左卡尼汀對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化的保護作用

馬玉杰 樸尚國 李慧瑛 姜玉姬 玄美英 鄭海蘭 金吉哲 金英順 李燦

(延邊大學附屬醫(yī)院 1腎病科，吉林 延吉 133000； 2體檢科)

根據(jù)美國腎臟數(shù)據(jù)服務年度報告，慢性腎臟病(CKD)在普通人群中的總體患病率已超過14%，并且每年呈上升趨勢〔1〕。CKD進展為終末期腎病(ESRD)需要昂貴的腎臟替代治療，因此，減緩這種臨床癥候群不僅可以提高CKD患者的生活質(zhì)量，而且可減輕社會經(jīng)濟負擔。腎小管間質(zhì)纖維化(TIF)是CKD的最終病理學特征。單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)是TIF的代表性動物模型，其表現(xiàn)為腎間質(zhì)炎癥反應、腎小管擴張和萎縮及 TIF 的形成，其分子機制極其復雜，包括炎性介質(zhì)、致纖因子、氧化應激、程序性細胞死亡等因素的參與〔2,3〕。

左卡尼汀(LC)又稱左旋肉毒堿，是一種季銨化合物，其主要功能是促進脂類代謝。作為脂肪酸β-氧化的輔助因子，既能將長鏈脂肪酸帶進線粒體基質(zhì)，促進其氧化分解，為細胞提供能量，又能將線粒體內(nèi)產(chǎn)生的短鏈脂酰基輸出。另外，LC 有助于維持線粒體內(nèi)脂肪酸β-氧化,抑制自由基的生成，并通過氧化膜脂的更新保護組織免受損傷〔4〕。因此，LC具有非脂類代謝依賴的抗氧化作用。研究表明，LC對腎缺血再灌注〔5〕、造影劑腎病〔6〕、高血壓相關性腎纖維化〔7〕、順鉑腎病〔8〕和腎病綜合征〔9〕具有保護作用。類似的保護作用亦可在糖尿病足細胞損傷〔10〕和心肌梗死〔11〕中觀察到。本實驗探討LC對UUO所致大鼠TIF的保護作用。

1 材料和方法

1.1建立動物模型與藥物治療 38只雄性SD大鼠購自延邊大學動物實驗室，體重220～240 g。經(jīng)1 w的適應期后，大鼠在相應的代謝籠中進行12 h的人工光暗循環(huán)，允許自由進食標準的飼料和飲用水。 體重匹配的大鼠隨機分為假手術組(n=6)、UUO7組(n=8)、 UUO7+LC組(n=8)、UUO14組(n=8)和UUO14+LC組(n=8)。在苯巴比妥40 mg/(kg·d)麻醉下，UUO組行側(cè)后腹切口游離左側(cè)輸尿管并結(jié)扎，假手術組僅游離輸尿管后縫合皮膚。UUO組給予腹腔注射LC 〔200 mg/(kg·d)，Sigma Aldrich C0158〕，而假手術組給予等量生理鹽水，分別于第7天、第14天處死大鼠。收集尿液和腎組織標本以備進一步檢測。該動物實驗獲得延邊大學附屬醫(yī)院動物倫理委員會批準。

1.2實驗用抗體 采用免疫組化和Western印跡的抗體如下：轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)；結(jié)締組織生長因子(CTGF)(#ab125943)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2(#ab38929)、 單核巨噬細胞抗原(ED)-1 (Serotec Inc.,UK),骨橋蛋白(OPN,#ab8448,Abcam,UK)、單核細胞趨化蛋白(MCP)-1 (Santa Cruz Biotechnoogy,Inc.)、Toll樣受體(TLR)-2 (Santa Cruz Biotechnoogy,Inc.)、超氧化物歧化酶(SOD)2(#ab13534,Abcam,Cam-bridge,MA),煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAPDH)氧化酶(NOX)-2 (#ab31092,Abcam,UK)、 線粒體外膜易位酶(TOMM)20 (#ab186734,Abcam,UK),NADH脫氫酶(輔酶Q)1a復合體亞基(NDUFA)10 (#ab96464,Abcam,UK),琥珀酸脫氫酶黃素蛋白(SDHA，#ab66484,Abcam,UK),線粒體動力樣蛋白(DLP1/Drp1，BD Transduction Laboratories,Lexington,KY),視神經(jīng)萎縮蛋白(OPA)1 (#ab90857,Abcam,UK)、β-actin (#ab8226,Abcam,UK)。

1.3尿8-羥脫氧鳥苷(8-OHdG)水平測定 根據(jù)試劑盒操作步驟用酶聯(lián)競爭免疫吸附法測定尿 8-OHdG DNA加合物水平(Cell Biolabs，San Diego，CA，USA)。

1.4腎臟病理 獲取的腎組織由過碘酸-賴氨酸-多聚甲醛液(PLP)固定，石蠟包埋后切片，行trichrome和HE染色，采用彩色圖像自動分析儀(Polygon program，TDI Scope Eye Version 3.5 for Windows；Olympus，Japan)高倍鏡視野下分析TIF程度。每個標本至少觀察20個非重疊區(qū)域取平均數(shù)。

1.5免疫組織化學染色 免疫組化步驟簡述如下：石蠟包埋切片置二甲苯脫蠟，梯度酒精中脫水，37℃ 下 0.3% 過氧化氫/甲醛 30 min處理后，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗3次。置微波爐中加熱行微波爐抗原修復(98℃ 5 min)。室溫下非免疫性血清封閉液20 min。在4℃下滴加抗ED-1 單克隆抗體和抗OPN孵育12～16 h。PBS洗3次后滴加Ⅱ抗,溫孵育2 h。以二氨基聯(lián)苯胺(DAB)為底物顯色，呈棕黃色為止。自來水流水洗滌，復染蘇木素，常規(guī)樹脂封片。染色程度用數(shù)字化顯微鏡分析儀(TDI Scope EyeTMVersion 3.0 for Windows，Olympus，日本)，Polygon 程序算出每0.5 mm2染色面積的百分比。

1.6電鏡觀察 腎皮質(zhì)組織在二甲胂酸鈉溶液配制的戊二醛固定48 h，磷酸緩沖液沖洗3次，1%鋨酸固定2 h，雙蒸水沖洗，常規(guī)脫水、環(huán)氧樹脂定向包埋，LKB-V型超薄切片機先行半薄切片，甲苯胺藍染色，光鏡定位后行超薄切片，厚50～70 nm，醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙染色，1200EX(JEOL)型透射電鏡觀察。

1.7Western印跡 腎組織用蛋白裂解液制成勻漿，室溫下離心后取上清液測定蛋白濃度，20 μg標本在十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉(zhuǎn)膜2 h后，4℃下置Ⅰ抗于非脂牛乳中以1∶1 000濃度孵育12～16 h，緩沖液洗3次后加辣根過氧化物酶標記的驢抗兔IgG(Amersham)1 h緩沖液洗3次，增強發(fā)光(ECLTM，Amersham)和曝光。以對照組為標準(100%)測定條帶的光密度，以β-actin為內(nèi)參。

1.8統(tǒng)計學處理 采用 SPSS21.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Bonferroni post hoc校正。

2 結(jié) 果

2.1LC對UUO所致TIF的作用 肉眼可見UUO導致腎臟體積增大、腎盂擴張積水、皮質(zhì)變薄，這種改變在UUO第14 天尤為明顯。Trichrome染色、HE染色提示主要病變位于腎小管間質(zhì)，表現(xiàn)為小管基底膜增厚、腎小管壞死、空泡形成、炎性細胞浸潤、腎小管萎縮、間質(zhì)纖維化(圖1)；電鏡檢查清楚可見萎縮的、空泡變性的小管和束狀膠原纖維在腎間質(zhì)沉積(圖2)。定量計分系統(tǒng)分析表明LC明顯減少TIF程度呈時間依賴性。Western印跡結(jié)果顯示LC抑制UUO所致的TGF-β1、CTGF、MMP-2的高表達。見表1。

A：UUO肉眼觀察;B：Trichrome 染色(×200)；C：HE染色(×200)圖1 各組腎臟肉眼觀察和病理組織變化

圖2 電鏡觀察各組腎小管損傷特征及Western印跡法分析致纖因子蛋白的表達

表1 各組TIF半定量分析及TGF-β1、CTGF、MMP2 Western印跡表達量

2.2LC對UUO所致炎性反應的作用 免疫組化結(jié)果表明UUO導致大量的ED-1陽性細胞在腎小管間質(zhì)浸潤和炎性介質(zhì)OPN高表達(表2和圖3)。LC治療分別在UUO第7、14天顯著減少ED-1陽性細胞數(shù)和OPN的免疫活性。另外，Western印跡結(jié)果顯示LC明顯下調(diào)MCP-1、TLR-2的表達且呈時間依賴性 (表2和圖4)。以上結(jié)果表明LC治療對UUO所致的腎損傷具有抗炎作用。

表2 各組免疫組化陽性細胞半定量分析及MCP-1、TLR-2 Western印跡表達量

圖3 各組ED-1和OPN免疫組化(×200)

圖4 電鏡觀察UUO7組及UUO7+LC組中炎性細胞浸潤

2.3LC對UUO所致氧化應激的作用 8-OHdG在大鼠尿中的含量隨UUO時間遞增，LC治療明顯減少尿8-OHdG的含量。 Western印跡結(jié)果表明LC通過增加 SOD2的表達和減少NOX-2的表達，保持氧化酶和抗氧化酶的平衡(圖5，表3)。

1～5：假手術組,UUO7組,UUO7+LC組,UUO14組,UUO14+LC組，圖7同圖5 各組氧化應激相關指標變化

表3 各組24 h尿中8-OHdG排泄量及SOD2、NOX-2 Western印跡表達量

2.4LC對UUO所致染色體失功的作用 透射電鏡表明，UUO所致線粒體結(jié)構(gòu)損傷表現(xiàn)為線粒體嵴腫脹、碎片(分裂)、 融合，造成線粒體體積變少和數(shù)量減少(圖6)。通過定量分析系統(tǒng)，LC保持了線粒體結(jié)構(gòu)的數(shù)量和大小的完整性。Western印跡分析表明，與假手術組相比，UUO組 TOMM20、 NDUFA10、SDHA、OPA1的表達明顯受到抑制，反之，Drp1表達增加，LC治療逆轉(zhuǎn)了上述指標(圖7，表4)。

A：正常線粒體(×20 000)；B：UUO組腎組織線粒體數(shù)量減少(×20 000)；C： UUO組線粒體空泡變性(箭頭，×20 000)；D：UUO組自噬體形成(箭頭，×20 000)；E：UUO組線粒體分為兩個子細胞器(分裂，箭頭，×30 000)；F：UUO組線粒體融合(圓形，×40 000)圖6 電鏡觀察各組腎組織線粒體形態(tài)典型特征

OPA1 L：長鏈OPA1；OPA1 S：短鏈OPA1圖7 Western印跡分析線粒體功能相關蛋白的表達

表4 各組線粒體大小和數(shù)量半定量分析及線粒體功能相關因子Western印跡表達量

3 討 論

大量研究表明，炎癥在腎損傷中起著關鍵作用，因為它先于腎纖維化形成。炎癥反應是對損傷性刺激的一種保護性本能反應。然而持續(xù)的炎癥可刺激腎小管上皮細胞、肌成纖維細胞、巨噬細胞等分泌炎性介質(zhì)和致纖因子，導致細胞外基質(zhì)蛋白在腎小管間質(zhì)沉積，形成不可逆的腎纖維化。其中，巨噬細胞是纖維化相關趨化因子和細胞因子如MCP-1、趨化因子受體、黏附分子和TGF-β1的主要來源〔12〕。而趨化因子和 TGF-β1反過來招募炎癥細胞聚集，形成惡性循環(huán)。本研究發(fā)現(xiàn)LC減少了腎小管間質(zhì)ED-1陽性細胞數(shù)，同時抑制了炎癥介質(zhì)OPN、MCP-1和TLR-2及TGF-β1和CTGF的高表達，降低了UUO所致MMP-2蛋白表達，從而改善了TIF程度。因此，LC在UUO大鼠模型中具有抗炎和抗纖維化作用。

LC對UUO大鼠模型發(fā)揮抗炎和抗纖維化作用的過程可能有多因素參與共同完成，其中氧化應激是決定性因素。UUO引起的缺血缺氧而引發(fā)氧化應激損傷，最終導致腎臟炎癥和纖維化形成。Kim等〔13〕報道甲硫氨酸硫氧化物還原酶A缺乏可通過增加膠原沉積而加重UUO誘導的腎纖維化進展，而這種腎纖維化在可溶性環(huán)氧化物水解酶基因敲除小鼠中或通過使用抗氧化劑維生素E可以得到緩解，進一步確認了氧化應激在UUO所致腎纖維化中的作用。LC直接抑制還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶誘導的大鼠腎上皮細胞(NRK-52E)和HK-2細胞內(nèi)活性氧的生成。Xiang等〔14〕報道LC降低腎內(nèi)8-OHdG的表達，從而防治環(huán)孢素A誘導的腎損傷。 本實驗觀察到LC不僅增加了UUO組抗氧化酶蛋白的表達，而且減少了氧化酶蛋白的表達及尿8-OHdG水平，促使抗氧化酶蛋白和氧化酶蛋白平衡，以達到氧化應激最小化。這與之前在肝臟、心臟、大腦和糖尿病中的報道〔15～18〕一致，表明LC具有強大的抗氧化能力。

LC還可以通過保護線粒體網(wǎng)絡的完整性來減輕腎臟炎癥和纖維化。線粒體是一種存在于大多數(shù)細胞中的由兩層膜包被的細胞器，是細胞制造能量的主要結(jié)構(gòu)，更是細胞進行有氧呼吸的主要場所，在維持細胞能量穩(wěn)態(tài)中起關鍵作用，同時也是活性氧的主要來源。在病理條件下，線粒體功能障礙可導致炎癥、氧化應激損傷和隨之而來的細胞程序性死亡。因此，氧化應激和線粒體異常是相互作用相互關聯(lián)的。研究表明〔17〕，LC可改善老年大鼠腦線粒體生物合成和線粒體動力學，并保護高熱量飲食加鏈脲佐菌素誘導的2型糖尿病小鼠線粒體功能。本研究結(jié)果表明，UUO 7 d破壞了線粒體的正常結(jié)構(gòu)，造成線粒體功能紊亂，尤其是在UUO 14 d。LC治療明顯維護了線粒體體積、保存了線粒體的絕對數(shù)量。Western印跡結(jié)果提示，LC調(diào)節(jié)了線粒體相關基因蛋白的表達。綜上，LC發(fā)揮抗炎、抗纖維化作用與減少氧化應激、保護線粒體網(wǎng)絡完整性密切相關。

在臨床實踐中，使用LC通常用于治療由遺傳疾病、慢性血液透析或慢性心力衰竭引起的肉堿缺乏癥。 由于LC具有抗氧化活性，它可能廣泛地應用于多種疾病。如使用LC可以改善血液透析患者的心血管損傷及心絞痛、左心室擴大或擴張和心律失常的心肌梗死。此外，對脂肪肝和非酒精性肝病也有良好的改善作用。LC對UUO所致腎間質(zhì)纖維化具有抗炎、抗纖維化作用，抑制氧化應激和保護線粒體是其發(fā)揮腎臟保護作用的分子機制。