〔10〕，IL-1是體內(nèi)最強的炎癥介質(zhì)之一〔11〕，IL-18的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與IL-1家族類似，可在多種疾病中爆發(fā)加重疾病進程〔12〕。本研究發(fā)現(xiàn)，空白組與假手術(shù)組子宮組織中TNF-α、IL-1、IL-18差異不明顯，提示手術(shù)對炎癥的影響不明顯；與假手術(shù)組相比，IUA組子宮組織中TNF-α、IL-1、IL-18表達升高，提示IUA可加強子宮組織中炎癥因子水平從而加重疾病；與IUA組相比，IUA+自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組子宮組織TNF-α、IL-1、IL-18表達量下降，提示自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉可緩解IUA引起的炎癥因子水平升高現(xiàn)象。

NF-κB是激活炎癥反應(yīng)發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，肺間質(zhì)纖維化是肺泡炎發(fā)生的中心環(huán)節(jié)〔13〕。在IUA研究中發(fā)現(xiàn)，IUA發(fā)生受多條信號通路的調(diào)控〔14〕，其中NF-κB位于中心環(huán)節(jié)，是TGF-β1上游調(diào)節(jié)基因之一，激活后可與TGF-β1 啟動子結(jié)合，誘導(dǎo)TGF-β1的表達〔15〕；而TGF-β1是多種調(diào)控的生長因子；下游CTGF主要集中在成纖維細胞和損傷組織內(nèi)，可使組織促纖維化；纖維化的主要成分為collagen Ⅲ和collagen Ⅰ〔16～18〕。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB與TGF-β1啟動子結(jié)合，可誘導(dǎo)腸道狹窄處CTGF的分泌，從而促進成纖維細胞過度增殖、加強間質(zhì)細胞收縮力、增強合成膠原蛋白〔19,20〕。本研究提示IUA中NF-κB水平升高，可能通過激活炎癥因子使子宮組織炎癥水平升高，同時可能與TGF-β1啟動子結(jié)合誘導(dǎo)子宮組織纖維化加速IUA進程。自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉可降低IUA引起的子宮組織中NF-κB升高現(xiàn)象，降低子宮組織中炎癥因子水平、TGF-β1等致纖維環(huán)基因表達，減緩子宮組織炎癥、纖維化水平達到保護IUA目的。

綜上，自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉對IUA大鼠子宮組織具有保護作用，可緩解IUA引起的子宮組織NF-κB、炎癥因子及纖維化相關(guān)蛋白升高現(xiàn)象。