腫瘤微血管密度、血管內(nèi)皮生長因子與缺氧誘導(dǎo)因子-1α在腦膠質(zhì)瘤中表達及其臨床意義

李航 于佳龍 羅勇 蔣其俊 楊開華

(遵義市第一人民醫(yī)院遵義醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)外科，貴州 遵義 563000)

腦膠質(zhì)瘤是腦外科臨床中較為常見的腫瘤，依據(jù)WHO在2007年制定的分級標準，腦膠質(zhì)瘤按照嚴重程度可分為Ⅰ～Ⅳ級，其中Ⅰ～Ⅱ級為低級別腦膠質(zhì)瘤，Ⅲ～Ⅳ級為高級別腦膠質(zhì)瘤〔1〕。腦膠質(zhì)瘤在顱腦所有原發(fā)性腫瘤中，其發(fā)生率占比高達60%，以高發(fā)生率、高死亡率、高復(fù)發(fā)率及低治愈率為顯著特點，因此，對其發(fā)病機制及治療靶點的研究是臨床急需。腦膠質(zhì)瘤的出現(xiàn)、浸潤和發(fā)展均和新生血管的出現(xiàn)及增長存在密不可分的關(guān)系。低級別腦膠質(zhì)瘤患者的腫瘤血管并不豐富，新生血管的發(fā)育也較為成熟，因此其血容量和血流量的水平較低。而高級別腦膠質(zhì)瘤患者的腫瘤血管十分豐富，血管的發(fā)育情況較差，具有較高的管壁通透性，因此其血容量和血流量的水平較高〔2〕。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和腫瘤微血管密度(MVD)是腫瘤新生血管增殖的兩個重要生化指標〔3〕。VEGF的表達受多種因素的影響，其中缺氧是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強的誘導(dǎo)VEGF表達因素〔4〕。缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α是受癢調(diào)節(jié)的特異性亞單位〔5〕。VEGF和HIF-1α在腫瘤的新生血管生長過程中發(fā)揮了重要作用。本文擬探討MVD、VEGF與HIF-1α在腦膠質(zhì)瘤中的表達及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2012年1月至2019年1月遵義市第一人民醫(yī)院、遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及貴州航天醫(yī)院的腦膠質(zhì)瘤標本107例。依據(jù)神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標準，包括WHOⅠ級膠質(zhì)瘤6例，Ⅱ級膠質(zhì)瘤43例，Ⅲ級膠質(zhì)瘤37例，Ⅳ級21例。所有病例中男60例，女47例，平均年齡(60.5±4.2)歲。腫瘤類型包括：彌漫性星形細胞瘤25例、間變性星形細胞瘤9例、間變型星形細胞瘤22例、毛細胞星形細胞瘤6例、膠質(zhì)母細胞瘤18例、少突膠質(zhì)細胞瘤10例、室管膜瘤5例、髓母細胞瘤3例、間變性少突星形細胞瘤5例、少突星形細胞瘤3例、間變性室管膜瘤1例。取腦外科手術(shù)治療的正常腦組織標本20例為對照組。

1.2主要試劑 HIF-1α鼠抗人單克隆抗體由武漢博士德公司提供，VEGF兔抗人單克隆抗體由福州邁新公司提供。

1.3方法 (1)VEGF與HIF-1α檢測：標本經(jīng)常規(guī)操作，10%甲醛固定、石蠟包埋、切片(厚度4 μm)、蘇木素-伊紅(HE)染色、免疫組化(SP)染色及光鏡觀察。根據(jù)SP試劑盒的操作步驟進行免疫組化，一抗?jié)舛葹?∶500，分別與陽性對照片比較。磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗作陰性對照。閱片評分均由經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師操作，分別用高倍鏡和低倍鏡觀察全片，如細胞膜或細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒則VEGF及HIF-1α為陽性。每個切片隨機選擇5個高倍視野觀察，根據(jù)染色強度和陽性細胞數(shù)所占百分比計分。染色強度：無色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；陽性細胞數(shù)：<5%計0分，5%～25%計1分，26%～50%計2分，>50%計3分。最后計算染色強度與陽性細胞數(shù)得分的乘積，0分為(-)，1-3分為弱陽性(+)，4～5分為中度陽性()，5分以上為強陽性()。(2)MVD的檢測：提取出2張腫瘤病理組織切片，并予以石蠟包埋。其中取一張用于HE染色，對病理分級進行復(fù)核，剩下的一張進行CD34 SP染色。在檢測過程中嚴格遵循無菌流程及按照試劑盒說明書操作。若檢測結(jié)果為CD34呈陽性，則提示為微血管內(nèi)皮細胞已經(jīng)被染為棕色/棕黃色。依照血管計數(shù)法對MVD計數(shù)進行測定，首先在低倍鏡的直視下，擇取CD34陽性染色較多的熱點(5個)，其次再使用×200高倍鏡在各熱點范圍內(nèi)進行數(shù)目計量。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1腦膠質(zhì)瘤與正常腦組織VEGF表達比較 高級別腦膠質(zhì)瘤組VEGF表達水平明顯高于對照組和低級別腦膠質(zhì)瘤(χ2=78.000、30.927，P<0.05)；低級別腦膠質(zhì)瘤組中VEGF表達水平明顯高于對照組(χ2=19.223，P<0.05)，見表1。

2.2腦膠質(zhì)瘤與正常腦組織HIF-1α表達比較 高級別腦膠質(zhì)瘤組中HIF-1αF的表達水平高于對照組和低級別腦膠質(zhì)瘤(χ2=60.517，36.162，P<0.05)；低級別腦膠質(zhì)瘤組中HIF-1α表達水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.702，P<0.05)，見表1。

表1 腦膠質(zhì)瘤與正常腦組織VEGF、HIF-1α表達比較(n)

2.3腦膠質(zhì)瘤與正常腦組織微血管密度比較 高級別腦膠質(zhì)瘤組中MVD計數(shù)〔(46.02±8.22)個〕明顯高于對照組和低級別腦膠質(zhì)瘤〔(8.09±1.58)個、(24.01±8.11)個；t=20.422、13.884，P<0.05〕；低級別腦膠質(zhì)瘤組中MVD計數(shù)明顯高于對照組(t=8.675，P<0.05)。

2.4VEGF、HIF-1α表達的相關(guān)性 VEGF與HIF-1α在腦膠質(zhì)瘤中的表達呈正相關(guān)(r=0.315，P<0.05)。

3 討 論

異檸檬酸脫氫酶(IDH)突變與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切〔6〕。IDH1基因突變后，其催化反應(yīng)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥基戊二酸(HG)，2-HG對膠質(zhì)瘤干細胞分化具有抑制作用，2-HG還可上調(diào)VEGF的表達，加速腫瘤血管生成，促進腫瘤細胞增殖，并進一步促進HIF-1α的表達，使膠質(zhì)瘤細胞的增殖侵襲能力進一步增強，推進腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展〔7〕。通過對腦膠質(zhì)瘤分子病理機制的研究，找出與腦膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控因素具有十分重要的臨床意義。研究表明〔8〕，VEGF和HIF-1α是影響腫瘤細胞增殖功能和腫瘤細胞惡性侵襲的重要物質(zhì)。VEGF是一種促血管生長因子，VEGF特異性表達于血管內(nèi)皮細胞，功能強大，加速實體瘤周圍血管生成〔9〕。VEGF在腫瘤發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移進程中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔10〕。另外，腫瘤瘋狂生長所造成的缺氧環(huán)境是實體瘤的一大病理特征。特別是HIF-1α高表達的腦膠質(zhì)瘤壞死區(qū)域周邊的腫瘤細胞，由于持續(xù)的低氧環(huán)境刺激，往往表現(xiàn)明顯的遷移逃逸的趨勢，表明IDH1/2突變使腦膠質(zhì)瘤細胞的侵襲性顯著增強〔11〕。因此，IDH1突變所致的VEGF與HIF-1α表達上調(diào)是腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制之一〔12〕。本研究說明VEGF、HIF-1α與腫瘤的進展過程關(guān)系密切，隨著惡性程度的增加呈上升趨勢，與上述研究相符。

作為缺氧應(yīng)答調(diào)控因子，HIF-1α在多種惡性實體瘤中的表達升高，其可促進腫瘤新生血管的生成及產(chǎn)生增殖侵襲行為〔13〕。由于能量代謝必須要有氧的參與，而HIF-1α與氧的含量關(guān)系密切，因此，腫瘤細胞增殖侵襲的外在表現(xiàn)之一則為其對能量的追尋及不良環(huán)境的快速逃逸。文獻報道〔14〕，內(nèi)皮細胞的增殖、分化、相關(guān)基因的表達受VEGF的調(diào)控，VEGF可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生蛋白水解酶，對血管內(nèi)皮細胞的生成、移動有促進作用。VEGF為HIF-1α所調(diào)控的信號通路上的下游因子。惡性實體瘤內(nèi)的HIF-1α經(jīng)過調(diào)控編碼VEGF基因，使VEGF mRNA表達增加而上調(diào)VEGF水平，VEGF的濃度及活性增加導(dǎo)致新生血管形成加快，顯著改變腫瘤微環(huán)境〔15〕。有報道顯示，HIF-1α和VEGF表達與腫瘤臨床病理密切相關(guān)，隨著病理分期越晚、細胞分化程度及浸潤程度越深、轉(zhuǎn)移，HIF-1α和VEGF的表達越高，提示兩者與腫瘤增殖侵襲關(guān)系密切，針對兩者的特異性治療也是臨床考慮的重要方向〔16〕。本研究表明，高級別腦膠質(zhì)瘤HIF-1α和VEGF表達明顯高于低級別腦膠質(zhì)瘤，其原因可能為高級別腦膠質(zhì)瘤的生長過快，血管增生速度加快，同時相應(yīng)的能量代謝也加快，導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境缺氧，缺氧環(huán)境啟動腫瘤的自我保護機制，反饋性刺激HIF-1α的表達，進而導(dǎo)致VEGF的進一步升高。本文亦提示HIF-1α和VEGF可能對腫瘤的生長起協(xié)同作用。

另外，臨床對腫瘤新生血管數(shù)目進行檢測的常用指標為CD34標記的MVD計數(shù)，該指標敏感度高。有研究指出〔17〕，膠質(zhì)瘤病理級別越高，則腫瘤細胞的生長與增殖速度就越快，對微循環(huán)的需求相應(yīng)提高，導(dǎo)致局部供氧缺乏，上述病理改變進一步刺激新生血管的產(chǎn)生。本文提示MVD計數(shù)與腦膠質(zhì)瘤病理分級密切相關(guān)，可為腦膠質(zhì)瘤的病理分級提供數(shù)據(jù)參考。

綜上，HIF-1α和VEGF的表達上調(diào)預(yù)示腦膠質(zhì)瘤病理級別越高，微血管密度計數(shù)可快速反映腦膠質(zhì)瘤病理分級，三者可作為臨床判定腦膠質(zhì)瘤惡性程度的生物標志物。