ARL15基因多態(tài)性與延邊地區(qū)2型糖尿病及糖尿病腎病的相關(guān)性

張洪江 王偉杰 邵薇 凃影葉 杜飛 楊康鵑

(1延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 延吉 133000；2琿春市中醫(yī)院；3延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

糖尿病腎病(DN)是2型糖尿病(T2DM)最常見的微血管病變，我國T2DM患病人數(shù)居全球首位，DN的患病率也逐年上升。DN 發(fā)病機(jī)制也在廣泛研究中，但具體發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前普遍認(rèn)為DN 的發(fā)病機(jī)制可能與遺傳因素，如微小RNA(miRNA)〔1〕、DNA甲基化〔2〕、代謝紊亂〔脂聯(lián)素(PA)、多元醇通路〔3〕、蛋白激酶C〔4～6〕等〕 、血流動力學(xué)改變、炎癥反應(yīng)〔7，8〕、氧化應(yīng)激(活性氧類、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激)〔9～12〕等因素有關(guān)。因此，通過研究DN的發(fā)病機(jī)制，了解疾病的發(fā)生、發(fā)展，對疾病的早期干預(yù)及預(yù)防都具有重大意義。

PA與DN關(guān)系密切，研究表明在終末期腎病患者中，無論原發(fā)病是否為T2DM，均可引起PA水平升高〔13～17〕。另外，有研究表明〔18〕，早期DN可能與和肽素、PA水平升高有關(guān)。Richards等〔13〕在2009年全基因組水平上進(jìn)行的一項薈萃分析發(fā)現(xiàn)，ADP-核糖基化樣因子(ARL15)基因rs4311394位點的突變等位基因G與T2DM相關(guān)，且G等位基因與低水平的血漿脂聯(lián)素PA水平相關(guān)。Zhao等〔14〕發(fā)現(xiàn)胰島素刺激可以上調(diào)ARL15表達(dá)；當(dāng)ARL15過表達(dá)可以增強(qiáng)成C2C12 肌管中胰島素信號通路關(guān)鍵分子胰島素受體(IR)/胰島素受體底物(IRS)1/蛋白激酶B(AKT)的磷酸化，從而調(diào)節(jié)胰島素信號傳導(dǎo)途徑的磷酸化失調(diào)，抑制胰島素抵抗；因此提出ARL15是胰島素敏感的效應(yīng)分子。另外有研究發(fā)現(xiàn)〔15〕ARL15是T2DM的危險因素，與總膽固醇(TC)、PA、胰島素均具有相關(guān)性，ARL15通過增加AKT和AMPK下游代謝通路促使糖原、脂肪的合成。全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)揭示了ARL15多態(tài)性與T2DM的關(guān)聯(lián)，以微血管病變?yōu)樘卣鞯腄N是否與ARL15多態(tài)性相關(guān)仍有待于進(jìn)一步研究。目前國內(nèi)外尚缺乏ARL15基因多態(tài)性與DN相關(guān)性的研究，本研究將通過病例對照關(guān)聯(lián)分析對ARL15基因多態(tài)性位點rs35941、rs26770、rs4311394、rs645017與延邊地區(qū)朝鮮族和漢族T2DM及DN人群進(jìn)行相關(guān)性分析。通過連鎖不平衡(LD)及單倍型分析，探討ARL15基因多態(tài)性位點聯(lián)合作用與ARL15、PA、胰島素等相關(guān)性，另外分析ARL15與臨床實驗室指標(biāo)、PA、胰島素的相關(guān)性及對單純T2DM、DN的累加效應(yīng)，為T2DM及其并發(fā)癥DN的預(yù)防和靶向治療提供遺傳學(xué)數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對象 選取2016～2019年在延邊大學(xué)附屬醫(yī)院及琿春市中醫(yī)院單位體檢和就診患者751例。設(shè)計對照研究，將研究對象分為3組：葡萄糖耐量正常對照組(NGT組268例)朝鮮族131例，漢族137例；單純糖尿病組(T2DM組393例)朝鮮族188例，漢族205例；糖尿病腎病組(DN90例)朝鮮族35例，漢族55例，所有參與者對研究內(nèi)容知情同意。診斷標(biāo)準(zhǔn)參考糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)(1999年WHO標(biāo)準(zhǔn))及2014年美國腎臟病基金會對腎臟疾病控制的臨床實踐指南(NKF-KDOQI)頒布的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2SNP位點的選取 通過NCBI SNP數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)篩選ARL15基因SNP，其最小等位基因頻率(MAF)在1 000 Genomes研究東亞人群中大于0.05。本研究納入4個ARL15基因SNP：rs35941、rs26770、rs4311394、rs6450176。

1.3實驗室指標(biāo)檢測與基因組DNA的提取 收集所有參與者性別、年齡、血壓、體重指數(shù)(BMI)。清晨抽取空腹外周靜脈血于2 ml置于促凝管中，3 000 r/min離心10 min并分離血清，采用實驗室生化常規(guī)儀器檢測空腹血糖(FPG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、TC、三酰甘油(TG)。采取0.5 ml全血于二氨基聯(lián)苯胺(EDTA)-Na2抗凝管中，離心后將樣本保存于-80℃環(huán)境，所有樣本待同一時間提取基因組DNA。使用長春百奧生物技術(shù)有限公司AxyGene小量全血基因組DNA提取試劑盒，參照說明書提取全血DNA。

1.4引物的設(shè)計與合成 登錄NCBI查詢ARL15基因序列，利用Primer3軟件輔助設(shè)計引物序列(表1)，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.5PCR-LDR基因分型 (1)在15 μl體系中進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)，其中樣品DNA 1～2 μl，2×PCR mix 7.5 μl，混合引物2 μl，雙蒸水補(bǔ)至15 μl。多重PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 30 s，45個循環(huán)。(2)在7 μl體系中進(jìn)行PCR純化，其中PCR產(chǎn)物3 μl，ExoI 0.2 μl，F(xiàn)astAP 0.8 μl，ExoI緩沖液0.7 μl，雙蒸水補(bǔ)至7 μl；反應(yīng)參數(shù)：37℃ 15 min，80℃ 15 min。(3)延伸反應(yīng)，其中PCR產(chǎn)物2 μl，Snapshot Mix試劑1 μl，延伸引物1 μl，雙蒸水補(bǔ)至6 μl；反應(yīng)參數(shù)：96℃ 10 s，52℃ 5 s，60℃ 30 s，30個循環(huán)。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 運用SHEsis在線軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗、等位基因和基因型頻率分析、LD分析及單倍型分析。等位基因和基因型頻率分析使用χ2檢驗計算P值和風(fēng)險值(OR)。通過LD分析，計算D'值和r2值。D'=0，r2=0時，表示完全連鎖平衡；D'=1，r2=1時，表示完全連鎖不平衡狀態(tài)；|D'|≥0.8時表示存在強(qiáng)連鎖不平衡。使用SPSS25.0軟件進(jìn)行t檢驗。

表1 SNP位點及引物

2 結(jié) 果

2.1ARL15基因分型結(jié)果 根據(jù)NGT組4個SNP rs35941、rs26770、rs4311394和rs6450176的基因型進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，4個SNP的基因型頻率在NTG組中符合遺傳平衡(P>0.05)。見圖1～4。

圖1 ARL15基因rs26770G/G，A/G，A/A位點測序

圖2 ARL15基因rs4311394C/C，C/T，T/T位點測序

圖4 ARL15基因rs6450176A/A，A/G，G/G位點測序

2.2SNPs等位基因及基因型分布 4個SNP的等位基因和基因型頻率在延邊地區(qū)朝鮮族和漢族人群之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。將每組中朝鮮族和漢族人群視為同一群體，在隱性遺傳模型中，攜帶rs35941位點CC基因型頻率在DN組顯著高于T2DM組，增加T2DM患者發(fā)生DN的風(fēng)險(P=0.026)，且CC基因型在DN組和NGT組也具有增加風(fēng)險的趨勢(P=0.057)，但rs35941等位基因頻率在DN組與T2DM組、NGT組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。其他SNP的等位基因和基因型頻率在DN組與T2DM組、NGT組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖5、圖6。

R/RR：參考等位基因/野生純合子；RA：突變雜合子；A/AA：突變等位基因/突變純合子圖5 NGT組漢族和朝鮮族ARL15基因SNPs等位基因和基因型頻率

R，參考等位基因；A，突變等位基因；RR，野生純合子；RA，突變雜合子；AA， 突變純合子圖6 ARL15等位基因、基因型分析

2.3LD、單倍型及聯(lián)合基因型分析 rs431139與rs6450176之間存在較強(qiáng)連鎖不平衡(D'=0.897,r2=0.780)，其他位點之間未發(fā)現(xiàn)有明顯意義的連鎖不平衡(D'或 r2<0.8)。由于rs431139與rs6450176的等位基因和基因型頻率在3組之間不存在差異，故對4個SNP的單倍型進(jìn)行分析。見圖7。

位點間LD分析數(shù)值以D'-r2表示圖7 SNP位點LD分析

ARL15基因4個SNP僅rs35941位點CC基因型在隱性遺傳模型中顯示與DN相關(guān)?？紤]多基因遺傳病具有微效基因累加效應(yīng)特點，對單倍型和聯(lián)合基因型與疾病進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。在單倍型分析中，僅對等位基因頻率大于0.01的單倍型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，相對于NGT組和T2DM組，單倍型CCGA(rs35941-rs26770-rs4311394-rs6450176)與高風(fēng)險DN相關(guān)(P<0.05)。相對于T2DM組，單倍型CTAG(rs35941-rs26770-rs4311394-rs6450176)與高風(fēng)險DN相關(guān)(P<0.05)。見表2。

表2 單倍型、聯(lián)合基因型及其實驗室指標(biāo)分析[n(%)]

隨后，聯(lián)合4個SNP的基因型，對該陽性單倍型的基因型進(jìn)行分析，基因型頻率下限為0.01。結(jié)果顯示， CT-CT-AG-AG聯(lián)合基因型頻率在DN組中顯著小于NGT組(P<0.005)，同時，該聯(lián)合基因型頻率具有降低T2DM發(fā)生DN風(fēng)險的趨勢。另外發(fā)現(xiàn)FPG和TG在T2DM組中顯著高于NGT組；HDL-C在NGT組顯著高于DN組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.005)。若將基因型頻率下限選為0.1%，與NGT組相比，CC-CC-AG-AG聯(lián)合基因型與降低T2DM風(fēng)險相關(guān)(P<0.005)；相反，與T2DM組相比，CC-CC-AG-AG聯(lián)合基因型與增加DN風(fēng)險相關(guān)(P<0.05)。分析該聯(lián)合基因型的實驗室檢測指標(biāo)后，發(fā)現(xiàn)TG和PA水平在NGT組和DN組有顯著差異。由于CC-CC-AG-AG聯(lián)合基因型在T2DM組的基因型頻率過低，僅有1例，無法排除假陽性，故未對其實驗室指標(biāo)進(jìn)行分析。

2.4ARL15與其他實驗室指標(biāo)的相關(guān)性 在DN患者中對ARL15與其他實驗室指標(biāo)進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)ARL15與PA有相關(guān)性(r=0.372，0.014)，與FPG、DBP、TC、TG、LDL-C、HDL-C、CRE、BUN、INS、IR無相關(guān)(r=0.061，-0.120、-0.031、-0.040、-0.073、0.149、-0.262、-0.234、-0.146、-0.050，P=0.697、0.443、0.844、0.799、0.643、0.341、0.090、0.131、0.349、0.751)。

3 討 論

T2DM是復(fù)雜的內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，發(fā)病機(jī)制與遺傳和環(huán)境因素有關(guān)，不同種族之間也存在差異。ARL15基因于2009年首次通過GWAS研究被發(fā)現(xiàn)作為T2DM相關(guān)風(fēng)險基因〔13〕。ARL15參與調(diào)節(jié)膜轉(zhuǎn)運、脂質(zhì)組成和胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，同時也參與炎癥反應(yīng)過程。PA是一種含量豐富的血漿蛋白，通過提高胰島素敏感性、改善胰島β細(xì)胞功能和脂肪酸β氧化，在 T2DM 發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。研究表明，ARL15基因的常見遺傳變異與血漿PA、胰島素、HDL-C濃度、肥胖和冠狀動脈粥樣硬化有關(guān)〔19～22〕。近期研究發(fā)現(xiàn)ARL15在脂肪細(xì)胞分化和PA分泌中著重要作用，且ARL15單倍體功能不全具有導(dǎo)致脂肪營養(yǎng)不良的可能性〔23〕。因此，ARL15多態(tài)性可能與外周血PA水平相關(guān)，影響PA的分泌，PA水平降低可能引發(fā)肥胖、T2DM等代謝性疾病的發(fā)生。

以往研究分析了ARL15、TCF7L2和PGC-1α 3個基因多個SNPs在延邊地區(qū)朝鮮族和漢族人群與T2DM和T2DM合并大血管病變的相關(guān)性。對ARL15基因單個SNP進(jìn)行分析時，其對T2DM的作用較小，累加其他基因位點后，可能增加罹患T2DM的風(fēng)險〔24～26〕。這些研究為本研究對T2DM合并微血管病變的探究奠定了基礎(chǔ)，也充分說明了多基因遺傳病具有微效基因累加效應(yīng)的特征。本研究首次報道了延邊地區(qū)朝鮮族和漢族人群ARL15基因多態(tài)性與T2DM和DN的關(guān)聯(lián)，分析了其單倍型及聯(lián)合基因型與DN的關(guān)聯(lián)，并進(jìn)一步探討了ARL15與其他實驗室指標(biāo)之間的相關(guān)性。

本實驗結(jié)果提示攜帶單倍型CCGA和CTAG人群會增加罹患DN的風(fēng)險，聯(lián)合基因型CT-CT-AG-AG和 CC-CC-AG-AG可能通過調(diào)節(jié)TG和PA水平，增加IR，誘發(fā)血脂紊亂，增加T2DM罹患DN的風(fēng)險。由于DN組患者例數(shù)較少且CC-CC-AG-AG基因型在T2DM組僅有1例，因此需要在更大的隊列中進(jìn)行驗證。總而言之，以上研究結(jié)果從分子遺傳學(xué)機(jī)制上，為探討T2DM及DN提供了一個新的研究方向和依據(jù)。