高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌相關(guān)驅(qū)動(dòng)基因的突變

嚴(yán)曉娣，史國(guó)振，毛旭華

1南通大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤放療科，江蘇 南通 226001；2江蘇大學(xué)附屬宜興醫(yī)院心胸外科，3檢驗(yàn)科，江蘇 無(wú)錫 214200

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一［1］。據(jù)中國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告，中國(guó)2015 年有429 萬(wàn)例肺癌新發(fā)病例，281 萬(wàn)例肺癌死亡病例［2-3］。肺癌患者中約80%為非小細(xì)胞肺癌（non?small?cell lung cancer，NSCLC），60%～70%的NSCLC患者首診時(shí)已處于中晚期［4］，失去了手術(shù)治療機(jī)會(huì)。近年來(lái)以表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）?酪氨酸激酶抑制劑（tyro?sine kinase inhibitor，TKI）為代表的靶向治療取得飛速發(fā)展。研究表明，EGFR、KRAS、BRAF、NRAS、PIK3CA 和Her?2 等基因的突變狀態(tài)與NSCLC患者TKI 靶向治療的療效、腫瘤轉(zhuǎn)移以及預(yù)后相關(guān)［5-7］。因此，全面準(zhǔn)確地檢測(cè)相關(guān)基因顯得尤為重要。

目前常用的基因檢測(cè)方法主要有Sanger 測(cè)序法、高通量測(cè)序技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、微滴式數(shù)字PCR 技術(shù)（droplet digital PCR，ddPCR）等。Sanger 測(cè)序法被認(rèn)為是基因檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其操作步驟繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、檢測(cè)靈敏度不高。高通量測(cè)序技術(shù)具有海量檢測(cè)分析能力，能夠一次檢測(cè)多個(gè)基因的多個(gè)突變位點(diǎn)序列，節(jié)省腫瘤樣本DNA。ddPCR 技術(shù)是一種新發(fā)展起來(lái)的檢測(cè)方法，其具有更高的精度和靈敏度，且可絕對(duì)定量。

本研究應(yīng)用個(gè)體化基因組測(cè)序（personal genome machine，PGM）平臺(tái)，對(duì)150 例NSCLC 患者EGFR、KRAS、BRAF、NRAS、Her?2 和PIK3CA 基因突變狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)并分析，同時(shí)采用Sanger 測(cè)序及ddPCR技術(shù)對(duì)150例NSCLC患者EGFR基因突變狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)并加以對(duì)比分析。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本

病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理證實(shí)為NSCLC；②年齡大于18歲；③有可測(cè)量病灶（CT測(cè)得長(zhǎng)徑≥10 mm）；④心電圖、血常規(guī)、肝腎功能、骨髓功能基本正常；⑤患者及家屬知情并同意。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：①造血功能嚴(yán)重障礙者，肝腎功能嚴(yán)重?fù)p害者；②精神病患者；③懷孕或哺乳期婦女。按照病例納入及排除標(biāo)準(zhǔn)收集江蘇大學(xué)附屬宜興醫(yī)院和南通大學(xué)附屬醫(yī)院2016 年5 月— 2018 年6 月就診患者160 例作為研究對(duì)象。腫瘤組織標(biāo)本來(lái)源于研究病例穿刺或術(shù)后福爾馬林固定石蠟包埋樣本。本研究所有患者均知情同意，并經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit 試劑盒（批號(hào)157050679，凱杰公司，德國(guó)），按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，提取DNA。采用Qubit?2.0 fluorometer dsD?NA HS assay Kit 試劑盒（批號(hào)1871944，賽默飛世爾公司，美國(guó)）檢測(cè)提取DNA 的濃度和純度。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的片段化程度。

1.2.2 高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)EGFR、KRAS、BRAF、NRAS、Her?2和PIK3CA基因突變

DNA 采用Agencourt?AMPureTMXP beads（貝克曼庫(kù)爾特公司，美國(guó)）進(jìn)行純化。采用肺癌文庫(kù)制備試劑盒（賽默飛世爾公司，美國(guó)），按照說(shuō)明書(shū)操作，進(jìn)行擴(kuò)增、片段化，連接接頭和條碼，從而獲得DNA 文庫(kù)。采用Ion PGM Template OT2 Reagents 200 試劑盒（批號(hào)4481107，賽默飛世爾公司，美國(guó)），按照說(shuō)明書(shū)操作，利用Ion OneTouch 儀器進(jìn)行油包水PCR 反應(yīng)，Ion OneTouch ES 儀器進(jìn)行模板富集。采用Ion PGMTMSequencing Supplies 200 v2 測(cè)序試劑盒（批號(hào)4482007，賽默飛世爾公司，美國(guó)），上機(jī)測(cè)序，要求測(cè)序平均深度＞1 000 倍，測(cè)序區(qū)域均一度＞95%。采用Iontorrent variant caller plugin v4.0軟件分析結(jié)果。

1.2.3 Sanger測(cè)序法檢測(cè)EGFR基因突變

運(yùn)用PCR儀擴(kuò)增EGFR 基因18～21外顯子目的片段，引物參考文獻(xiàn)［8］。采用Cycle?Pure Kit 純化試劑盒（批號(hào)D6492?02，Omega Biotek 公司，美國(guó)），按照說(shuō)明書(shū)操作純化PCR 產(chǎn)物。采用Big Dye Ter?minator v3.1 kit（批號(hào)1705129，賽默飛世爾公司，美國(guó)）進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，純化，運(yùn)用ABI 3500Dx 基因測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 ddPCR法檢測(cè)EGFR基因突變

采用美國(guó)Bio?Rad 公司QX200 Droplet Digital PCR 系統(tǒng)，按照商用試劑盒Prime PCRTMddPCRTMMutation Detection Assay Kit（批號(hào)1863107、1863103、1863104、1863105、1863106，美國(guó)Bio?Rad 公司）說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)EGFR基因18外顯子p.G719S，19外顯子p.E746_A750del，20 外顯子p.T790M，21 外顯子p.L858R 和p.L861Q 位點(diǎn)突變狀態(tài)。陽(yáng)性判定：“ch1+ch2?”區(qū)的點(diǎn)≥3個(gè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，定性資料組間比較采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高通量測(cè)序法檢測(cè)基因突變?cè)贜SCLC 患者中的分布

本研究入組160 例NSCLC 患者，提取其組織標(biāo)本DNA。經(jīng)檢測(cè)10例標(biāo)本DNA質(zhì)量不符合實(shí)驗(yàn)要求，對(duì)其余150 例標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。其中男87 例，女63例；年齡＜60歲57例，≥60歲93例；病理類型為腺癌109 例，鱗癌34 例，腺鱗癌2 例，其他5 例；高?中分化61例，低分化89例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期52例；Ⅲ～Ⅳ期98 例。150 例標(biāo)本進(jìn)行高通量測(cè)序檢測(cè)，結(jié)果顯示，EGFR、KRAS、BRAF、NRAS、Her?2 和PIK3CA基因突變檢出率分別為51.33%（77/150）、7.33%（11/150）、1.33%（2/150）、1.33%（2/150）、2.00%（3/150）和4.67%（7/150）。57例標(biāo)本未檢出任何基因突變，84例標(biāo)本檢出單個(gè)驅(qū)動(dòng)基因發(fā)生突變，9 例標(biāo)本檢出2 個(gè)及以上驅(qū)動(dòng)基因發(fā)生突變。

6 種驅(qū)動(dòng)基因中，EGFR 基因突變檢出率最高，77 例標(biāo)本共檢出86 個(gè)EGFR 基因突變，其中有9 例患者檢出EGFR 基因雙位點(diǎn)復(fù)合突變。EGFR 基因突變位點(diǎn)集中在EGFR 基因19 外顯子缺失突變和21 外顯子L858R 位點(diǎn)突變，分別占33.72%（29/86）和45.35%（39/86），具體結(jié)果見(jiàn)表1。KRAS 基因突變集中在12、13 密碼子，其中12 密碼子占91.67%（11/12），1例患者12密碼子檢出G12C和G12V兩個(gè)不同位點(diǎn)復(fù)合突變。2 例BRAF 基因突變分別為V600E 和L618F 位點(diǎn)突變。2 例NRAS 基因突變分別為G12D 和D33E 位點(diǎn)突變。3 例Her?2 基因突變均為P761H 位點(diǎn)突變。PIK3CA 基因突變分別為E542K、E545K 和H1047L 位點(diǎn)突變，其中1 例患者檢出E542K和E545K兩個(gè)不同位點(diǎn)復(fù)合突變，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2 高通量測(cè)序法、Sanger測(cè)序法和ddPCR法檢測(cè)EGFR基因突變的比較

150 例標(biāo)本采用金標(biāo)準(zhǔn)Sanger 測(cè)序法檢測(cè)EG?FR 基因突變，突變檢出率為38.67%（58/150），與高通量測(cè)序法突變檢出率［51.33%（77/150）］比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.862，P=0.027）。高通量測(cè)序法靈敏度為98.28%，特異度為78.26%。

150 例標(biāo)本采用ddPCR 法檢測(cè)EGFR 基因突變，突變檢出率為50.00%（75/150），與高通量測(cè)序法比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.053，P=0.818）。陽(yáng)性一致率為82.67%，陰性一致率80.00%，總一致率為81.33%。3種不同方法的具體比較見(jiàn)表3。

表1 高通量測(cè)序法檢測(cè)EGFR基因突變Table 1 EGFR mutations detected by high?throughput se?quencing

表2 高通量測(cè)序法檢測(cè)KRAS、BRAF、NRAS、Her?2 和PIK3CA 基因突變Table 2 KRAS，BRAF，NRAS，Her?2 and PIK3CA muta?tions detected by high?throughput sequencing

表3 Sanger測(cè)序法、ddPCR法和高通量測(cè)序法特點(diǎn)比較Table 3 The characteristics comparison of ddPCR，Sanger sequencing and high ? throughput se?quencing

3 討論

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，以其為技術(shù)基礎(chǔ)的基因檢測(cè)在NSCLC 診療中的應(yīng)用日益廣泛。本研究選擇了NSCLC診療中相關(guān)的6個(gè)驅(qū)動(dòng)基因進(jìn)行高通量測(cè)序檢測(cè)，并分析其在我國(guó)NSCLC患者中的變異情況。

EGFR 基因突變是NSCLC 最常見(jiàn)的突變基因，本研究EGFR 基因突變的檢出率為51.33%，與以往的研究報(bào)道相符［9-10］。檢出的EGFR 基因突變以常見(jiàn)的19 外顯子缺失突變和21 外顯子L858R 位點(diǎn)突變?yōu)橹鳎瑫r(shí)也檢測(cè)到罕見(jiàn)位點(diǎn)突變。文獻(xiàn)報(bào)道，EGFR 基因18外顯子G719S罕見(jiàn)位點(diǎn)突變對(duì)TKI治療敏感，但其敏感性不及常見(jiàn)突變，同時(shí)厄洛替尼比吉非替尼在罕見(jiàn)突變方面有更好的療效［11］。18外顯子E709X罕見(jiàn)位點(diǎn)突變與G719S罕見(jiàn)位點(diǎn)突變相比，敏感性更低［12］。21外顯子L861Q罕見(jiàn)位點(diǎn)突變同18 外顯子G719S 罕見(jiàn)位點(diǎn)突變一樣表現(xiàn)出不及常見(jiàn)突變的敏感性［12］。20 外顯子T790M 位點(diǎn)突變經(jīng)大量研究證實(shí)是耐藥位點(diǎn)［12，13］。本研究中有9例患者檢出EGFR 基因雙位點(diǎn)復(fù)合突變，有研究指出，罕見(jiàn)突變的復(fù)合突變其療效要優(yōu)于單一罕見(jiàn)突變［12，14］。本研究中尚有部分罕見(jiàn)突變未見(jiàn)報(bào)道或相關(guān)證據(jù)不足，還需進(jìn)一步研究。

本研究中KRAS基因突變檢出率與文獻(xiàn)報(bào)道相吻合［15］。文獻(xiàn)報(bào)道KRAS基因突變以G12C和G12V突變位點(diǎn)最為常見(jiàn)［15］，而本研究與之不同，G12D 位點(diǎn)突變檢出最多。Zer等［16］學(xué)者的研究表明，G12C/G12V 位點(diǎn)突變患者經(jīng)TKI治療后預(yù)后差，而G12D/G12S 位點(diǎn)突變患者可以從TKI 治療中獲益。本研究檢測(cè)到的2 例BRAF 基因突變，1 例為經(jīng)典的V600E 位點(diǎn)突變，另1 例為L(zhǎng)618F 位點(diǎn)罕見(jiàn)突變。研究表明，NRAS 基因突變?cè)贜SCLC 中的發(fā)生頻率極低，3 號(hào)外顯子上61 號(hào)密碼子突變最常見(jiàn)，其次是2 號(hào)外顯子上的12 號(hào)密碼子突變［17］。本研究檢出NRAS 基因12 號(hào)密碼子G12D 位點(diǎn)突變及D33E罕見(jiàn)位點(diǎn)突變，由于樣本量較小，并未檢出61 號(hào)密碼子突變。Song等［18］研究指出NSCLC中Her?2 基因突變以插入突變最為常見(jiàn)，其次為P761H 位點(diǎn)突變。本研究與之不同，檢出的3 例突變均為P761H位點(diǎn)突變，未檢出插入突變，具體原因還需進(jìn)一步分析。本研究中PIK3CA基因突變檢出率為4.67%，與此前的研究相符［19］。除1 例標(biāo)本檢出PIK3CA 基因2 個(gè)不同位點(diǎn)的復(fù)合突變外，其余6 例突變均和其他驅(qū)動(dòng)基因以復(fù)合突變的形式存在，該特征與Scheffler等［7］學(xué)者的研究一致。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤驅(qū)動(dòng)基因可以以復(fù)合突變的形式存在［17，20］，本研究也得到相同的結(jié)論，共發(fā)現(xiàn)9例標(biāo)本存在驅(qū)動(dòng)基因復(fù)合突變，這提示某些NSCLC 的形成可能不單是一個(gè)驅(qū)動(dòng)基因的作用，而是多個(gè)驅(qū)動(dòng)基因共同作用的結(jié)果。

本研究通過(guò)對(duì)EGFR 基因突變的檢測(cè)，分析比較了Sanger 測(cè)序法、ddPCR 法和高通量測(cè)序法3 種不同的方法。高通量測(cè)序法與基因檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)Sanger測(cè)序法相比較，EGFR基因突變檢出率大幅提升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高通量測(cè)序法檢測(cè)靈敏度明顯高于Sanger 測(cè)序法，但研究中發(fā)現(xiàn)1 例標(biāo)本Sanger測(cè)序法檢出19外顯子缺失突變，但高通量測(cè)序法卻并未檢出，猜測(cè)可能是高通量測(cè)序法生物信息學(xué)軟件分析結(jié)果時(shí)產(chǎn)生錯(cuò)誤。高通量測(cè)序法與新技術(shù)ddPCR 法檢測(cè)EGFR 基因突變，檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。理論上ddPCR法檢測(cè)EGFR基因突變應(yīng)有更高的突變檢出率，但實(shí)踐中ddPCR法商用檢測(cè)試劑盒僅能檢測(cè)少數(shù)已知的熱點(diǎn)突變，部分罕見(jiàn)和未知突變無(wú)法檢測(cè)，導(dǎo)致突變檢出率并不高。綜合來(lái)看，高通量測(cè)序法擁有更高的檢測(cè)通量和突變檢出率，并可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因，更適合應(yīng)用于NSCLC診療。Sanger測(cè)序法和ddPCR法可作為有益的補(bǔ)充。

雖然高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于NSCLC 診療過(guò)程中仍有諸多問(wèn)題亟待解決，但隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，持續(xù)降低成本，縮短檢測(cè)周期及提高準(zhǔn)確性，將更廣泛地應(yīng)用于腫瘤尤其是NSCLC的臨床診斷及個(gè)體化治療中。