HSF1及Akt在三陰性乳腺癌的表達及意義

唐瑋 王翠芳 金丹 王士娜

(沈陽醫(yī)學(xué)院 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院研究生院，遼寧 沈陽 110034；2附屬中心醫(yī)院病理科)

乳腺癌是最常見的危害女性健康的惡性腫瘤之一，死亡率近年來呈上升趨勢〔1〕。三陰性乳腺癌(TNBC)是一種特殊的乳腺癌分型，其雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人類表皮生長因子受體(HER)2均表現(xiàn)為陰性，因其惡性程度高、易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)等特點，長期以來缺乏特異有效的治療方法，為尋求一種有效的治療方法成為近年來的研究熱點〔2～4〕。熱休克轉(zhuǎn)錄因子(HSF)1與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及病情發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。蛋白激酶B(Akt)在細胞存活和凋亡中至關(guān)重要，對細胞代謝、細胞增殖、細胞周期等多種生物學(xué)行為進行調(diào)控。目前有很多關(guān)于HSF1與其他癌癥關(guān)系的研究〔5，6〕報道，例如肝癌、肺癌、子宮內(nèi)膜癌等，但HSF1及Akt與三陰性乳腺癌的關(guān)系的研究尚少，本研究旨在探討HSF1及Akt在三陰性乳腺癌組織中的表達及其與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 選取沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院病理科2010年1月至2018年12月經(jīng)手術(shù)切除證實為TNBC的蠟塊標(biāo)本64例為研究對象，同時取來自相同患者的癌旁組織標(biāo)本作為對照組，所有病例經(jīng)兩位病理科醫(yī)師同時確診?；颊吣挲g27～79歲，中位年齡56歲；所有病例術(shù)前未接受放化療。

1.2主要試劑 一抗〔HSF1 Rabbit Ab和Akt(pan)(C67E7) Rabbit mAb〕購自Cell Signaling TECHNOLOGY、二抗(酶標(biāo)羊抗小鼠兔IgG聚合物)購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司、粉劑型磷酸鹽緩沖液(PBS)、內(nèi)源性過氧化物酶購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色液(聚合物法)購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司、抗原修復(fù)液(pH9.0)購自上?；蚩萍加邢薰?。

2017年1月，國家能源局印發(fā)的《能源技術(shù)創(chuàng)新十三五規(guī)劃》中指出：“十三五期間重點研究 8 MW～10 MW等級及以上的超大型海上風(fēng)電機組關(guān)鍵技術(shù)。降低海上風(fēng)電場的度電成本，實現(xiàn)5 MW～6 MW等級大型海上風(fēng)電機組安裝規(guī)范化和機組運維智能化”。作為國家戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)的重要內(nèi)容，海上風(fēng)電已成為風(fēng)電產(chǎn)業(yè)發(fā)展的技術(shù)制高點，并逐漸成為世界風(fēng)電產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要方向。

1.3EnVision兩步法進行免疫組織化學(xué)染色 手術(shù)腫物切除后使用10%甲醛固定，取材，石蠟包埋，4 μm切片，切好的片80℃烤箱烘烤1 h，石蠟脫水，乙二胺四乙酸(EDTA)(1∶50)高溫高壓修復(fù)，自然冷卻40 min，切片放在濕盒上，用濾紙擦干水漬，油筆圈出待測組織區(qū)域，之后PBS洗3次、每次3 min，使用內(nèi)源性過氧化物酶3% H2O2阻斷劑、室溫孵育10 min，PBS洗3次、每次3 min，每張切片滴加50 μl 1∶200濃度的一抗HSF1或Akt、4℃孵育過夜。第二天，室溫放置30 min后，PBS洗3次、每次3 min，每張切片滴加50 μl二抗、室溫孵育15 min，PBS洗3次、每次3 min，每張切片滴加足夠量新鮮配置的DAB顯色液、顯色3～6 min，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染10 s，自來水沖洗返藍，無水酒精脫水10 min，中性樹膠封片。PBS代替一抗作為陰性對照，已知陽性標(biāo)本切片作為陽性對照。光鏡下觀察。

2.3 通過探究與拓展，激發(fā)“深度學(xué)習(xí)” 在小組合作中的探究學(xué)習(xí)能夠讓學(xué)生敞開心扉，像專業(yè)人員一樣主動發(fā)現(xiàn)問題并積極地解決問題，在課堂教學(xué)中讓學(xué)生沿著科學(xué)家探索的足跡，回到那個年代，模擬科學(xué)家的思維進行過程探究，不知不覺中學(xué)生走向了“深度學(xué)習(xí)”。

2.2HSF1及Akt在TNBC組織中的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 HSF1陽性表達與腫瘤直徑及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，且腫瘤直徑越大，陽性率越高，而與年齡及組織學(xué)分級無關(guān)；Akt陽性表達與腫瘤直徑及組織學(xué)分級相關(guān)(P<0.05)，且腫瘤直徑越大，陽性率越高；組織學(xué)分級越高，陽性率越高，而與年齡及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。見表1。

2.1HSF1及Akt在TNBC組織中的表達 HSF1陽性表達部位主要定位在細胞核，Akt陽性表達部位主要定位在細胞質(zhì)，見圖1。HSF1在TNBC組織中陽性表達率〔71.88%(46/64)〕明顯高于癌旁對照組〔10.94%(7/64);χ2=48.978，P=0.000〕；Akt在TNBC組織中陽性表達率〔73.44%(47/64)〕明顯高于癌旁對照組〔9.38%(6/64);χ2=51.822，P=0.000〕。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件行χ2檢驗及Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

基于互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)的大學(xué)生“中國夢”教育的關(guān)鍵因素研究及教育路徑研究..................................................................................................................................王浩業(yè) 顏吾佴（58）

圖1 HSF1及Akt在TNBC組織中的表達情況(DAB，×10)

1.4結(jié)果判讀 HSF1的陽性表達為細胞核呈棕黃色顆粒，Akt的陽性表達為細胞質(zhì)呈棕黃色。結(jié)果判讀采用雙盲法，由兩位資深病理醫(yī)生進行讀片評分。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)分兩方面：根據(jù)染色強度分為4級：不顯色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，深褐色為3分；根據(jù)染色面積分為5級：面積≤ 5% 為0分，面積6%～25% 為1分，面積26% ～ 50% 為2分，面積51% ～ 75% 為3分，面積>75% 為4分。最后將染色強度及染色面積所得分數(shù)相乘，0分為陰性(-)，1 ～ 4分為弱陽性(+)，5～9分為中陽性()，>9分為強陽性()〔7〕。

表1 HSF1及Akt表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系(n)

2.3HSF1及Akt相關(guān)性分析 HSF1及Akt共同陽性表達43例，共同陰性表達14例，HSF1陽性表達而Akt陰性表達3例，HSF1陰性表達而Akt陽性表達4例。HSF1與Akt表達呈正相關(guān)(r=0.725，P=0.000)。

3 討 論

TNBC是一種異質(zhì)性腫瘤，異質(zhì)性是惡性腫瘤的特征之一，腫瘤的生長速度、侵襲能力、對藥物的敏感性及預(yù)后等各方面存在差異，同一腫瘤中可以存在不同的基因型或亞型的細胞，同一腫瘤在不同的個體身上可以表現(xiàn)出不一樣的治療效果及預(yù)后，甚至同一個體身上的腫瘤細胞也存在不同的特性和差異〔8，9〕。十年以來已有相關(guān)報道HSF1在癌癥中可能發(fā)揮作用，近年來多項研究表明HSF1與卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌及乳腺癌等癌癥相關(guān)〔5，10，11〕，激活HSF1的幾個關(guān)鍵途徑與惡性腫瘤有關(guān)，HSF1對癌癥蛋白質(zhì)組有系統(tǒng)性的影響〔12〕。張喆等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)HSF1在卵巢高級別漿液性癌中促進侵襲轉(zhuǎn)移。董麗濤〔11〕研究發(fā)現(xiàn)HSF1在子宮內(nèi)膜癌中異常表達，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。這與本研究的結(jié)果較為一致，說明在TNBC中具有重要的研究價值。Akt在細胞存活和凋亡中至關(guān)重要，對細胞代謝、細胞增殖、細胞周期等多種生物學(xué)行為進行調(diào)控；磷脂酰肌醇激酶(PI3K)/Akt信號傳導(dǎo)途徑已經(jīng)成為抗癌治療中較重要的靶標(biāo)，有研究表明PI3K/Akt與前列腺癌及乳腺癌等癌癥相關(guān)〔4，13〕，PI3K/Akt途徑通過其配體刺激受體酪氨酸激酶和其細胞質(zhì)尾部的磷酸化而被激活。Henderson等〔13〕的研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt在前列腺癌中促進細胞遷移，這與本研究的結(jié)果存在一定的相關(guān)性。有相關(guān)報道在乳腺癌中HSF1-Akt與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)〔4〕。Denkert等〔4〕的研究發(fā)現(xiàn)HSF1-Akt聯(lián)合促進乳腺癌細胞EMT。Carpenter等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)HSF1-Akt聯(lián)合促進乳腺癌的發(fā)展與轉(zhuǎn)移，這與本研究的結(jié)果具有一致性。

本研究提示HSF1可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，HSF1的表達是構(gòu)成性的，HSF1在細胞質(zhì)內(nèi)被Hsp90和其他抑制蛋白所控制，HSF1在S326上的核定位和磷酸化是HSF1活性的重要條件，因此核HSF1陽性與侵襲轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的預(yù)后不良相關(guān)。Akt可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及惡性程度有關(guān)，PI3K/Akt信號通路對乳腺癌極其重要，大部分乳腺癌有PI3K-AKT活性增強與不良的臨床結(jié)果相關(guān)，Akt介導(dǎo)的HSF1活化導(dǎo)致EMT，EMT是轉(zhuǎn)移過程中的早期步驟〔14〕。HSF1與Akt的陽性表達都與腫瘤直徑相關(guān)，這一結(jié)果為腫瘤的生長方式及轉(zhuǎn)移形式提供了有力證據(jù)。HSF1-Akt在TNBC中呈正相關(guān)，具有協(xié)同作用，目前關(guān)于HSF1-Akt在TNBC中的表達與臨床病理關(guān)系的研究尚少，本研究結(jié)果可以為進一步研究其機制提供有力的基礎(chǔ)，然而由于本研究采集的病例數(shù)還有一定的局限性，接下來將開展細胞水平的研究。